急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)一、急性毒性一、急性毒性 急性毒性指人或動(dòng)物一次或急性毒性指人或動(dòng)物一次或24 h之內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物后，在短之內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物后，在短期內(nèi)所發(fā)生的毒性效應(yīng)，包括致死期內(nèi)所發(fā)生的毒性效應(yīng)，包括致死效應(yīng)。效應(yīng)。一次：指瞬間給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒，如經(jīng)一次：指瞬間給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒，如經(jīng)口、經(jīng)靜脈注射染毒。口、經(jīng)靜脈注射染毒。24 h之內(nèi)多次：指外源化學(xué)物毒性過(guò)之內(nèi)多次：指外源化學(xué)物毒性過(guò)低，需給予動(dòng)物較大劑量。低，需給予動(dòng)物較大劑量。 急性毒性效應(yīng)出現(xiàn)的快慢和毒性反應(yīng)的強(qiáng)急性毒性效應(yīng)出現(xiàn)的快慢和毒性反應(yīng)的強(qiáng)度與外源化學(xué)物的性質(zhì)和染毒劑量的大小度與外源化學(xué)物的性質(zhì)和染毒劑量的大小有關(guān)。有

2、關(guān)。 如：丙烯腈，過(guò)氧化二碳酸二環(huán)己酯如：丙烯腈，過(guò)氧化二碳酸二環(huán)己酯丙烯腈經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)丙烯腈經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膎評(píng)價(jià)丙烯腈的毒性作用，求出半數(shù)致死評(píng)價(jià)丙烯腈的毒性作用，求出半數(shù)致死量量LD50，并根據(jù)并根據(jù)LD50進(jìn)行急性毒性分級(jí)進(jìn)行急性毒性分級(jí)，n掌握實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組的方法和經(jīng)口灌掌握實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組的方法和經(jīng)口灌胃的技術(shù)。胃的技術(shù)。n觀察丙烯腈急性中毒癥狀；為后續(xù)試驗(yàn)觀察丙烯腈急性中毒癥狀；為后續(xù)試驗(yàn)提供依據(jù)；為毒理學(xué)機(jī)制研究提供線索。提供依據(jù)；為毒理學(xué)機(jī)制研究提供線索。器材與試劑器材與試劑n1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠（健康成年小鼠）n2、實(shí)驗(yàn)器材 灌胃針、注射器、吸管、

3、容量瓶、燒杯、滴管、電子天平、動(dòng)物體重秤、外科剪刀、鑷子 n3、實(shí)驗(yàn)試劑 丙烯腈、苦味酸酒精飽和液、伊紅染液實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法n1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇n2、劑量設(shè)計(jì)及隨機(jī)化分組n3、受試物的配制n4、染毒途徑的選擇n5、毒性反應(yīng)的觀察與LD50的計(jì)算n6、急性毒性的評(píng)價(jià) 1、物種和品系、物種和品系 對(duì)外源化學(xué)物毒性反應(yīng)與人近似易于飼養(yǎng)管理對(duì)外源化學(xué)物毒性反應(yīng)與人近似易于飼養(yǎng)管理 方便實(shí)驗(yàn)方便實(shí)驗(yàn) 操作易于獲得操作易于獲得 繁殖生育力強(qiáng)繁殖生育力強(qiáng) 數(shù)量較大能夠保障數(shù)量較大能夠保障 品系純化，價(jià)格低廉。品系純化，價(jià)格低廉。 一、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇2、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡與體重實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡與體重

4、動(dòng)動(dòng) 物物 大鼠大鼠 小鼠小鼠 豚鼠豚鼠 兔兔 犬犬 貓貓成年年齡（周）成年年齡（周） 3 2 2 34 34 34 體重（克）體重（克） 150 15 250 1.5kg 715kg 1kg壽命（年）壽命（年） 23 23 68 49 1520 1012n動(dòng)物數(shù)量：動(dòng)物數(shù)量：動(dòng)動(dòng)物物6組，組，1-5組為組為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組，6組為組為蒸餾水對(duì)照組蒸餾水對(duì)照組n性別性別：雌雄各半雌雄各半n年齡年齡：成年動(dòng)物：成年動(dòng)物n生理與健康狀況：生理與健康狀況：未產(chǎn)未孕者、健康未產(chǎn)未孕者、健康動(dòng)物動(dòng)物n實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的預(yù)檢實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的預(yù)檢n實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的給藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的給藥前禁食處理前禁食處理。3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般要求、實(shí)

