頭孢噻肟和舒巴坦復(fù)方制劑體內(nèi)外抗菌活性研究

1、頭孢噻肟和舒巴坦復(fù)方制劑體內(nèi)外抗菌活性研究         09-08-27 08:34:00     編輯：studa20                       作者：楊文吉 邵振俊 曾云 羅剛 周黎明 【摘要】  目的 評(píng)價(jià)頭孢噻

2、肟鈉/舒巴坦鈉(CTX/SB，11，21，41，81，161)及單組分頭孢噻肟鈉(CTX)對(duì)13株產(chǎn)內(nèi)酰胺酶革蘭陰性菌體外抗菌作用，并與復(fù)方制劑頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(CPZ/SB 11)和哌拉西林鈉/三唑巴坦鈉(PIPC/TB 81)進(jìn)行比較，以及對(duì)產(chǎn)酶大腸埃希菌與銅綠假單胞菌感染小鼠體內(nèi)保護(hù)作用。方法 采用瓊脂二倍稀釋法測(cè)定CTX/SB(11，21，41，81，161)復(fù)方制劑對(duì)產(chǎn)內(nèi)酰胺酶革蘭陰性菌體外抗菌作用及對(duì)產(chǎn)酶大腸埃希菌與銅綠假單胞菌感染小鼠體內(nèi)保護(hù)作用；生物法測(cè)定內(nèi)酰胺酶對(duì)抗生素的相對(duì)水解率以及抑酶保護(hù)率，PCR擴(kuò)增并檢測(cè)了其耐藥酶的類型。結(jié)果 CTX/SB(11)的MICs較CT

3、X有不同程度的下降；各不同配比CTX/SB的相對(duì)水解率均顯著低于CTX單用(P<0.01)，CTX/SB (11)的相對(duì)水解率也顯著低于PIPC/TB(81)和CPZ/SB(11)(P<0.01)；CTX/SB(11)的抑酶保護(hù)率顯著低于CTX/SB(81，161)(P<0.01)，也低于CTX/SB(21，41)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體內(nèi)試驗(yàn)，CTX/SB(11)的ED50值較CTX有明顯下降。結(jié)論 體內(nèi)、外試驗(yàn)表明CTX/SB(11)抑酶效應(yīng)優(yōu)于其它配比，也優(yōu)于同類復(fù)方制劑CPZ/SB(11)及PIPC/TB(81)；因此，舒巴坦起到了增強(qiáng)頭孢噻肟對(duì)內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性和抑酶保護(hù)

4、作用。 【關(guān)鍵詞】  頭孢噻肟； 舒巴坦； 最低抑菌濃度； 生物法； 半數(shù)有效量    ABSTRACT  Objective  To evaluate the in vitro synergistic activity of cefotaxime/sulbactam (CTX/SB, 11, 21, 41, 81, 161) against 13 stains producing lactamases, and compare with cefotaxime, cefoperazone/sulbactam (CPZ/SB, 11)

5、and piperacillin/tazobactam (PIPC/TB, 81); as well as compare the in vivo antibacterial activity between cefotaxime and CTX/SB (11).  Methods  The minimal inhibitory concentrations were detected by the agar dilution method. The hydrolysis rate and the ability of enzyme inhibitor in protect

6、ing cefotaxime from hydrolyzing by lactamases were measured by biological method. The in vivo antibacterial activities of CTX/SB (11) and cefotaxime were detected on mice in experimental infection caused by P.aeruginosa 39 and E.coli 8.  Results  The relative rate of hydrolysis of each com

7、bination of CTX/SB was significantly lower than that of CTX alone (P<0.01). The relative rate of hydrolysis of CTX/SB (11) was also remarkably lower than CPZ/SB and PIPC/TB (P<0.01). The inhibition rate of lactamases of CTX/SB (11) was lower than that of CTX/SB (81, 161) (P<0.05); the ED50

8、value of CTX/SB (11) was also lower than that of cefotaxime.  Conclusion  In respect to the inhibition of lactamases, CTX/SB (11) was better than other combination of CTX/SB, and also CPZ/SB and PIPC/TB, therefore, the hydrolysis activity of lactamases was greatly improved by the combinati

9、on of compounds cefotaxime and sulbactam.    KEY WORDS  Cefotaxime;  Sulbactam;  Minimal inhibitory concentration (MIC);  Biological method;  ED50   頭孢噻肟(cefotaxime)屬第三代頭孢類抗生素，抗菌譜廣，作用強(qiáng)，能有效控制銅綠假單胞菌感染，在膽汁中濃度較高，由于臨床應(yīng)用廣泛，目前其對(duì)大多數(shù)超廣譜內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性差，使療效下降。舒巴坦(sulb

