水中大腸桿菌的檢測方法

1、.水中大腸桿菌群檢測方法多管發(fā)酵法NIEA E201.54B一、方法概要本方法系用以檢測水中革蘭氏染色陰性，不產(chǎn)生內(nèi)生孢子之桿狀好氧或兼性厭氧菌，且能在35 ± 1 、48 ± 3小時(shí)發(fā)酵乳糖并產(chǎn)生酸及氣體之大腸桿菌群（Coliform group）；在不同體積或不同稀釋度之水樣所產(chǎn)生之結(jié)果，以100 mL水中最大可能數(shù)（MPN/100 mL）表示 100 mL水中存在之大腸桿菌群數(shù)目。二、適用范圍本方法適用地面水體、地下水體、廢水、污水及水源水質(zhì)水樣中大腸桿菌群之檢驗(yàn)。三、干擾(一)水樣中含有抑制或促進(jìn)大腸桿菌群細(xì)菌生長之物質(zhì)。(二)檢測使用的玻璃器皿及設(shè)備含有抑制或促進(jìn)

2、大腸桿菌群細(xì)菌生長的物質(zhì)。四、設(shè)備(一)量筒：100至1000 mL之量筒。(二)吸管：有0.1刻度之10 mL滅菌玻璃吸管或市售無菌塑料吸管，或無菌微量吸管（micropipet）。(三)試管：大小約150 × 15 mm之試管或有蓋螺旋試管。(四)發(fā)酵管（fermentation tube）：大小約22 × 9 mm之玻璃管。(五)稀釋瓶：容量約100 mL可滅菌之硼硅玻璃制品。(六)錐形瓶：200至2000 mL之可滅菌硼硅玻璃制品。(七)采樣容器：容量120 mL以上無菌之硼硅玻璃瓶或無菌塑料有蓋容器，或市售無菌袋。(八)冰箱：溫度能保持在4 ± 2者。(

3、九)天平：待測物重量大于2 g時(shí)，須能精秤至0.01 g；待測物重量不大于2 g時(shí)，須能精秤至0.001 g。(十)培養(yǎng)箱：溫度能保持在35 ± 1者。(十一)高壓滅菌釜：溫度能維持在 121（壓力約15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）滅菌15分鐘以上者。(十二)高溫干熱烘箱：如用于玻璃器皿等用具之滅菌，溫度須能保持在 160達(dá)2小時(shí)或170達(dá)1小時(shí)以上者。(十三)接種環(huán)：為白金或鎳鉻合金制，適用于細(xì)菌接種或移植，亦可使用無菌塑料制品。(十四)pH計(jì)：精確度達(dá)0.1 pH單位。五、試劑(一)試劑水：蒸餾水或去離子水，導(dǎo)電度在 25 時(shí)小于2 mho / cm（S / cm）。

4、(二)培養(yǎng)基，應(yīng)使用市售商品化培養(yǎng)基。、硫酸月桂酸胰化蛋白胨培養(yǎng)基（Lauryl sulfate tryptose broth，簡稱LST） 1倍濃度LST培養(yǎng)基含有下列成份：胰化蛋白胨（Tryptose）20.0g乳糖（Lactose）5.0g氯化鈉（NaCl）5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4）2.75g磷酸二氫鉀（KH2PO4）2.75g硫酸月桂酸鈉（Sodium lauryl sulfate）0.1g試劑水1L配成2倍濃度（取71.2 g LST培養(yǎng)基粉末溶于1 L試劑水），完全溶解后，分取10 mL注入裝有倒置發(fā)酵管之試管內(nèi)，經(jīng)121滅菌15分鐘，冷卻后備用，滅菌后培養(yǎng)基之pH值應(yīng)在

5、6.8 ± 0.2。滅菌后培養(yǎng)基若未當(dāng)日使用，應(yīng)保存在4 ± 2，保存期限為14天。可根據(jù)檢驗(yàn)需求量，依配方配制培養(yǎng)基。、煌綠乳糖膽汁培養(yǎng)基（Brilliant green lactose bile broth，簡稱BGLB） 1公升的BGLB 培養(yǎng)基中含有下列成份：蛋白胨（Peptone）10.0g乳糖（Lactose）10.0g牛膽粉（Oxgall Powder）20.0g煌綠色試劑（Brilliant Green）0.0133g試劑水1L取40 g BGLB培養(yǎng)基粉末溶于1 L試劑水，完全溶解后，分取5至10 mL注入裝有倒置發(fā)酵管之試管內(nèi)，經(jīng)121滅菌15分鐘，冷卻

