GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶表達下調(diào)對tau蛋白磷酸化的影響

1、GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶表達下調(diào)對tau蛋白磷酸化的影響【摘要】 以人OGlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶（OGT）基因為靶點，研究小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）對HEK293T細胞中OGT基因表達的抑制作用，以及這種抑制作用對tau蛋白磷酸化與糖基化修飾的影響。方法： 根據(jù)人OGT基因序列特點，設計高效且特異性強的siRNA。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA進入HEK293T細胞，通過實時PCR檢測siRNA對OGT基因表達的抑制。用蛋白免疫印跡法檢測tau蛋白糖基化與磷酸化修飾的變化。結(jié)果： 設計的siRNA能夠有效抑制OGT基因的表達，與空白組相比，抑制效率可達78.1

2、%左右。OGT基因表達的下調(diào)使tau蛋白糖基化水平下降，而磷酸化水平增高。結(jié)論： tau蛋白的糖基化負調(diào)節(jié)其磷酸化,葡萄糖攝入減少或代謝降低可能在阿爾茨海默爾病的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用。 【關鍵詞】 阿爾茨海默爾病 tau蛋白 OGlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶 RNA干擾 Abstract Objective: To investigate the inhibitory effect of small interference RNA(siRNA)targeting OGT gene on the alteration of tau phosphorylation and glycosylation l

3、evel in human being. Methods： The siRNANC and the siRNA targeting OGT gene were chemically synthesized and transfected into HEK293T cells via lipofectamine2000.Realtime PCR was employed to evaluate the efficacy of RNA interference. The level of tau phosphorylation and glycosylation were detected by

4、Western blot. Results： The designed siRNA could effectivly downregulate the OGT mRNA expression to 78.1% while compared with blank group. The level of the tau phosphorylation at various sites was significantly upregulated and the level of the tau glycosylation was downregulated with the inhibition o

5、f OGT gene expression. Conclusion： The modification of phosphorylation and glycosylation of tau protein indicated the apparent negative correlation, which probably was induced by deficient brain glucose uptake/metabolism in Alzheimers disease Key words Alzheimers disease; tau; OGT; RNA interfering 阿

6、爾茨海默爾?。ˋlzheimers disease, AD）的病理特征包括大腦局部尤其是海馬和皮層神經(jīng)元退行性病變，細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)和細胞外老年斑（senile plaque ,SP）沉積。其中NFT的數(shù)量和患者的癡呆程度呈明顯的正相關，被認為是AD患者神經(jīng)原退化的病理基礎1,2。NFT的主要成分是由異常過度磷酸化tau蛋白聚集而形成的雙螺旋絲（paired helical filaments，PHFs）。過度磷酸化的tau蛋白除失去了其刺激和促進微管組裝的功能外，還變成了毒性分子，可獵獲正常的微管相關蛋白，使得微管崩解，神經(jīng)細胞退

7、化，最終導致AD患者的認知功能受到嚴重的損害。 蛋白質(zhì)的修飾方式主要有磷酸化、糖基化、泛素化、經(jīng)典糖基化、硝基化和OGlcNAc糖基化。其中蛋白質(zhì)OGlcNAc 糖基化是發(fā)生在細胞質(zhì)與細胞核內(nèi)的一種廣泛動態(tài)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾現(xiàn)象。這種糖基化是單個N乙酰氨基葡萄糖(Nacetylglucosamine,GlcNAc)通過O糖苷鍵連接到絲氨酸或蘇氨酸(Ser/Thr)羥基上的。 在AD患者腦中，tau蛋白OGlcNAc糖基化水平明顯低于正常的老年人3。蛋白質(zhì)的OGlcNAc糖基化程度是OGlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶(OGT)和OGlcNAc糖苷酶（OGlcNAcase，OGA）共同作用的結(jié)果，OGT的作

8、用是催化GlcNAc連接到肽鏈的絲氨酸或蘇氨酸羥基上，UDPGlcNAc是它的供體底物，而OGA的作用是將GlcNAc從蛋白質(zhì)的羥基上去除。用OGlcNAc糖苷酶抑制劑處理體外培養(yǎng)的大鼠腦片和神經(jīng)細胞，以增加OGlcNAc糖基化的水平，則明顯抑制tau蛋白多個位點的磷酸化，提示tau的OGlcNAc糖基化與磷酸化呈明顯的負相關。本實驗擬通過RNA干擾的方法來降低HEK293T細胞內(nèi)OGT基因的表達水平，檢測tau蛋白多個位點磷酸化與糖基化的變化，從而證明以上的推測，為進一步探討AD的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 材 料 1.1.1 細胞、培養(yǎng)基與質(zhì)粒 HEK293T細胞株為本