10、actam)為半合成內(nèi)酰胺酶抑制劑，其化學(xué)穩(wěn)定性優(yōu)于克拉維酸，抗菌譜廣，活性低，毒性低，對(duì)各種內(nèi)酰胺酶的抑制作用有差別，與內(nèi)酰胺類抗生素合用有明顯抗菌協(xié)同作用1。本文研究頭孢噻肟加入不同比例的舒巴坦，其拮抗內(nèi)酰胺酶對(duì)頭孢噻肟水解作用的強(qiáng)弱，抑酶增效作用，并與其它復(fù)方制劑頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉和哌拉西林鈉/三唑巴坦鈉進(jìn)行比較；同時(shí)也做了部分藥物的體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)。    1  材料與方法    1.1  菌株    本實(shí)驗(yàn)選用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)酰胺酶產(chǎn)酶菌3株，由本院藥理教研室保存。四川省腫瘤醫(yī)院臨床分離

11、的大腸埃希菌4株，銅綠假單胞菌6株。    1.2  藥物    注射用頭孢噻肟鈉(cefotaxime，CTX)，每瓶1.0g，批號(hào)20060401，含量94.0%；注射用舒巴坦鈉(sulbactam，SB)，每瓶0.25g，批號(hào)20050302，含量89.58%；注射用頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(cefoperazone/sulbactam，CPZ/SB)，每瓶2.0g，批號(hào)20060501，含量為頭孢哌酮鈉45.90%、舒巴坦鈉47.30%；注射用哌拉西林鈉/三唑巴坦鈉(piperacillin/tazobactam，PIP

12、C/TB，81)，每瓶2.25g，批號(hào)20050606，含量為哌拉西林鈉79.43%、三唑巴坦鈉9.96%，以上藥物均由成都奧科生物技術(shù)有限公司提供。注射用頭孢哌酮鈉(CPZ)批號(hào)60705701，珠海聯(lián)邦制藥股分有限公司中山分公司生產(chǎn)；注射用哌拉西林鈉(PIPC)批號(hào)6068853BI，齊魯制藥有限公司提供生產(chǎn)。    1.3  測(cè)酶方法及MIC判定標(biāo)準(zhǔn)2    首先用nitrocefin初篩試驗(yàn)菌是否產(chǎn)內(nèi)酰胺酶(由淺黃色變?yōu)榉奂t色即為內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性)，按CLSI(原NCCLS，2004)判斷標(biāo)準(zhǔn)，以頭孢噻肟MIC8mg/L

13、為敏感，MIC64mg/L為耐藥。ESBLs菌株按CLSI(2004)表型確證法進(jìn)行鑒定。    1.4  內(nèi)酰胺酶提取物的制備3    采用超聲波破碎法提取內(nèi)酰胺酶粗提液。取粗酶提取液少量加入少許nitrocefin工作液，由淺黃色變?yōu)榉奂t色即為內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性反應(yīng)2，4，分裝后于-70保存?zhèn)溆谩?#160;   1.5  生物法測(cè)定相對(duì)水解率及抑酶保護(hù)率5，6    采用瓊脂平皿測(cè)定酶水解率，指示菌為枯草桿菌芽胞懸液。培養(yǎng)基為抗生素培養(yǎng)基II號(hào)(pH6.6)。酶作用

14、抗生素底物為頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(CPZ/SB)、哌拉西林鈉/三唑巴坦鈉(PIPC/TB)、頭孢噻肟鈉(CTX)、頭孢噻肟鈉/舒巴坦鈉(CTX/SB 11、21、41、81、161)。將8種底物配制成終濃度為16g/ml，在3ml底物中加入20l 內(nèi)酰胺酶粗提液，混勻后置37水浴15min。按隨機(jī)表分別將待測(cè)樣品加入平皿的不銹鋼小杯中，37孵育1618h，測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出殘余抗生素的量，由下式計(jì)算酶水解百分率：    酶水解百分率=抗生素底物量-酶水解后殘余抗生素的量抗生素底物量×100%    抑酶保護(hù)率

15、(%)=無(wú)抑制劑時(shí)底物的水解率-抑制劑存在時(shí)底物的水解率無(wú)抑制劑時(shí)底物水解率×100%    1.6  PCR擴(kuò)增法檢測(cè)酶類型    引物設(shè)計(jì)是從網(wǎng)址的GenBank中找到銅綠假單胞菌的TEM、SHV和CTXM型酶的原序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，大連寶生物工程有限公司合成。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳，純化并測(cè)序。    1.7  體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)    (1)試驗(yàn)藥物和菌株  試驗(yàn)藥物來(lái)

16、源同上。試驗(yàn)菌株為大腸埃希菌1株，銅綠假單胞菌1株，均為產(chǎn)內(nèi)酰胺酶菌株，來(lái)源同體外試驗(yàn)。    (2)試驗(yàn)動(dòng)物  健康昆明種小鼠，體重1822g，雌、雄各半，由四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。    (3)實(shí)驗(yàn)方法7  將受試菌于LB肉湯中37隔夜培養(yǎng)，用0.5%滅菌干酵母粉進(jìn)行倍比稀釋，測(cè)定最小致死菌量(MLD)，用該菌量作為體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)的感染菌量。在預(yù)試驗(yàn)中確定小鼠感染受試菌后出現(xiàn)0到100%死亡的藥物劑量范圍，在該范圍內(nèi)將受試藥物設(shè)5個(gè)劑量，劑量組間距為10.7。將小鼠于試驗(yàn)前18h停食供水，按體重隨機(jī)分組，每

