各種緩沖液配方

1、三、核酸電泳相關試劑、緩沖液的配制方法50XTAE Buffer (pH 8.5)組份濃度 2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA配制量 1 L配制方法 1.稱量下列試劑，置于1 L燒杯中Tris242 gNa2EDTA2H2O37.2 g2向燒杯中加入約800 ml的去離子水，充分攪拌溶解3. 加入57.1 ml的乙酸，充分攪拌。4. 加去離子水將溶液定容至I L后，室溫保存。10XTBE Buffer (pH8.3)組份濃度 890 mM Tris-硼酸，20 mM EDTA配制量 1 L配制方法I.稱量下列試劑，置于I L燒杯中。Tris108 gNa2EDTA2H2O7.44

2、g硼酸55 g2. 向燒杯中加入約800 ml的去離子水，充分攪拌溶解3. 加去離子水將溶液定容至l L后，室溫保存。10>MOPS(3-嗎啉基丙磺酸)Buffer組份濃度 200 rnM MOPS，20 mM NaOAc, 10 mM EDTA 配制量 1 L配制方法 1.稱41.8 g MOPS，置于1 L燒杯中。2. 加約700 ml DEPC處理水，攪拌溶解3. 使用2 N NaOH調節(jié)pH值至7.0。4. 再向溶液中加入下列試劑。1 M NaOAc(DEPC 處理)20 ml0.5 M EDTA(pH8.0)(DEPC 處理)20 ml5. 用DEPC處理水將溶液定容至1 L6

3、. 用0.45 m濾膜過濾除去雜質。7. 室溫避光保存。注：溶液見光或高溫滅菌后會變黃。變黃時也可使用，但變黑時不要使用溴乙錠 (10 mg/ml)組份濃度配制量配制方法10 mg/ml溴乙錠100 ml1. 稱量1 g溴乙錠，加入到100 ml容器中。2. 加入去離子水100 ml，充分攪拌數h完全溶解溴乙錠。3. 將溶液轉移至棕色瓶中，室溫避光保存。4. 溴乙錠的工作濃度為0.5 g/ml。注意：溴乙錠是一種致癌物質，必須小心操作Agarose 凝膠配制方法 1.配制適量的電泳及制膠用的緩沖液（通常是0.5 XBE或1 XTAE）。2. 根椐制膠量及凝膠濃度，準確稱量瓊脂糖粉，加入適當的錐

4、形瓶 中。3. 加入一定量的電泳緩沖液（總液體量不宜超過錐形瓶的50%容 量）。注：用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須統(tǒng)一。4. 在錐形瓶的瓶封上保鮮膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波爐中 加熱熔化瓊脂糖。加熱過程中，當溶液沸騰后，請戴上防熱手套。 小心搖動錐形瓶。使瓊脂糖充分均勻熔化。此操作重復數次，直 至瓊脂糖完全熔化。必須注意，在微波爐中加熱時間不宜過長， 每次當溶液起泡沸騰時停止加熱，否則會引起溶液過熱暴沸，造 成瓊脂糖凝膠濃度不準，也會損壞微波爐。熔化瓊脂糖時，必須 保證瓊脂糖充分完全熔化，否則，會造成電泳圖像模糊不清。5. 使溶液冷卻至60C左右，如需要可在此時加入溴乙錠溶液 （

5、終濃 度0.5 g/ml）。并充分混勻。注：溴乙錠是一種致癌物質。使用含有溴乙錠的溶液時，請戴好 手套。6. 將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當位置處插上梳子。凝膠 厚度 一般在35 min之間。7. 在室溫下使膠凝固（大約30 min1 h），然后放置于電泳槽中進行 電泳。注：凝膠不立即使用時，請用保鮮膜將凝膠包好后在4C下保存，一般可保存25天。瓊脂糖凝膠濃度與線形 DNA的最佳分辨范圍瓊脂糖濃度最佳線形DNA分辨范圍（bp）0.5%1,00030,0000.7%80012,0001.0%50010,0001.2%4007,0001.5%2003,0002.0%502,0006 xLoa

