流式細(xì)胞儀原理和一般用法

1、 Partec - Excellence in Flow CytometryContributions to New Developments in Medical Diagnosis and Microbiology德國(guó)德國(guó) Partec超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn) Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)流式細(xì)胞儀的原理流式細(xì)胞儀的原理流式細(xì)胞儀使用一般方法及技巧流式細(xì)胞儀使用一般方法及技巧 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞分析，又稱流式細(xì)胞術(shù)（flow

2、cytometry，F(xiàn)CM），是以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度，從而對(duì)細(xì)胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學(xué)性狀及功能狀態(tài)等進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的一種現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。他綜合了激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、半導(dǎo)體技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)等各門學(xué)科。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞分析，又稱流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM），是以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)

3、度，從而對(duì)細(xì)胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學(xué)性狀及功能狀態(tài)等進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的一種現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。他綜合了激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、半導(dǎo)體技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)等各門學(xué)科。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)特點(diǎn)：特點(diǎn)：（1 1）單細(xì)胞分析。）單細(xì)胞分析。（2 2）快速分析。）快速分析。（3 3）多參數(shù)相關(guān)測(cè)量。）多參數(shù)相關(guān)測(cè)量。（4 4）定性或定量分析細(xì)胞。）定性或定量分析細(xì)胞。（5 5）統(tǒng)計(jì)學(xué)意義明顯。）統(tǒng)計(jì)學(xué)意義明顯。 （6 6）分選。）分選。 Partec - Excellence in Flow Cy

4、tometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)熒熒 光光有些物質(zhì)，當(dāng)用光照射時(shí)，它吸收了該種波長(zhǎng)的光后還會(huì)發(fā)射出各種顏色和不同強(qiáng)度的光，而當(dāng)光停止照射后，這種發(fā)射的光也隨之消失，這種發(fā)射的光稱為熒光(fluorescence)。熒光的波長(zhǎng)比吸收光線的波長(zhǎng)要長(zhǎng)些。由于物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)不同，所吸收的光和所發(fā)射的熒光波長(zhǎng)也不同。被這些物質(zhì)吸收的光稱為激發(fā)光，產(chǎn)生的發(fā)射光即熒光。熒光的顏色多為紅、藍(lán)、綠或黃等。物質(zhì)的熒光有兩種，一種是自發(fā)性熒光，即組織在短波長(zhǎng)光照射下自行發(fā)射出的熒光。如，組織中的蛋白質(zhì)和脂類在紫外線照射下能發(fā)射出微弱的淡藍(lán)色熒光。另一種熒光是誘發(fā)熒光，即細(xì)胞與熒光色素結(jié)合后，經(jīng)一定波長(zhǎng)的光線照射后

5、發(fā)出的熒光。常用的是誘發(fā)熒光，能產(chǎn)生熒光的生物染色劑稱為熒光染料(或稱熒光色素)。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)熒光激發(fā)與發(fā)射原理熒光激發(fā)與發(fā)射原理能量級(jí)能量級(jí)激發(fā)激發(fā)激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)發(fā)射發(fā)射激光激光能量損失能量損失 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗原或抗體，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測(cè)細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。從而使形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)

6、記的熒光素，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光(如，黃、綠色或紅色等)，通過確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位來推斷細(xì)胞的信息，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。常用方法：?jiǎn)慰怪苯訕?biāo)記 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)嵌入性染料嵌入性染料如DAPI、赫斯特、PI等，直接與細(xì)胞內(nèi)的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的A-T堿基對(duì)結(jié)合，從而使細(xì)胞在激發(fā)光的照射下發(fā)特定波長(zhǎng)的光，通過判斷發(fā)射光的強(qiáng)弱來推算A-T堿基對(duì)的多少，從而得知DNA的倍性關(guān)系。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)