6、后備用，其pH值應(yīng)在7.2 ± 0.2。滅菌后培養(yǎng)基若未當(dāng)日使用，應(yīng)保存在4 ± 2，保存期限為14天?？筛鶕?jù)檢驗(yàn)需求量，依配方配制培養(yǎng)基。(三)無菌稀釋液、磷酸二氫鉀儲備溶液取3.4 g磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶于50 mL的試劑水中，俟完全溶解后，以1.0 N NaOH 溶液調(diào)節(jié)其pH值為7.2 ±0.1，然后加試劑水至100 mL，滅菌（過濾滅菌或121 高溫高壓滅菌15分鐘）后儲存于冰箱中備用。4 ± 2 下保存期限為3個(gè)月。、氯化鎂儲備溶液取8.1 g氯化鎂（MgCl26H2O），先溶于少量試劑水，俟完全溶解后，再加試劑水至全量為100 mL

7、，滅菌（過濾滅菌或121高溫高壓滅菌15分鐘）后，儲存于冰箱中備用。4 ± 2 下保存期限為3個(gè)月。、無菌稀釋液分別取10 mL氯化鎂儲備溶液和2.5 mL磷酸二氫鉀儲備溶液再加入試劑水至2,000 mL，混搖均勻后，分裝于稀釋瓶中，經(jīng)121滅菌15分鐘，作為無菌稀釋液備用。如欲用于水樣稀釋，分裝之無菌稀釋液滅菌后體積須為90 ± 2.0 mL。4 ± 2 下保存期限為3個(gè)月。六、采樣與保存 (一)盛裝水樣檢驗(yàn)微生物之容器，應(yīng)使用清潔并經(jīng)滅菌之玻璃瓶或無菌塑料容器或市售無菌采樣袋，且于采樣時(shí)應(yīng)避免受到污染。水樣若含有余氯時(shí)，無菌容器中應(yīng)加入適量之無菌硫代

8、硫酸鈉（采取加氯之廢水時(shí)，每100 mL水樣中加入0.1 mL、10%硫代硫酸鈉可還原15 mg/L余氯。采取含氯之飲用水水樣時(shí)，每100 mL之水樣如加入0.1 mL之3%硫代硫酸鈉，可中和之余氯量約為5 mg / L。）。(二)采樣前應(yīng)清潔手部，再行采水樣，所采水樣應(yīng)具有代表性。(三)運(yùn)送時(shí)水樣溫度應(yīng)維持在小于10 且不得凍結(jié)，而實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保存溫度應(yīng)維持在4 ± 2 。(四)水樣應(yīng)于采樣后24小時(shí)內(nèi)完成推定實(shí)驗(yàn)之水樣添加步驟（七、步驟(一)、），并置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(五)水樣量須以能做完所需檢驗(yàn)為度，但不得少于120 mL。七、步驟試驗(yàn)分兩階段進(jìn)行。首先進(jìn)行推定試驗(yàn)，若推定試驗(yàn)結(jié)果

9、為陽性反應(yīng)，則繼續(xù)進(jìn)行第二階段之確定試驗(yàn)，如結(jié)果仍是陽性反應(yīng)則顯示有大腸桿菌群存在。各試驗(yàn)步驟如下述：(一)推定試驗(yàn)、慎選發(fā)酵管中沒有氣泡且未污染之10 mL、2倍濃度LST試管。、水樣在進(jìn)行檢測或稀釋之前必須劇烈搖晃25次以上，以使樣品充分混搖均勻。、視水樣中微生物可能濃度范圍進(jìn)行水樣稀釋步驟，使用無菌吸管吸取10 mL水樣至90 mL無菌稀釋液中，形成10倍稀釋度水樣，混合均勻，而后自10倍稀釋度水樣以相同操作方式進(jìn)行一系列適當(dāng)之100、1000、10000倍等稀釋水樣，進(jìn)行稀釋步驟時(shí)，均需更換無菌稀釋吸管，水樣稀釋步驟如圖一所示（注1）。、以無菌吸管分別取各稀釋度10 mL水樣至內(nèi)含10