6、ding Buffer(DNA 電泳用) 組份濃度30 mMEDTA36%(V/V)Glycerol0.05%(W/V)Xyle ne Cya no IFF0.05%(W/V)Bromophe nol Blue配制量 500 ml配制方法1.稱量下列試劑，置于500 ml燒杯中EDTA4.4gBromophe nol Blue250 mgXyle ne Cya nol FF250 mg2向燒杯中加入約200 ml的去離子水后，加熱攪拌充分溶解。3.加入180 ml的甘油(Glycerol)后，使用2 N NaOH調節(jié)pH值至7.04用去離子水定容至500 ml后，室溫保存。10 Loading

7、 Buffer (RNA 電泳用) 組份濃度10 mMEDTA50%(V/V)Glycerol0.25%(W/V)Xyle ne Cya no IFF0.25%(W/V)Bromophe nol Blue配制置 10 ml配制方法 1.稱量下列試劑，置于10 ml離心管中0.5 M EDTA(pH8.0)200 kBromophe nol Blue25 mgXyle ne Cya nol FF25 mg2.向離心管中加入約4 ml的DEPC處理水后，充分攪拌溶解3加入5 ml的甘油(Glycerol)后，充分混勻。4.用 DEPC處理水定容至10 ml后，室溫保存。四、核酸、蛋白質雜交用相關試

8、劑、緩沖液的配制方法20XSSC組份濃度 3.0 M NaCl，0.3 M Na3citrate2H2O(檸檬酸鈉) 配制量 1 L配制方法1.稱量下列試劑，置于I L燒杯中。NaCl175.3 gNa3citrate 2H2O88.2 g2.向燒杯中加入約800 ml的去離子水，充分攪拌溶解。3滴加14 N HCl，調節(jié)pH值至7.0后，加去離子水將溶液定容至1 L。4. 咼溫咼壓火菌后，室溫保存。20>SSPE Buffer組份濃度 3.0 M NaCl，0.2 M NaH2PO4，0.02 M EDTA 配制量 1.LNaCl175.3 gNaH2PO4 H2O27.6 g配制方法

9、 1.稱量下列試劑，置于I L燒杯中。Na2EDTA2H2O7.4 g2向燒杯中加入約800 ml的去離子水，充分攪拌溶解。3. 加 NaOH 調節(jié) pH 值至 7.4（約 6.5 ml 的 10 N NaOH）。4. 加去離子水將溶液定容至I L。5. 咼溫咼壓火菌后，室溫保存。50 X Denhardt '溶液組份濃1%(W/V)Ficoll 400（菲可400/水溶性聚蔗糖400）1%(W/V)Pol yviny Ipyrrolid one （聚維酮/聚乙烯吡咯烷酮）1%(W/V)BSA配制量 500 ml配制方法1.稱量下列試劑，置于500 ml燒杯中Flcoll 4005 g

10、PoLy vlny Ipyrrolldo ne5 gBSA5 g2. 加去離子水約400 ml,充分攪拌溶解3. 加去離子水將溶液定容至500 ml。4. 用0.45 m濾膜過濾后，分裝成每份25 ml5. -20C 保存。0.5 M 磷酸鹽 Buffer組份濃度 0.5 M Na2HPO4。配制量 I L配制方法 1稱量134 g NQHPO47H2O置于I L燒杯中。2. 加入約800 ml的去離子水充分攪拌溶解。3加入85%的H3PO4（濃磷酸）調節(jié)溶液pH值至7.24. 加去離子水定容至1 L。5. 咼溫咼壓火菌后，室溫保存。Salmon DNA （鮭魚精 DNA）組份濃度 10 mg

11、/ml Salm on DNA配制量 約100 ml配制方法 1.稱取鮭魚精DNA 2 g置于500 ml燒杯中，加入約200 ml的TE Buffer。2用磁力攪拌器室溫攪拌24 h,溶解后加入4 ml的5 M NaCl，使 其終濃度為0.1 M。3. 用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次。4. 回收水相溶液后，使用17號皮下注射針頭快速吸打溶液約 20次,以 切斷DNA。5. 加入2倍體積的預冷乙醇進行乙醇沉淀。6離心回收DNA后，溶解于100 ml的去離子水中。測定溶液的OD260 值。7. 計算溶液的DNA濃度后，稀釋DNA溶液至10 mg/ml。8. 煮沸10min后，分裝成小份（1 ml/