7、經(jīng)驗(yàn)細(xì)胞膜電位、離子、脂類探針細(xì)胞膜電位、離子、脂類探針現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)或開發(fā)出來了各種細(xì)胞膜電位、各類離子、pH值、脂類探針，運(yùn)用這些探針在流式細(xì)胞儀上可輕易檢測(cè)各種細(xì)胞功能，可實(shí)現(xiàn)一些意想不到的效果。詳細(xì)信息，見細(xì)胞探針公司網(wǎng)站： Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)與流式細(xì)胞儀相關(guān)的熒光術(shù)語與流式細(xì)胞儀相關(guān)的熒光術(shù)語MESF（Molecules of equivalent soluble fluorochrome）等量可溶性熒光分子：國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)單位，用來衡量熒光強(qiáng)度自發(fā)熒光：細(xì)胞或顆粒在激發(fā)照射下會(huì)發(fā)出各種波長(zhǎng)的熒光。白細(xì)胞自發(fā)熒光強(qiáng)度為6

8、501150MESF，血小板及其他顆粒自發(fā)熒光更低流式細(xì)胞儀精度：分析白細(xì)胞要求精度在600MESF以內(nèi)，分析其他細(xì)胞或顆粒需要更高的精度：200MESF以內(nèi) Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)常見熒光染料列表常見熒光染料列表染料名稱激發(fā)波長(zhǎng)（nm）最大發(fā)射波長(zhǎng)(nm)應(yīng)用抗抗體體FITC488530一般應(yīng)用PEARDI488/565575FITC及2重染色ECD488/565613多重免疫染色用PC5/PE-Cy5488/565/650670多重免疫染色用PC7/PE-Cy7488/565767多重免疫染色用Cy5633670多重免

9、疫染色用APC650660多重免疫染色用DNA/RNAPl488/5366171色染色體、DNA細(xì)胞周期、除去死細(xì)胞YOYO-l491509DNA細(xì)胞周期、除去死細(xì)胞CPO488530/670DNA(530)/RNA(670)、網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測(cè)7-AAD546647G-C特異性、DNA細(xì)胞周期、除去死細(xì)胞SYTO16488518活細(xì)胞染色SYTOX Green504523DNA細(xì)胞周期TO-PRO-3642661除去死細(xì)胞DAPI360DNA細(xì)胞周期 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)常見熒光染料列表常見熒光染料列表鈣鈣Fluo-3AA

10、MA506525細(xì)胞內(nèi)鈣離子的檢測(cè)Fura RedAAMA473670細(xì)胞內(nèi)鈣離子的檢測(cè)pHBCECF (AM)488535細(xì)胞內(nèi)pHSNARF-l (AM)488587A635細(xì)胞內(nèi)pH (pH6-9)酶酶Fluorecein495519與酶基質(zhì)結(jié)合后使用、檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)酶活性Rhodamine-110497520與酶基質(zhì)結(jié)合后使用、檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)酶活性其其它它CMFDA488530活細(xì)胞內(nèi)水平檢測(cè)、MDRRhodamine-123488530活細(xì)胞內(nèi)線粒體、MDREGFP488510基因表達(dá)DiOC2 (3)488530細(xì)胞膜電位DiBAC4 (3)493516細(xì)胞膜電位DCFH-DA4885

11、30細(xì)胞內(nèi)活性酶DHR505534細(xì)胞內(nèi)活性酶FDA488530活細(xì)胞染色Calcein AM496517活細(xì)胞染色、乙啡叮 同型二聚體-1的雙色檢測(cè)判斷細(xì)胞死活 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)常用熒光染料種類常用熒光染料種類488nm藍(lán)色激光激發(fā)： FITC(異硫氰酸熒光素）：綠色 530nm PE（藻紅蛋白）：橙黃色 575nm PE-Cy5（PE的衍生物）：紅色 665nm PerCP(多甲藻黃素葉綠素蛋白）：紅色675nm PI(碘化丙啶）：橙紅色 620nm637nm紅色激光激發(fā)： APC(別藻蘭蛋白）：紅色 665nm

12、 APC-Cy5(別藻蘭蛋白的衍生物）：深紅色 710nm365nm紫外光激發(fā)： DAPI（4，6-咪基-2聯(lián)苯吲哚）：藍(lán)色 455nm532nm綠色激光激發(fā)： PE（藻紅蛋白）：橙黃色 575nm PE-Dy647 （PE的衍生物）：紅色 647nm PE-Cy5（PE的衍生物）：紅色 665nm Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)流式細(xì)胞儀的原理概述流式細(xì)胞儀的原理概述流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer 簡(jiǎn)稱FCM）是一種自動(dòng)分析細(xì)胞的高端技術(shù)設(shè)備，其原理是懸浮在液體中的細(xì)胞一個(gè)個(gè)地依次通過測(cè)量區(qū)，當(dāng)每個(gè)細(xì)胞通過測(cè)量區(qū)并被激