9、實驗室保存。0.25% TrypsinEDTA，小牛血清，DMEM培養(yǎng)基，OptiMEM均為Invitrogen公司產(chǎn)品。pCI/tau441由日本物理化學研究所Takashima 教授惠贈。pTG19T載體購自上海捷瑞生物工程有限公司。 1.1.2 siRNA、引物及抗體 siRNA為上海吉瑪制藥技術有限公司合成。陰性對照（siRNANC）及5端標記了熒光素FAM的陰性對照（siRNANCFAM）購自上海吉瑪制藥技術有限公司。人OGT引物與內(nèi)參引物GAPDH由上海生物工程有限公司合成?？贵w：抗taupS396為美國Biosource Internatinal公司產(chǎn)品，RL2(Affinity

10、 Bioreagents, Golden, CO)用作OGlcNAc 糖基化的檢測，R134d(多克隆抗體,識別磷酸化和非磷酸化的tau蛋白)為美國紐約州立基礎研究所神經(jīng)化學系自行研制。辣根過氧化酶標記的羊抗鼠IgG為美國Jackson Immuno Reseach Laboratories產(chǎn)品。 1.1.3 其他材料 WizardTM Plus Miniprep System (Promega), SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)試劑盒(Takara),WizardSV Gel and PCR CleanUp System (Promega公司)

11、。Trizol試劑,LipofectamineTM 2000（Invitrogen公司）,First Strand cDNA Synthesis Kit(MBI)。PCR Kit(上海生工)，BioTraceTM PVDF (Pall公司)。ECL顯色試劑盒(Pierce公司)。質(zhì)粒抽提試劑盒：PureYieldTM Plasmid Midiprep System (Promega公司)。1.2 方 法 1.2.1 siRNA及引物的合成 根據(jù)Elbashir和Reynolds的siRNA設計原則結(jié)合siDirect在線設計系統(tǒng)設計、選取了1對siRNA 序列。OGTsiRNA： 正義鏈5GA

12、AGAAAGUUCGUGGCAAAdTdT3；陰性對照序列正義鏈 : 5UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT3 。每1OD干粉狀siRNA加入150 l的DEPC水即為20 mol/L的工作液。 1.2.2 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及抽提 pCI/tau441按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細胞, 在克隆并鑒定后大量擴增。用Promega公司質(zhì)粒中抽試劑盒抽提質(zhì)粒（根據(jù)說明書步驟操作）。測定D (260 nm)以確定質(zhì)粒DNA 濃度，-20 儲存?zhèn)溆谩?1.2.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HEK293T細胞接種于含10小牛血清的DMEM培養(yǎng)基（高糖），置37，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長到8090融合度，

13、胰酶消化，接種于12孔板中。轉(zhuǎn)染分空白對照組(對細胞不做任何處理)，轉(zhuǎn)染試劑對照組(加入與實驗組等量的轉(zhuǎn)染試劑，Mock組)，陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA,siRNANC 組)及實驗組(轉(zhuǎn)染OGTsiRNA)，同時轉(zhuǎn)染陰性對照FAM進行轉(zhuǎn)染效率檢測，轉(zhuǎn)染嚴格按照LipofectamineTM 2000試劑盒說明操作。 1.2.4 實時PCR分析 標準品制備：從HEK293T細胞中抽提總RNA(按Trizol說明書操作)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA(按Fermentas說明操作)，PCR擴增OGT和GAPDH片段。人OGT上游引物：5CGGGCTATCGAACTACAACCA3 ，下游：5CCCAT

14、ATTAGAGTAGGCATCAGCAAAG3(356 bp)；內(nèi)參引物GAPDH上游：5ACCACAGTCCATGCCATCAC3；下游：5TCCACCACCCTGTTGCTGTA3(452 bp)。OGT基因擴增與GAPDH基因一樣，在0.2 ml離心管中進行：依次加入17.25 l ddH2O，2.0 l cDNA模板，2.50 l 10×PCR 緩沖液，1.50 l MgCl2(25 mmol/L)，2.50 l dNTPmix(2.00 mmol/L)，0.50 l上游引物(10 mol/L)，0.50 l下游引物(10 mol/L)，0.25 l Taq DNA聚合酶(2

15、 U/l)。將上述混合液輕輕混勻，稍加離心：94，5 min94，40 s58 ，40 s72 ，35 s 30 個循環(huán)； 72，7 min; 4 。擴增完成行1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收PCR產(chǎn)物，與載體pTG19 T 連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5大腸埃希菌，藍白斑篩選得到陽性克隆，挑取陽性克隆過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒后交上海生物工程有限公司測序并進一步通過酶切鑒定確認結(jié)果。測定抽提質(zhì)粒的濃度，以10倍梯度稀釋制作標準品，-40 保存。轉(zhuǎn)染結(jié)束后24 h提取總RNA，紫外分光光度儀測定D(260 nm)D(280 nm)光密值比值。計算RNA含量，每個樣本取2 g反轉(zhuǎn)錄為cDNA(方法同上)。 實時PC