5、驗(yàn)動(dòng)物的一般要求健康動(dòng)物標(biāo)志健康動(dòng)物標(biāo)志發(fā)育正常、體態(tài)豐滿、外觀無(wú)畸形；發(fā)育正常、體態(tài)豐滿、外觀無(wú)畸形；被毛濃密、貼順有光澤、不蓬亂；被毛濃密、貼順有光澤、不蓬亂；胸闊寬闊、脊柱不弓不彎；胸闊寬闊、脊柱不弓不彎；眼睛明亮；眼睛明亮；表皮無(wú)潰瘍、無(wú)結(jié)痂（注意尾巴）；表皮無(wú)潰瘍、無(wú)結(jié)痂（注意尾巴）；各天然孔干凈、無(wú)分泌物；各天然孔干凈、無(wú)分泌物；行動(dòng)靈活、反應(yīng)敏捷行動(dòng)靈活、反應(yīng)敏捷。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)記動(dòng)物的標(biāo)記染色法染色法 編號(hào)方法：小鼠頭部為編號(hào)方法：小鼠頭部為1 1號(hào)，順時(shí)號(hào)，順時(shí)針編號(hào)，用苦味酸編個(gè)位數(shù)，用針編號(hào)，用苦味酸編個(gè)位數(shù)，用伊紅編十位數(shù)伊紅編十位數(shù)。染色法染色法優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 簡(jiǎn)單方

6、便，不痛苦，無(wú)損傷。簡(jiǎn)單方便，不痛苦，無(wú)損傷。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，染色劑易褪色；時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，染色劑易褪色； 標(biāo)記容易模糊不清。標(biāo)記容易模糊不清。 劑量選擇及分組n劑量選擇劑量選擇 廣泛查閱文獻(xiàn)資料，估計(jì)毒性中值廣泛查閱文獻(xiàn)資料，估計(jì)毒性中值預(yù)試，求出待測(cè)化學(xué)物預(yù)試，求出待測(cè)化學(xué)物0 %100 %或或 10 %90 %的大致致死劑量范圍的大致致死劑量范圍設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的劑量和分組設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的劑量和分組 預(yù)實(shí)驗(yàn)：預(yù)實(shí)驗(yàn)：總的原則是先用少量動(dòng)物，以較大的劑總的原則是先用少量動(dòng)物，以較大的劑量間距染毒，求出粗略的致死劑量范圍，量間距染毒，求出粗略的致死劑量范圍，即確定受試動(dòng)物全部致死的最小劑量（

7、即確定受試動(dòng)物全部致死的最小劑量（b）和全部不致死的最大劑量（和全部不致死的最大劑量（a），即求出），即求出待測(cè)化學(xué)物待測(cè)化學(xué)物0 %100 %的大致致死劑的大致致死劑量范圍，然后在這個(gè)劑量范圍內(nèi)按幾何量范圍，然后在這個(gè)劑量范圍內(nèi)按幾何級(jí)數(shù)的間距設(shè)計(jì)級(jí)數(shù)的間距設(shè)計(jì)57個(gè)劑量組，組間劑個(gè)劑量組，組間劑量呈等比級(jí)數(shù)（量呈等比級(jí)數(shù)（r），其比值為。進(jìn)行正），其比值為。進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。式實(shí)驗(yàn)。通過(guò)預(yù)試，找出受試化學(xué)物引起動(dòng)物死亡通過(guò)預(yù)試，找出受試化學(xué)物引起動(dòng)物死亡的大致劑量范圍，以此為依據(jù)設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的劑量和的大致劑量范圍，以此為依據(jù)設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的劑量和分組。分組。按下式設(shè)計(jì)劑量組：按下式設(shè)計(jì)劑量組：1

8、nabr 式中：式中：rr相鄰兩組劑量的比值，一般為，相鄰兩組劑量的比值，一般為，bb最低全致死劑量量，最低全致死劑量量，aa最高不致死劑量，最高不致死劑量，nn設(shè)計(jì)的組數(shù)。設(shè)計(jì)的組數(shù)。分組恰當(dāng)與否也是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的條件之分組恰當(dāng)與否也是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的條件之一。因?yàn)榻M數(shù)過(guò)多，需要消耗較多的動(dòng)物，還可一。因?yàn)榻M數(shù)過(guò)多，需要消耗較多的動(dòng)物，還可能出現(xiàn)較大劑量組動(dòng)物死亡率低于較小劑量組；能出現(xiàn)較大劑量組動(dòng)物死亡率低于較小劑量組；組數(shù)過(guò)少，不能較精確求出組數(shù)過(guò)少，不能較精確求出LD50。根據(jù)公比根據(jù)公比(r)計(jì)算各組劑量計(jì)算各組劑量各組劑量分別為各組劑量分別為 第一組：第一組：a 第二組：第二