17、組12只，雌、雄各半，分別于腹腔感染試驗(yàn)菌液，每鼠0.5ml，感染后即刻和6h分別靜脈給予受試藥物(iv為0.2ml/20g小鼠)。給藥后觀察并記錄小鼠死亡數(shù)，連續(xù)觀察14d，根據(jù)小鼠死亡數(shù)，運(yùn)用NDST軟件計(jì)算半數(shù)有效量ED50值及其95%可信限。     09-08-27 08:34:00     編輯：studa20    1.8  統(tǒng)計(jì)方法    采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。    2  結(jié)果

18、60;   2.1  最低抑菌濃度    各抗生素對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度(MICs)見(jiàn)Tab.1。    2.2  相對(duì)水解率    內(nèi)酰胺酶對(duì)CPZ/SB、PIPC/TB、CTX、CTX/SB(11、21、41、81、161)的相對(duì)水解率見(jiàn)Tab.2。內(nèi)酰胺酶對(duì)不同配比的CTX/SB的相對(duì)水解率均顯著低于CTX單用(P<0.01)，同時(shí)各配比間隨著SB劑量的增加，相對(duì)水解率也逐漸降低；CTX/SB(11)的相對(duì)水解率明顯低于CPZ/SB(11)和PIPC/TB

19、 (81)(P<0.01)，其它配比也有降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2.3  抑酶保護(hù)率    酶抑制劑SB對(duì)內(nèi)酰胺酶水解CTX的抑酶保護(hù)作用見(jiàn)Tab.3。CTX/SB(11)的抑酶保護(hù)率顯著高于CTX/SB(81，161)(P<0.05)，也高于CTX/SB(21，41)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2.4  PCR結(jié)果    只擴(kuò)增出blaTEM等4株大腸埃希菌，無(wú)blaSHV和blaCTXM(Fig.1)。   

20、; 2.4  體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)    CTX/SB(11)和CTX的ED50值及95%的可信限結(jié)果見(jiàn)Tab.4。結(jié)果表明CTX/SB(11)對(duì)小鼠感染大腸埃希菌和銅綠假單胞菌有很好的保護(hù)作用。CTX/SB(11)對(duì)小鼠感染大腸埃希菌的ED50較CTX的ED50小(P<0.05)，對(duì)小鼠感染銅綠假單胞菌的ED50較CTX的ED50有明顯降低(P<0.01)。    3  討論    頭孢噻肟屬第三代頭孢菌素類抗生素，抗菌譜廣，作用強(qiáng)，對(duì)銅綠假單胞菌及厭氧菌有較強(qiáng)的作用，可用于危及

21、生命的敗血癥、腦膜炎、肺炎、骨髓炎及尿路嚴(yán)重感染的治療，能有效控制嚴(yán)重的銅綠假單胞菌感染，近年在臨床上得到大量應(yīng)用，致使耐藥菌株日益增多。細(xì)菌主要是通過(guò)產(chǎn)生內(nèi)酰胺酶耐藥的?？股嘏c酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用是一條治療產(chǎn)酶耐藥菌引起感染的有效途徑。近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)內(nèi)酰胺酶抑制劑(如克拉維酸、三唑巴坦和舒巴坦等)不僅對(duì)廣譜酶，而且對(duì)部分超廣譜酶也有抑酶作用8。    本文通過(guò)CTX、CTX/SB等抗生素體外抗菌作用、酶穩(wěn)定性試驗(yàn)研究和體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)，初步證明了內(nèi)酰胺酶抑制劑SB可通過(guò)抑制內(nèi)酰胺酶一定程度保護(hù)CTX不被酶水解。試驗(yàn)結(jié)果顯示，內(nèi)酰胺酶對(duì)各配比的CTX/SB的平均相

22、對(duì)水解率已由100%降到6.1%42.7%之間，較CTX有顯著降低(P<0.01)；不同配比的CTX/SB對(duì)內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性在56.1%86.2%之間，說(shuō)明SB在保護(hù)CTX不被內(nèi)酰胺酶水解起到了重要作用；體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)也可以看出SB與CTX聯(lián)用的ED50較CTX有明顯的降低。本實(shí)驗(yàn)僅初步研究了酶抑制劑對(duì)內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性，而從MICs看，SB與CTX聯(lián)合后，其MICs值不都下降明顯，有些幾乎沒(méi)有變化，提示產(chǎn)內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌對(duì)頭孢噻肟耐藥主要機(jī)制之一，還存在其它耐藥機(jī)制，如：青霉素結(jié)合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)的改變，菌膜通透性的改變，細(xì)菌生物膜的形成以及主動(dòng)外排作用等，有待用分子生物學(xué)方法作進(jìn)一步研究。【參考文獻(xiàn)】  1 Arunoff S C, Jacobs M R, Johenning S, et al. Comparative activities of the lactamases inhibitor YTR830, sodium clavulanate, and sulbactam combined with amoxicillin or ampicillin J. Antimicrob Agents Chemother,1984,26(4):580584.2 Nati