13、發(fā)光照射時(shí)產(chǎn)生光信號(hào)，然后被光電倍增管（PMT）轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，這些信號(hào)可以代表熒光、普通光散射、光吸收或細(xì)胞的阻抗等。這些信號(hào)可以被測(cè)量、存貯、顯示，于是細(xì)胞的一系列重要的物理特征和生化特征就被快速地、大量地測(cè)定。上述特征可以是細(xì)胞的大小、活性，核酸的數(shù)量、酶、抗原等等。儀器還可以根據(jù)所規(guī)定的參量把指定的細(xì)胞亞群從整個(gè)群體中分選出來。廢液廢液檢測(cè)器檢測(cè)器&計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)器樣品樣品 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)流式細(xì)胞儀的原理工作原理流式細(xì)胞儀的原理工作原理待測(cè)細(xì)胞被制備成單個(gè)細(xì)胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后放入樣品管中，在氣體的壓

14、力下進(jìn)入流動(dòng)室。流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的約束下，細(xì)胞排成單列由流動(dòng)室的噴嘴噴出，成為細(xì)胞液柱。液柱與入射的激光束垂直相交，相交點(diǎn)稱為測(cè)量區(qū)。通過測(cè)量區(qū)的細(xì)胞被激發(fā)產(chǎn)生熒光。在與入射光束和液柱垂直的方向放置光學(xué)系統(tǒng)（透鏡、光闌，濾片和檢測(cè)器等）用以收集熒光信號(hào)。光電倍增管將收集的光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)再傳輸至計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)通過相應(yīng)的軟件將電信號(hào)模擬成圖像。流動(dòng)室(Flow Cuvette或 Flow Cell)是儀器核心部件，被測(cè)樣品在此與激光相交。流動(dòng)室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個(gè)孔徑為350250um的長(zhǎng)方形孔，供細(xì)胞單個(gè)流過，檢測(cè)區(qū)在該孔的中心，這種流動(dòng)室的光學(xué)特性良好，流速較慢,

15、因而細(xì)胞受照時(shí)間長(zhǎng)，可收集的細(xì)胞信號(hào)光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的檢測(cè)靈敏度和測(cè)量精度。流動(dòng)室內(nèi)充滿了鞘液,鞘液的作用是將樣品流環(huán)包。鞘液流是一種穩(wěn)定流動(dòng)的液體，操作人員無法隨意改變其流動(dòng)的速度,樣品流在鞘流的環(huán)包下形成流體動(dòng)力學(xué)聚焦，使樣品流不會(huì)脫離液流的軸線方向，結(jié)合樣品噴嘴的特殊結(jié)構(gòu)，從而保證每個(gè)細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時(shí)間相等，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞信息（散射光和熒光）。 超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)激光，激光，如：如：488nmFL2 PESSCFSC液路液路電子元件部分電子元件部分計(jì)算機(jī)計(jì)算機(jī)FL3 PerCP, Cy5 FL1 FITC光學(xué)接收器光學(xué)接收器 Partec - Excel

16、lence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)流式細(xì)胞儀的構(gòu)造流式細(xì)胞儀的構(gòu)造流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)激光光源及光束形成系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)（濾光片組）信號(hào)檢測(cè)與存儲(chǔ)系統(tǒng)顯示、分析系統(tǒng) Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)激激 光光提供單波長(zhǎng)、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照，是細(xì)胞微弱熒光快速分析的理想光源，這是因?yàn)橛捎诩?xì)胞的快速流動(dòng)，每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時(shí)間僅為微秒左右，每個(gè)細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，與被照射的時(shí)間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此要求細(xì)胞必須達(dá)到足夠的光照強(qiáng)度。激光光束在到達(dá)流動(dòng)室前，先經(jīng)過透鏡，將其聚焦，形成