9、組：a r 第三組：第三組：a r2 第四組：第四組：a r3 第五組：第五組：a r4 第六組：第六組：a r5 隨機(jī)化分組隨機(jī)化分組 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)，從隨機(jī)數(shù)字表上任意橫將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)，從隨機(jī)數(shù)字表上任意橫行或縱行的任意數(shù)字開始，順序取下數(shù)字，行或縱行的任意數(shù)字開始，順序取下數(shù)字，標(biāo)于每個(gè)動(dòng)物號(hào)下，然后用計(jì)劃組數(shù)去除標(biāo)于每個(gè)動(dòng)物號(hào)下，然后用計(jì)劃組數(shù)去除隨機(jī)數(shù)字，所得余數(shù)即為所屬組別。隨機(jī)數(shù)字，所得余數(shù)即為所屬組別。以20只動(dòng)物的完全隨機(jī)分配為例只動(dòng)物的完全隨機(jī)分配為例動(dòng)物編號(hào)動(dòng)物編號(hào)1234567891011121314151617181920隨即數(shù)字隨即數(shù)字548380539075537

10、8934772095466954468676786除除4后余數(shù)后余數(shù)23012312130122300332所屬組別所屬組別二二三三四四一一二二三三一一二二 一一三三四四一一二二二二三三四四四四三三三三二二完全隨機(jī)分配后各組所屬動(dòng)物號(hào)完全隨機(jī)分配后各組所屬動(dòng)物號(hào) 組別組別動(dòng)物編號(hào)動(dòng)物編號(hào)一一47912二二1581320 14三三26101518 19四四311161720只動(dòng)物完全隨機(jī)分配的結(jié)果 組別組別動(dòng)物編號(hào)動(dòng)物編號(hào)一一4791219 二二1581314 三三2 6101518 四四311161720受試物的配制方法受試物的配制方法（1）受試化學(xué)物的量?。┦茉嚮瘜W(xué)物的量取：n固體受試物用稱

11、量法，液體受試物用稱量法或吸量法。固體受試物用稱量法，液體受試物用稱量法或吸量法。n稱量法：取一定量的受試物放入已知重量的容器內(nèi)，稱重，稱量法：取一定量的受試物放入已知重量的容器內(nèi)，稱重，定容，計(jì)算濃度定容，計(jì)算濃度mg/ml，備用。，備用。n吸量法：依設(shè)計(jì)劑量計(jì)算出應(yīng)吸取液態(tài)受試物的容積，加入吸量法：依設(shè)計(jì)劑量計(jì)算出應(yīng)吸取液態(tài)受試物的容積，加入容量瓶中，用溶劑加至刻度。容量瓶中，用溶劑加至刻度。吸量法吸量法，計(jì)算公式為：X式中： X應(yīng)吸取受試物的容積； A設(shè)計(jì)要求的受試物濃度（ mg/ml ）； V容量瓶容積（ml）； d受試化學(xué)物比重；A Vd1000受試物的配制方法（2）受試化學(xué)物的稀釋

12、）受試化學(xué)物的稀釋n等濃度稀釋法：n等容量稀釋法：等濃度稀釋法等濃度稀釋法 將受試物配制成一種濃度，不同劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單將受試物配制成一種濃度，不同劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位體重所給受試物的體積不同，劑量越高，所用的位體重所給受試物的體積不同，劑量越高，所用的體積越大；劑量越低，所用的體積越小。比如某受體積越大；劑量越低，所用的體積越小。比如某受試物的試驗(yàn)劑量分別為試物的試驗(yàn)劑量分別為100、200、400和和800mg/kg，受試物配制成，受試物配制成10 mg/ml，每組動(dòng)物，每組動(dòng)物每每10g體重分別給與、和體重分別給與、和0.8 ml。等容量稀釋法等容量稀釋法 將受試物配制成不同濃度，不同劑量