10、 mL 2倍濃度的LST試管中，每一稀釋度各作5支，小心混合均勻，混合后發(fā)酵管內(nèi)不可產(chǎn)生氣泡。、在35 ± 1培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 ± 3小時(shí)，觀察并記錄發(fā)酵情形，若有氣體產(chǎn)生則推定試驗(yàn)為陽性反應(yīng)，若無氣體產(chǎn)生則推定試驗(yàn)為陰性反應(yīng)，但若培養(yǎng)液呈混濁狀態(tài)，雖無產(chǎn)氣，亦應(yīng)進(jìn)行確定試驗(yàn)。(二)確定試驗(yàn)若推定試驗(yàn)之發(fā)酵管中有氣體或混濁產(chǎn)生時(shí)，則使用BGLB進(jìn)行確定試驗(yàn)：、慎選發(fā)酵管中沒有氣泡且未污染之BGLB試管。、利用無菌接種環(huán)自產(chǎn)生氣體以及混濁之LST培養(yǎng)基試管中，接種一圈培養(yǎng)液至BGLB培養(yǎng)基試管中。、在35 ± 1培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 ± 3小時(shí)。、在48 &#

11、177; 3小時(shí)內(nèi)，BGLB 培養(yǎng)基試管如有氣體產(chǎn)生，則確定試驗(yàn)為陽性反應(yīng)。八、結(jié)果處理(一)經(jīng)確定試驗(yàn)確認(rèn)BGLB試管為陽性反應(yīng)后，應(yīng)以100 mL水中最大可能數(shù)（MPN/100 mL）計(jì)算及記錄。5支發(fā)酵管連續(xù)三種稀釋度之MPN可查表一。(二)表一所示接種之水樣量為10 mL、1.0 mL 及0.1 mL，若所用之稀釋度有三種以上時(shí)，采用最具意義之三種稀釋度，查表后再計(jì)算100 mL水中大腸桿菌群最大可能數(shù)。稀釋度之選取方式如下：、先選取5管均呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度（此時(shí)稀釋度較低之各組試管必須全部呈陽性反應(yīng)），再選取下兩個(gè)稀釋度（如表二水樣別a）。、如果稀釋度最低的一組并非5管均呈陽性反

12、應(yīng)，則選取稀釋度最低的一組，再選取下兩個(gè)稀釋度（如表二水樣別b、c）。、如果依據(jù)上述原則（、及、）選取3個(gè)稀釋度后，下一稀釋度試管組仍有陽性反應(yīng)試管，則舍棄原先3組中稀釋度最低的一組，納入下一稀釋度的數(shù)據(jù)（如表二水樣別d）。、如果依據(jù)上述原則（、至、）選取3個(gè)稀釋度后，更高稀釋度之試管組仍有陽性反應(yīng)試管，則把更高稀釋度之陽性反應(yīng)試管數(shù)加至原先3組中稀釋度最高的一組（如表二水樣別e）。(三)100 mL水中大腸桿菌群最大可能數(shù)（MPN/100 mL）之計(jì)算公式如下：結(jié)果小于100時(shí)，以整數(shù)表示（小數(shù)字?jǐn)?shù)四舍五入），菌落數(shù)大于100以上時(shí)，只取兩位有效數(shù)字：例如110以1.1 × 102