12、份）。-20C保存。9. 使用前在沸水浴中加熱5min后，迅速冰浴冷卻。DNA變性緩沖液組份濃度 1.5 M NaCl，0.5 M NaOH 配制量 1 L配制方法1.稱量下列試劑，置于I L燒杯中NaCl87.7 gNaOH20 g2向燒杯中加入約800 ml的去離子水，充分攪拌溶解3.加去離子水將溶液定容至l L后，室溫保存。預雜交液/雜交液 （DNA雜交用）組份濃6XSSC或 SSPE)5XDenhardt ' s0.5%(W/V)SDS100 g/mlSalm on DNA配制置 100 ml配制方法1.稱量下列試劑，置于200 ml燒杯中20XSSC(或 SSPE)30 ml

13、50 X Denhardt ' s10 ml10% SDS5 ml10 mg/ml Salm on DNA1 mldH2O54 ml2.充分混勻后，使用0.45 m濾膜濾去雜質后使用預雜交液/雜交液（RNA雜交用）6XSSC(或 SSPE)5XDen hardt 's0.5%(W/V)SDS100 g/mlSalm on DNA50%(V/V)Formamlde配制量 100 mL配制方法 1.稱量下列試劑，置于200 ml燒杯中20XSSC或 SSPE)30 ml50 x Denhardt ' s10 ml10% SDS5 ml10 mg/ml Salm on DNA

14、1 mlFormamide(甲 酰胺)50 mldH2O4 ml2.充分混勻后，使用0.45 m濾膜濾去雜質后使用膜轉移緩沖液(Western雜交用)組份濃度 39 mM Glycine , 48 mM Tris, 0.037%(W/V)SDS , 20%(V/V)甲醇 配制量 1 L配制方法1.稱量下列試劑，置于I L燒杯中。Glyc ine2.9 gTris5.8 gSDS0.37 g2. 向燒杯中加入約600 ml的去離子水，充分攪拌溶解。3. 加去離子水將溶液定溶至800 ml后，加入200 ml的甲醇4. 室溫保存。TBST Buffer(Western 雜交膜清洗液)組份濃度 20

15、 mM Tris-HCl，150 mM NaCI，0.05%(V/V)Tween 20 配制量 1 L配制方法 1.稱量下列試劑，置于I L燒杯中。NaCl8.8 g1 M Tris-HCI(pH8.0)20 ml2. 向燒杯中加入約800 ml的去離子水，充分攪拌溶解3. 加入0.5 ml Tween 20后充分混勻。4. 加去離子水將溶液定容至l L后，4C保存。封閉緩沖液(Western雜交用)組份濃度 5%(W/V)脫脂奶粉/TBST Buffer配制量 100 ml配制方法 1.稱5 g脫脂奶粉加入到100 ml TBST Buffer中，充分攪拌溶解 2.4C保存待用(本封閉液應該

16、現(xiàn)配現(xiàn)用)。五、實驗室常用培養(yǎng)基的配制方法Ampicillin(氨卡青霉素)(100 mg/ml)組份濃度 100 mg/ml Ampicillin配制量 50 ml配制方法 1.稱量5 g Ampicillin置于50 ml離心管中。2. 加入40 ml滅菌水，充分混合溶解后，定容至 50 ml3. 用0.22 m過濾膜過濾除菌。4. 小份分裝（1 ml/份）后,-20C保存IPTG（異丙基-B -D-硫代半乳糖苷）（24 mg/ml）組份濃度 24 mg/mL IPTG配制量 50 mL配制方法 1.稱1.2 g IPTG置于50 ml離心管中。2. 加入40 ml滅菌水，充分混合溶解后，

17、定容至 50 ml3用0 22 m過濾膜過濾除菌。4小份分裝（1 ml，份）后,-20T保存。X-Gal （20 mg/ml）組份濃度 20 mg/ml X-Gal配制量 50 ml配制方法 1.稱量I g X-Gal置于50 ml離心管中。2. 加入40 ml DMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解后，定容至50 ml3. 小份分裝（1 ml/份）后，-20C避光保存。I D拉差甘LB培養(yǎng)基組份濃度1%（W/V）Tryptone（胰蛋白胨），0.5%（W/V）Yeast Extract（酵母提取物），1%（W/V）NaCI配制量 1 L配制方法 1稱取下列試劑，置于l L燒杯中。Trypt o