17、幾何尺寸約即短軸稍大于細(xì)胞的直徑的光斑。這種橢園形光斑激光能量分布屬正態(tài)分布;為保證樣品中細(xì)胞是一個(gè)一個(gè)分別受到光照并且受照強(qiáng)度十分一致,須將樣本流與激光束正交且相交于激光能量分布峰值處,臺(tái)式機(jī)FCM的光路調(diào)節(jié)對(duì)用戶是封閉的，即安裝時(shí)由工程師調(diào)試完畢后,無需用戶作任何調(diào)節(jié), 所以用戶操作十分方便。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，它們分別將不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)送入到不同的電子探測(cè)器。在流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)中主要光學(xué)原件是濾光片，主要分為三類：長(zhǎng)通濾片 LP短通濾片

18、SP帶通濾片 BP Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)長(zhǎng)通濾片長(zhǎng)通濾片長(zhǎng)通濾片使特定波長(zhǎng)以上的光通過，特定波長(zhǎng)以下的不通過。如LP500濾片，將允許500 nm以上的光通過，而500 nm以下的光吸收或返回。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)短通濾片短通濾片與長(zhǎng)通濾片相反，特定波長(zhǎng)以下的光通過，特定波長(zhǎng)以上的光吸收或返回。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)帶通濾片帶通濾片帶通濾片可允許相當(dāng)窄的一波長(zhǎng)范圍內(nèi)光通過，

19、一般濾片上有兩個(gè)數(shù)，一個(gè)為允許通過波長(zhǎng)的中心值，另一為允許通過光波段的范圍。如BP 500 / 50表示其允許通過波長(zhǎng)范圍為475nm525nm。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)信號(hào)檢測(cè)與分析信號(hào)檢測(cè)與分析當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物，通過激光照射區(qū)時(shí)，受激光激發(fā)，產(chǎn)生代表細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，這些信號(hào)以細(xì)胞為中心，向空間360度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào), 下圖是以激發(fā)光光源波長(zhǎng)488nm為例的示意圖： Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)1.1.散射光信號(hào)

20、散射光信號(hào)：散射光分為前向角散射( FSC ，F(xiàn)orward Scatter ) 和側(cè)向角散射(SSC，Side Scatter)，散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)(如染色)，因此被稱為細(xì)胞的物理參數(shù)（或稱固有參數(shù)）。(1)前向角散射前向角散射：代表細(xì)胞體積大小，代表細(xì)胞體積大小，前向角散射與被測(cè)細(xì)胞的大小有關(guān)，確切說與細(xì)胞直徑的平方密切相關(guān)，通常在FCM應(yīng)用中，選取FSC作閾值，來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對(duì)被測(cè)細(xì)胞的干擾。(2)側(cè)向角散射側(cè)向角散射：代表細(xì)胞內(nèi)容物多少（或稱為密度），代表細(xì)胞內(nèi)容物多少（或稱為密度），側(cè)向角散射是指與激光束正交900方向的散射光信號(hào)，側(cè)向

21、散射光對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可提供有關(guān)細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。2.2.熒光信號(hào)：熒光信號(hào)：當(dāng)激光光束與細(xì)胞正交時(shí)，一般會(huì)產(chǎn)生兩種熒光信號(hào)。一種是細(xì)胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號(hào)，稱為細(xì)胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記細(xì)胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號(hào)，通過對(duì)這類熒光信號(hào)的檢測(cè)和定量分析就能了解所研究細(xì)胞參數(shù)的存在與定量。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)光電倍增管如何產(chǎn)生電壓脈沖信號(hào)光電倍增管如何產(chǎn)生電壓脈沖信號(hào)電壓脈沖電壓脈沖ttt電壓脈沖電壓脈沖電壓脈沖電壓脈沖1.2.3. Partec - E

22、xcellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)高度、寬度和面積高度、寬度和面積時(shí)間時(shí)間 (s)電壓電壓脈沖面積脈沖面積(A)脈沖高度脈沖高度 (H)脈沖寬度脈沖寬度(W)400 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)脈沖信號(hào)的寬度和面積通常用來辨別雙粘體細(xì)胞脈沖信號(hào)的寬度和面積通常用來辨別雙粘體細(xì)胞 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)閾閾 值值閾值用來定義能夠被光電倍增管識(shí)別的最小或最大信號(hào)強(qiáng)度，低于閾值下限或高于閾值上限的信號(hào)將不被光電倍增管識(shí)別，也