13、表示，16,000以1.6 × 104表示。(四)檢測紀(jì)錄須注明采樣時(shí)間、培養(yǎng)起始及終了時(shí)間、培養(yǎng)基名稱、培養(yǎng)溫度及各稀釋度的數(shù)據(jù)等相關(guān)數(shù)據(jù)。九、質(zhì)量管理(一)微生物采樣人員及檢測人員應(yīng)具備微生物基本訓(xùn)練及知識。(二)每批次采樣時(shí)應(yīng)進(jìn)行運(yùn)送空白。(三)每批次或每10個(gè)水樣需進(jìn)行試劑空白實(shí)驗(yàn)。 (四)新購入之培養(yǎng)基，每批號均須以大腸桿菌群陽性控制菌株（如E. coli、Enterobacter aerogenes、Citrobacter freundii）進(jìn)行測試，以確保數(shù)據(jù)質(zhì)量。(五)若一季期間水樣均未檢出大腸桿菌群，則須以大腸桿菌群菌株進(jìn)行培養(yǎng)基測試，以確保數(shù)據(jù)質(zhì)量。(六

14、)本方法培養(yǎng)所得之細(xì)菌可能具有感染性，檢測后之培養(yǎng)基及器皿應(yīng)經(jīng)高溫高壓滅菌處理。十、精密度及準(zhǔn)確度略十一、參考數(shù)據(jù) (一)APHA. 2005. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21st Edition, Section 9221. American Public Health Association, Washington, D.C. (二)Difco & BBL Manual: Manual of Microbiological Culture Media. 2003.

15、BD Diagnostic Systems.注1：水樣如須稀釋，建議于稀釋后30分鐘內(nèi)完成檢測步驟，以免造成細(xì)菌死亡或增生，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖一水樣稀釋步驟表一三連續(xù)稀釋度（10 mL、1 mL、0.1 mL）五試管重復(fù)測試時(shí)，陽性結(jié)果組合之MPN指數(shù)及95%信賴區(qū)間陽性反應(yīng)組合MPN/100 mL 95%信賴區(qū)間陽性反應(yīng)組合MPN/100 mL 95%信賴區(qū)間下限上限下限上限0-0-0 <1.8 6.8 4-0-3 25 9.8 70 0-0-1 1.8 0.090 6.8 4-1-0 17 6.0 40 0-1-0 1.8 0.090 6.9 4-1-1 21 6.8 42 0-1-1

16、 3.6 0.70 10 4-1-2 26 9.8 70 0-2-0 3.7 0.70 10 4-1-3 31 10 70 0-2-1 5.5 1.8 15 4-2-0 22 6.8 50 0-3-0 5.6 1.8 15 4-2-1 26 9.8 70 1-0-0 2.0 0.10 10 4-2-2 32 10 70 1-0-1 4.0 0.70 10 4-2-3 38 14 100 1-0-2 6.0 1.8 15 4-3-0 27 9.9 70 1-1-0 4.0 0.71 12 4-3-1 33 10 70 1-1-1 6.1 1.8 15 4-3-2 39 14 100 1-1-2

17、8.1 3.4 22 4-4-0 34 14 100 1-2-0 6.1 1.8 15 4-4-1 40 14 100 1-2-1 8.2 3.4 22 4-4-2 47 15 120 1-3-0 8.3 3.4 22 4-5-0 41 14 100 1-3-1 10 3.5 22 4-5-1 48 15 120 1-4-0 10 3.5 22 5-0-0 23 6.8 70 2-0-0 4.5 0.79 15 5-0-1 31 10 70 2-0-1 6.8 1.8 15 5-0-2 43 14 100 2-0-2 9.1 3.4 22 5-0-3 58 22 150 2-1-0 6.8 1

18、.8 17 5-1-0 33 10 100 2-1-1 9.2 3.4 22 5-1-1 46 14 120 2-1-2 12 4.1 26 5-1-2 63 22 150 2-2-0 9.3 3.4 22 5-1-3 84 34 220 2-2-1 12 4.1 26 5-2-0 49 15 150 2-2-2 14 5.9 36 5-2-1 70 22 170 2-3-0 12 4.1 26 5-2-2 94 34 230 2-3-1 14 5.9 36 5-2-3 120 36 250 2-4-0 15 5.9 36 5-2-4 150 58 400 3-0-0 7.8 2.1 22 5-3-0 79 22 220 3-0-1 11 3.5 23 5-3-1 110 34 250 3-0-2 13 5.6 35 5-3-2 140 52 400 3-1-0 11 3.5 26 5-3-3 170 70 400 3-1-1 14 5.6 36 5-3-4 210 70 400 3-1-2 17 6.0 36 5-4-0 130 36 4