18、ne10 gYeast Extract5 gNaCl10 g2. 加入約800 ml的去離子水，充分攪拌溶解。3. 滴加 5 N NaOH（約 0.2 m1），調節(jié) pH 值至 7.0。4. 加去離子水將培養(yǎng)基定容至1 L o5咼溫咼壓火菌后，4。C保存。LB/Amp培養(yǎng)基 組份濃度1%(W/V)Trypt one0.5%(W/V)Yeast Extract1%(W/V)NaCl0.1 mg/mlAmpicilli n配制量 1 L配制方法 1.稱取下列試劑，置于l L燒杯中Trypt one10 gYeast Extract5 gNaCl10 g2. 加入約800 ml的去離子水，充分攪拌溶

19、解。3. 滴加 5 N NaOH（約 0.2 mL）。調節(jié) pH 值至 7.0。4. 加去離子水將培養(yǎng)基疋谷至1 L o5. 咼溫咼壓火困后，冷卻至室溫。6. 加入 1 ml Ampicillin(100 mg/ml)后均勻混合。7.4°C保存。TO捋崇甘TB培養(yǎng)基1.2%(W/V)Tryptone2.4%(W/V)Yeast Extract0.4%(V/V)Glycerol17mMKH2PO472mMK2HPOa配制量 1.L配制方法 1配制磷酸鹽緩；中液(0.17 M KH2PO4, 0.72 M K2HP04)100 ml。 溶解2.31 g KH2PO4和254 g K2HP

20、O4于90 ml的去離子水中，攪拌溶解 后，加去離子水定容至100 ml,咼溫咼壓火菌2.稱取下列試劑，置于l L燒杯中。Trypt one12 gYeast Extract24 gGlycerol4 m3. 加入約800 ml的去離子水，充分攪拌溶解。4. 加去離子水將培養(yǎng)基定容至1 L后，咼溫咼壓火菌。5. 待溶液冷卻至60C以下時，；加入100 ml的上述滅菌磷酸鹽緩沖 液。6.4C保存。TB/Amp培養(yǎng)基組份濃度1.2%(W/V)Trypt one2.4%(W/V)Yeast Extract0.4%(V/V)Glycerol17 mMKH 2PO472 mMK2HPO40.1 mg/m

21、lAmpicilli n配制量 1 L配制方法1.配制磷酸鹽緩沖液(0.17 M KH 2PO4，0.72 M aHPO4)100 ml。溶解2.31 g KH2PO4,和 12.54g K2HPO4于90 ml的去離子水中，攪拌溶解后，加去離子水定容至 100 ml，咼溫咼壓火菌。2.稱取下列試劑，置于l L燒杯中Trypt one12 gYeast Extract24 gGlycerol4 ml3. 加入約800 ml的去離子水，充分攪拌溶解。4. 加去離子水將培養(yǎng)基定容至I L后，咼溫咼壓火菌。5. 待溶液冷卻至60C以下時，加入100 ml的上述滅菌磷酸鹽緩沖 液。6均勻混合后4C保存

22、。SOB培養(yǎng)基組份濃度2%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)Yeast Extract0.05%(W/V)NaCI2.5mMKCI10 mMMgCl 2配制量 1 L配制方法 1.配制9 250 mM KCI溶液。在90 ml的去離子水中溶解I.86 g KCI后，定容至100 ml。2.配制2 M MgCl2溶液。在90 ml去離子水中溶解19 g MgCl2后，定容至100 ml，高溫高 壓滅菌。3.稱取下列試劑，置于l L燒杯中Trypt one20 gYeast Extract5 gNaCI0.5 g4. 加入約800 ml的去離子水，充分攪拌溶解。5. 量取10 m1 25