13、組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位將受試物配制成不同濃度，不同劑量組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位體重所給受試物的體積相同，劑量越大，受試化學(xué)物體重所給受試物的體積相同，劑量越大，受試化學(xué)物配制的濃度越高。上例中，若實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按容量灌胃配制的濃度越高。上例中，若實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按容量灌胃,則則應(yīng)配制成應(yīng)配制成4個(gè)不同濃度個(gè)不同濃度,即即5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml和和40mg/ml。染毒途徑的選擇染毒途徑的選擇n經(jīng)消化道染毒：經(jīng)口灌胃法經(jīng)消化道染毒：經(jīng)口灌胃法 采用專用小鼠灌胃針。采用專用小鼠灌胃針。 左手抓住動(dòng)物雙耳后至背部的皮膚，將動(dòng)物固定成垂左手抓住動(dòng)物雙耳后至背部的皮膚，將動(dòng)物固定成垂直體位，腹部面向操作。直體位，腹

14、部面向操作。 右手持注射器，將針頭由動(dòng)物口腔側(cè)插入，避牙齒，右手持注射器，將針頭由動(dòng)物口腔側(cè)插入，避牙齒，沿咽后壁緩緩滑人食管。若遇阻力，可輕輕上下滑動(dòng)探索，沿咽后壁緩緩滑人食管。若遇阻力，可輕輕上下滑動(dòng)探索，一旦感覺阻力消失，即深人至胃部。一旦感覺阻力消失，即深人至胃部。 如遇動(dòng)物掙扎，應(yīng)停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬?，千萬(wàn)不能強(qiáng)如遇動(dòng)物掙扎，應(yīng)停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬?，千萬(wàn)不能強(qiáng)行插入，以免穿破食，甚至誤入氣管，導(dǎo)致動(dòng)物行插入，以免穿破食，甚至誤入氣管，導(dǎo)致動(dòng)物 立即死亡。立即死亡。 觀察指標(biāo)觀察指標(biāo)n中毒癥狀：確定靶器官中毒癥狀：確定靶器官 行動(dòng)：不安定、多動(dòng)、發(fā)聲；行動(dòng)：不安定、多動(dòng)、發(fā)聲； 神經(jīng)系統(tǒng)反

15、應(yīng)：舉尾、振顫、痙攣、運(yùn)動(dòng)失神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)：舉尾、振顫、痙攣、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、姿態(tài)異常；調(diào)、姿態(tài)異常； 自主神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)：眼球突出、流涎、流淚、自主神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)：眼球突出、流涎、流淚、排尿、下瀉、豎毛、皮膚變色、呼吸。排尿、下瀉、豎毛、皮膚變色、呼吸。n死亡和死亡時(shí)間死亡和死亡時(shí)間 n病理學(xué)檢查及其他指標(biāo)病理學(xué)檢查及其他指標(biāo) LD50的計(jì)算（改良寇氏法）的計(jì)算（改良寇氏法）n當(dāng)急性毒性試驗(yàn)的最大劑量死亡率為當(dāng)急性毒性試驗(yàn)的最大劑量死亡率為100%，最小劑量的，最小劑量的死亡率為死亡率為0%；各組動(dòng)物數(shù)相等；各劑量組的組距等比或劑；各組動(dòng)物數(shù)相等；各劑量組的組距等比或劑量對(duì)數(shù)等差時(shí)，用下述基本公式計(jì)算量

16、對(duì)數(shù)等差時(shí)，用下述基本公式計(jì)算LD50：)5 . 0p( iXlogLDm150)4PP3p( iXlogLDnmm150npqiS50 x當(dāng)不含當(dāng)不含0%和和100%死亡率時(shí)，用下式計(jì)算死亡率時(shí)，用下式計(jì)算LD50：Xm最大劑量對(duì)數(shù)最大劑量對(duì)數(shù)P各劑量組死亡率各劑量組死亡率Pm最高死亡率最高死亡率q各組劑量存活率，各組劑量存活率，q=1-p以上各式中：以上各式中：i組距，即相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)劑量之差組距，即相鄰兩組劑量對(duì)數(shù)劑量之差Pn最低死亡率最低死亡率p各劑量組死亡率之和各劑量組死亡率之和n各組動(dòng)物數(shù)各組動(dòng)物數(shù)LD50的局限性的局限性n消耗動(dòng)物量大消耗動(dòng)物量大n獲得的信息有限獲得的信息有限n動(dòng)物死亡和觀察的癥狀不足以反應(yīng)生理學(xué)、動(dòng)物死亡和觀察的癥狀不足以反應(yīng)生理學(xué)、血液學(xué)和其它化驗(yàn)檢查所提供的毒性信息血液學(xué)和其它化驗(yàn)檢查所提供的毒性信息n有許多因素影響有許多因素影響LD50值的測(cè)定