23、不在圖形中顯示。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)熒光信號(hào)的線性測(cè)量和對(duì)數(shù)測(cè)量熒光信號(hào)的線性測(cè)量和對(duì)數(shù)測(cè)量線性放大： 即放大器的輸出與輸入是線性關(guān)系，細(xì)胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量等的測(cè)量一般選用線性放大測(cè)量。對(duì)數(shù)放大： 即放大器的輸出成10倍關(guān)系，如果原來輸出是1，當(dāng)輸入增大到原來10倍時(shí)，輸出為2；當(dāng)輸入增大到原來100倍時(shí)輸出是3等等。在免疫學(xué)樣品中，細(xì)胞膜表面抗原的分布有時(shí)要差幾十倍甚至幾萬倍。如果用線性放大將無法在一張圖上清晰地將細(xì)胞陽性群、陰性群同時(shí)顯示出來。 。 Partec - Excellence in

24、Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)格式流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)格式FCS：幀校驗(yàn)序列（FCS）字段，通常為16位（2個(gè)字節(jié)長(zhǎng)），也可以為4個(gè)字節(jié)。軟件執(zhí)行中可以通過預(yù)先協(xié)議采用32位FCS來提高差錯(cuò)檢測(cè)效果。FCS 1.0 研發(fā)于1984年FCS 2.0 研發(fā)于1990年，兼容1.0格式FCS 3.0 研發(fā)于1997年，兼容前兩者 支持UNICODE文本 處理單個(gè)數(shù)據(jù)文件大于100MB Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)FCS文件結(jié)構(gòu)文件結(jié)構(gòu)存儲(chǔ)于3或4個(gè)片段中文件頭信息：用于鑒別FCS文件，包含鑒別文本文件片段的數(shù)

25、值。文本信息：描述樣品信息和狀態(tài)的某些數(shù)值。數(shù)據(jù)：在文本信息中存儲(chǔ)的數(shù)值的特殊格式。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)文件頭信息：文件頭信息：文本信息：文本信息： Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)參參 數(shù)數(shù)FSC/SSC/熒光：第一個(gè)細(xì)胞第一個(gè)細(xì)胞第二個(gè)細(xì)胞第二個(gè)細(xì)胞最后一個(gè)細(xì)胞最后一個(gè)細(xì)胞 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示的種類數(shù)據(jù)顯示的種類直方圖 散點(diǎn)圖 三維圖 Partec - Excellenc

26、e in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)直方圖直方圖（用于單參數(shù)分析）（用于單參數(shù)分析）橫坐標(biāo)，X軸表示光強(qiáng)度，強(qiáng)度高的光信號(hào)靠右側(cè)顯示?？v坐標(biāo)，Y軸表示數(shù)量累計(jì)，相同強(qiáng)度的光信號(hào)在同一橫坐標(biāo)點(diǎn)（通道）內(nèi)向Y軸方向累計(jì)。FITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFL1-FITCFITCFITC Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖（用于雙參數(shù)分析）（用于雙參數(shù)分析）橫坐標(biāo)，X軸表示光強(qiáng)度，強(qiáng)度高的光信號(hào)靠右側(cè)顯示?？v坐標(biāo)，Y軸表示光強(qiáng)度，強(qiáng)度高的光信號(hào)靠上側(cè)顯示。與X軸/Y軸平面900

27、垂直相交，Z軸表示數(shù)量累計(jì)，相同強(qiáng)度的光信號(hào)在同一橫/縱坐標(biāo)點(diǎn)（X/Y軸通道）內(nèi)向Z軸方向累計(jì)。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)什么是什么是Region？用戶在顯示的圖形中限定一個(gè)區(qū)域或范圍作為靶區(qū)域或范圍叫做Region。在同一張圖中可以設(shè)置多個(gè)Region。 使感興趣的簇獨(dú)立。 對(duì)Region使用顏色可更好地描述該范圍或區(qū)域。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)什么是什么是Gate？1.使用布爾數(shù)學(xué)體系的操作方法（邏輯學(xué)）定義一個(gè)或?qū)⒍鄠€(gè)Region進(jìn)行聯(lián)合叫做Gat