23、0 mM KCl溶液，加入到燒杯中。6. 滴加5 N NaOH溶液（約0.2 m1），調節(jié)pH值至7.0。7. 加入去離子水將培養(yǎng)基定容至l L o8. 高溫高壓滅菌后，4C保存。9. 使用前加入5 ml滅菌的2 M MgCl 2溶液。SOC培養(yǎng)基組份濃度2%(W/V)Trypt one0.5%(W/V)Yeast Extract0.05%(W/V)NaCI2.5 mMKCI10 mMMgCl220 mMGlucose配制量 100 mL配制方法 1.配制l M Glucose溶液。將18 g Glucose溶于90 ml去離子水中，充分溶解后定容至100 ml。 用0.22何濾膜過濾除菌。2

24、.向I 00 ml SOB培養(yǎng)基中加入除菌的1 M Glucose溶液2 ml，均勻混合34C保存2 &T培養(yǎng)基組份濃度 1.6%(WV)Tryptone, 1%(W/V)Yeast Extract, 0.5%(W/V)NaCI配制量 1 L配制方法 1稱取下列試劑，置于l L燒杯中。Trypt one16 gYeast Extract10 gNaCl5 g2. 加入約800 ml的去離子水，充分攪拌溶解3. 滴加5 N NaOH,調節(jié)pH值至7.0。4. 加去離子水將培養(yǎng)基定谷至1 L o5. 咼溫咼壓火菌后，4C保存。 bx broth組份濃度2%(W/V)Tryptone , 0

25、.5%(W/V)Yeast Extract , o5%(W/V)MgSO 4 7H2O配制量 1 L配制方法 1.稱取下列試劑，置于l L燒杯中。Trypt one20 gYeast Extract5 gMgSO4 7H2O5 g2. 加入約800 ml的去離子水，充分攪拌溶解3. 滴加1 N KOH。調節(jié)pH值至7.5o4. 加去離子水將培養(yǎng)基定谷至1 L o5. 咼溫咼壓火菌后，4C保存。NZCYM培養(yǎng)基 組份濃度0.5%(WV)Yeast Extract0.1%(WV)1 Casamino Acid (酪蛋白氨基酸)1%(WV)NZ胺0.5%(WV)NaCl0.2%(WV)MgSO47H

26、o配制量 1 L配制方法 1.稱取下列試劑。置于l L燒杯中Yeast Extract5 gCasam ino Acid1 gNZ胺10 gNaCl5 gMgSO4 7Ho2 g2. 加入約800 ml的去離子水，充分攪拌溶解。3. 滴加 5 N NaOH（約 0.2 ml），調節(jié) pH 值至 7.0。4. 加去離子水將培養(yǎng)基定谷至1 L o5. 咼溫咼壓火菌后，4C保存。NZYM培養(yǎng)基組份濃度0.5%(WV)Yeast Extract1%(WV)NZ胺0.1%(WV)NaCl0.2%(WV)MgSO4 7Ho配制方法NZYM培養(yǎng)基除不含Casamino Acid外，其他成份與 NZCYM培養(yǎng)

27、 基相同。NZM培養(yǎng)基組份濃度1%(WV)NZ胺0.1%(WV)NaCl0.2%(WV)MgSO4 7Ho配制方法 NZM培養(yǎng)基除不含Yeast Extract酵母提取物）外，其他成份與NZYM 培養(yǎng)基相同。一般固體培養(yǎng)基的配制配制方法1.按照液體培養(yǎng)基配方準備好液體培養(yǎng)基，在高溫高壓滅菌前，加入下列試劑中的一種Agar（瓊脂；鋪制平板用）15 g/LAgar（瓊脂；配制頂層瓊脂用）7 g/LAgarose（瓊脂糖；鋪制平板用）15 g/LAgarose（瓊脂糖；配制頂層瓊脂用）7 g/L2. 高溫高壓滅菌后，戴上手套取出培養(yǎng)基，搖動容器使瓊脂或瓊脂 糖充分混勻（此時培養(yǎng)基溫度很高，小心燙傷）

28、。3. 待培養(yǎng)基冷卻至5060C時，加入熱不穩(wěn)定物質（如抗生素等）， 搖動容器充分混勻。4. 鋪制平板（3035 ml 培養(yǎng)基 /90 mm培養(yǎng)皿）。LB/Amp/X-Gal/LPTG 平板培 養(yǎng)基 組份濃度1%(W/V)Trypt one0.5%(W/V)Yeast Extract1%(W/V)NaCl0.1 mg/mlAmpicilli n0.024mg/mlIPTG0.04 mg/mlX-GaL1.5%(W/V)Agar配制量 1 L配制方法 1稱取下列試劑，置于I L燒杯中Tryptone10 gYeast Extract5 gNaCl10 g2. 加入約800 ml的去離子水，充分攪

