使用流式細胞儀檢測活細胞內(nèi)的ROS

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上使用流式細胞儀檢測活細胞內(nèi)的ROS基本原理：CM-H2DCFDA在細胞內(nèi)水解成DCFH , DCFH被胞內(nèi)的氧化劑氧化成高熒光強度的DCF，用于檢測ROS的生成。Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)是非極性的化學(xué)物質(zhì)能自由通透細胞膜。進入細胞后，被easterase去掉兩個乙基,形成具有極性的2,7- dichlorodihydrofluorescein(DCFH),保留在細胞內(nèi)。當(dāng)細胞產(chǎn)生H2O2與DCFH反應(yīng),使DCFH形成了2,7 dichlorodihydrofluorescein(DCF)，通過流式細胞

2、儀測定細胞內(nèi)DCF的熒光強度，即可對單個細胞為基礎(chǔ)的細胞內(nèi)ROS進行原位實時檢測，從而根據(jù)熒光強度直接反映細胞內(nèi)自由基的變化程度。（見下圖）主要試劑：1.PC-12細胞株2.DCFH-DA粉劑（sigma）3.5 mg溶解于721 ul 100%乙醇中（這時的濃度為10.0 mM），之后用DMEM培養(yǎng)液稀釋上述溶液10倍，配置成1.0 mM的儲存液。-20避光保存。3.A25-35（終濃度為30uM）4.AP（終濃度為10 uM）5其它如培養(yǎng)細胞常用試劑（DMEM高糖、胎牛血清、胰酶等），MTT操作方法：（1） 收集細胞：取對數(shù)生長期細胞收集細胞并調(diào)整細胞濃度至（110）106/mL（2） 分

3、別加入A、A+AP（六孔板），培養(yǎng)24小時（3） 裝載探針：加入終濃度為10uM的DCFH-DA，37 5 % CO2培養(yǎng)箱中靜置0.5 h，每隔3-5min混勻一下，使探針和細胞充分作用。（4）用無血清的培養(yǎng)基或溫暖的PBS液洗滌細胞3次，去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。（5）收獲各組細胞，上流失細胞儀檢測ROS。激發(fā)光488nm，發(fā)射光525nm（6）實驗分四組：PC-12(空白對照組)、PC-12+DCFH-DA(探針對照組)、PC-12+DCFH-DA+A25-35（實驗組）、PC-12+DCFH-DA+A25-35+AP（給藥組）結(jié)果分析：注意事項：（1） 處理過程絕對避光（紫外燈能不能開？）（2） 染料與細胞混合時間要充分（3） 探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內(nèi)的探針，否則會導(dǎo)致背景較高（4） 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差（5） 細胞應(yīng)保持良好的活性狀態(tài)。貼壁細胞培養(yǎng)時不應(yīng)超過瓶底面積的75%，懸浮細胞培養(yǎng)時其數(shù)目不能超過5105/mL；貼壁細胞在消化處理時要盡量溫和、快速，避免產(chǎn)生過多的細胞碎片（6） 使用流式細胞儀要確保側(cè)面的細胞分散開（在與染料混合和處理時）（7）流式細胞儀對細胞數(shù)目有一定的要求，一般為106，可以使用六孔板（8）雖然一般要求將陰性對照組細胞調(diào)節(jié)電壓至陰性置信區(qū)，但如果正常對照細胞DCFH