28、e。2.被定義的子集數(shù)據(jù)將被顯示。3.被選定的子集將被計(jì)算機(jī)計(jì)算數(shù)據(jù)和顯示狀態(tài)。4.解除噪音信號(hào)并可以最終被存儲(chǔ)在硬盤上。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)什么是什么是Mean？1.算術(shù)定義的平均值。2.幾何定義的平均值。假設(shè)樣品為V，數(shù)量為n，則：算術(shù)定義的平均值=（V1+V2+V3+Vn)/n幾何定義的平均值= Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)如何取平均值？如何取平均值？線性放大 對(duì)數(shù)放大 對(duì)數(shù)放大 算術(shù)平均值 算術(shù)平均值 幾何平均值（4*64+6*128+2*192

29、+1*256）/13 （4*10+6*100+2*1000+1*10000）/13 =128 =972.3 =1001310000e11000e2100e610e4 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)光譜交叉重疊與補(bǔ)償？光譜交叉重疊與補(bǔ)償？當(dāng)一種激光束激發(fā)兩種熒光染料而發(fā)射出兩種不同波長(zhǎng)的熒光時(shí)，這兩種發(fā)射光會(huì)出現(xiàn)光譜部分重疊的現(xiàn)象，從而造成檢測(cè)的準(zhǔn)確性下降，必須使用適當(dāng)?shù)臑V片或進(jìn)行電子補(bǔ)償來盡量減少光重疊對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。 FL-1PMTFL-2 PMTFL-1 -% FL-2FL-2 -% FL-1 Partec - Excellen

30、ce in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)未做補(bǔ)償 R4/R1=41% R3/R1=24.21% R2/R1=34.3%做補(bǔ)償后 R4/R1=41.04% R3/R1=24.75% R2/R1=34.22%補(bǔ)償，我們通常按照細(xì)胞聚集區(qū)的中心點(diǎn)來計(jì)算，但實(shí)際的原理是按細(xì)胞團(tuán)的位置來定的，也就是純粹按照計(jì)算得出的，比如上圖的R4細(xì)胞團(tuán)，它在X軸上的位置是0.3到1之間，在Y軸的位置是2到6之間，這團(tuán)細(xì)胞平均值在FL1,FL2中的分部坐標(biāo)為0.68,3.9;因此斜率為0.68/3.9=17.43，因此FL1的補(bǔ)償后平均值為FL1-17.43%FL2=0.68-17.43%*3.9=

31、0.0023，它的右側(cè)區(qū)域應(yīng)該在1-17.43%*3.9=0.32，左側(cè)區(qū)域應(yīng)該在0.3-17.43%*3.9=-3.79，因?yàn)槭秦?fù)數(shù)，就自動(dòng)歸為0.1了，如果是完全按照計(jì)算來做補(bǔ)償，圖形將很大一部分跑出了雙參數(shù)圖，也就是說無法得到我們滿意的圖形，但由于我們勾選了“Random Bias”，所有的圖形將重新被分配，就像上圖的Q1門中的顯示一樣。，我們通常按照細(xì)胞聚集區(qū)的中心點(diǎn)來計(jì)算，但實(shí)際的原理是按細(xì)胞團(tuán)的平均值來計(jì)算。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)FL1-未染色FL2-未染色FL1-染色FL2-未染色FL1-FITC CD3補(bǔ)償后補(bǔ)償后平均值平均值= 2.0 FL1-染色FL2-未染色 Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn) Partec - Excellence in Flow Cytometry超過41年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)上機(jī)檢測(cè)上機(jī)檢測(cè)樣本染色及溶血過程處理完后應(yīng)立即上機(jī)檢測(cè)打開流式細(xì)胞儀 (選擇進(jìn)行質(zhì)控程序）打開應(yīng)用軟件并選擇相應(yīng)的方案或新建方案加載或重新調(diào)節(jié)各參數(shù)上樣檢測(cè)流式細(xì)胞儀使用一般方法及技巧 Partec - Excellence in Flow Cy