29、拌溶解。3. 滴加 5 N NaOH(約 0.2 mL)，調節(jié) pH 值至 7.0。4. 加去離子水將培養(yǎng)基定容至1 L后，加入15 g Agar。5. 高溫高壓滅菌后，冷卻至 60C左右。6. 加入 1 ml Ampicillin(100 mg/ml)、1 ml IPTG(24 mg/ml)、2 ml X-Gal(20 mg/mL)后均勻混合。7. 鋪制平板(3035 ml/90 mm培養(yǎng)皿)。84C避光保存。TB/Amp/X-Gal/LPTG 平板培 養(yǎng)基 組份濃度1.2%(W/V)Trypt one2.4%(W/V)Yeast Extract0.4%(V/V)Glycerol17 mMK

30、H 2PO472 mMK2HPO40.1 mg/mlAmpicilli n0.024 mg/mlIPTG0.04mg/mLX-GaL1.5%(W/V)Agar配制量 1 L配制方法 1.配制磷酸鹽緩沖液(0.17 M KH2PO4, 0.72 M K2HPO4)100 ml。溶解2.31 g KH2PO4和12.54 g K2HPO4于90 ml的去離子水中，攪拌溶解后，加去離子水定容至 100 ml，咼溫咼壓火菌2. Trypt one12 gYeast Extract24 gGlycerol4 ml3. 加入約800 ml的去離子水，充分攪拌溶解。4. 加去離子水將培養(yǎng)基定容至1 L后。加

31、入l 5 g Agar。5. 高溫高壓滅菌后，冷卻至 60 C左右。6. 加入100 ml的上述滅菌磷酸鹽緩沖液、I ml Ampicillin (100mg/ml)、1 ml IPTG(24mg/mL)、2 ml X-Gal(20 mg/ml)后均勻 混合。7. 鋪制平板（3035 ml 培養(yǎng)基 /90 mm培養(yǎng)皿）。8 4 C避光保存。六、抗生素的貯存溶液及其工作濃度抗生素貯存液*1工作濃度濃度保存條件嚴緊型質粒松弛型質粒氨芐青霉素50 mg/ml（溶于水）-20 C20 g/ml60 g/ml羧芐青霉素50 mg/mL（溶于水）-20 C20 g/ml60 g/ml氯霉素34 mg/mL

32、（溶于乙醇）-20 C25 g/mll70 g/mL卡那霉素10 mg/mL（溶于水）-20 C10 g/ml50 g/ml鏈霉素10 mg/mL（溶于水）-20 C10 g/ml50 g/ml四環(huán)素*25 mg/mL（溶于乙醇）-20 C10 g/ml50 g/mL*1以水為溶劑的抗生素貯存液應通過 0.22 m濾器過濾除菌。以乙醇為溶劑的抗 生素溶液無須除菌處理。所有抗生素溶液均應保存于不透光的容器中。*2鎂離子是四環(huán)素的拮抗劑，四環(huán)素抗性菌的篩選應使用不含鎂鹽的培養(yǎng)基（如LB培養(yǎng)基）o七、SDS-PAGE 濃縮膠（5%Acrylamide）配方表各種組份名稱各種凝膠體積所對應的各種組份的

33、取樣量1 m12 m13 m14 ml5 ml6 m18 m110 mLH2O0.681.42.12.73.44.15.56.830%Acrylamide0.170.330.50.670.831.01.3171.0M Tris-HCI(pH6.8)0.130.250.380.50.630 751.0l.2510%SDS0.010.020.030.040.050 060.080.110%過硫酸銨0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED.0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01八、SDS-PAGE分離膠配方表各種組份名稱各種凝膠體積所對應的各種組份的取樣量5m110m115m120 ml 25m130m140m150 ml6%GelH2O30%Acrylamide1.5 M Tris-HCl(pH8.8)10%SDS10%過硫酸銨0TEM