16、R檢測：將上述合成的cDNA模板與pTG19OGT及pTG19GAPDH一同擴增, 10l SYBRPremix Ex TaqTM(2×)，0.4 l PCR 上游引物(10 mol/L)， 0.4 l PCR 下游引物(10 mol/L)，2 l cDNA模板，7.2 l ddH2O。擴增程序：95 10 s ,95 5 s ,58 15 s , 72 20 s ,循環(huán)30次。在退火階段收集熒光信號。用Rotor Gene3000熒光實時定量PCR儀附帶的分析軟件對結(jié)果進行定量分析。OGT基因表達的計算方法：以同一份標本OGT拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù)表示OGT基因的表達水平，并設對

17、照組OGT拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù)為1，將各樣本拷貝數(shù)比值標準化, 定義為N OGT (標準化的OGT表達水平)，并以此值作圖。實驗重復3次，所得結(jié)果間比較采用單因素方差分析。 1.2.5 Western Blot分析 HEK293T細胞接種于12孔板, 分組同上。細胞生長至50融合度時進行轉(zhuǎn)染。因為HEK293T細胞內(nèi)無tau蛋白表達，所以在轉(zhuǎn)染siRNA的同時,每孔還將共轉(zhuǎn)染1.2 g的質(zhì)粒pCI/tau441。48 h后吸干凈培養(yǎng)基，用溫的及預冷的PBS液各洗1遍，加入預冷的細胞裂解液50 mmol/L TrisHCl(pH 7.4)，8.5%蔗糖，50 mmol/L NaF，1 mmo

18、l/L Na3VO4，0.1% Triton100，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，10 g/ml aprotinin，10 g/ml Leupeptin，10 g/ml pepstain，100 mmol/L OGlcNAc，冰上孵育15 min, 收集每孔細胞至1.5 ml的EP管內(nèi)，沸水中煮5 min，4，12 000×g離心15 min。取上清，用改良Folin酚法測量蛋白濃度。蛋白印跡分析按文獻3所述方法完成。 1.2.6 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行分析。各實驗組比較用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義

19、。 2 結(jié) 果 2.1 HEK293T細胞轉(zhuǎn)染效率檢測 用siRNANCFAM轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，24 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染了siRNANCFAM的細胞呈現(xiàn)綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率約為85%，見圖1。轉(zhuǎn)染效率計算：轉(zhuǎn)染效率=熒光陽性細胞/細胞總數(shù)。 2.2 OGTsiRNA對OGT基因mRNA水平影響 采用濃度為100 nmol/L的siRNA轉(zhuǎn)染HEK293T細胞。實時PCR結(jié)果顯示, OGTsiRNA片段可有效地降低HEK293T細胞中OGT的表達水平，與空白對照組相比沉默效果可達78.1%左右，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而Mock組，siRNANC

20、組與對照組相比，OGT表達無明顯下降，差異無統(tǒng)計學意義，結(jié)果見圖2。 2.3 Tau蛋白糖基化與磷酸化修飾的變化 細胞轉(zhuǎn)染48 h后，Western blot檢測總tau蛋白（磷酸化與非磷酸化的tau蛋白）及tau蛋白糖基化與磷酸化修飾的變化。以肌動蛋白作為內(nèi)參，結(jié)果以目的基因內(nèi)參灰度值表示。結(jié)果顯示各組間總tau蛋白(R134d)沒有明顯的變化，而實驗組tau蛋白的糖基化水平（RL2）明顯減少。與此同時tau蛋白ser396（pS396）磷酸化水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各對照組之間無明顯差異（圖3）。 3 討 論 有文獻報道，在AD患者腦中葡萄糖攝入和代謝

21、明顯降低4,5，并且認為是葡萄糖攝入和利用的降低引起神經(jīng)細胞退化，而不是由于神經(jīng)細胞退化引起葡萄糖攝入和利用的降低6。葡萄糖攝入和代謝降低使需要葡萄糖作為原料的UDP乙酰氨基己糖的合成減少，造成UDPGlcNAc的顯著下降，而UDPGlcNAc又是OGlcNAc糖基化的供體，最終導致AD患者腦中蛋白質(zhì)OGlcNAc糖基化修飾數(shù)量減少。Tau蛋白同樣受OGlcNAc糖基化的修飾。越來越多的證據(jù)表明： tau蛋白的OGlcNAc糖基化與磷酸化呈明顯的負相關，而且這兩種修飾之間可能存在一種平衡機制7。用饑餓處理小鼠，使小鼠腦內(nèi)葡萄糖攝入減少,引起小鼠大腦皮質(zhì)中總tau蛋白和tau蛋白的OGlcNAc

22、 糖基化水平降低，tau蛋白磷酸化水平升高。并且饑餓引起的tau蛋白OGlcNAc糖基化和磷酸化改變均在恢復進食后逆轉(zhuǎn)成正常水平8，說明葡萄糖攝入和代謝降低在AD的發(fā)生發(fā)展過程中起關鍵作用。 RNAi是新近發(fā)現(xiàn)的一種由雙鏈RNA引發(fā)的特異性高效基因表達抑制途徑。與傳統(tǒng)的反義核苷酸技術相比較，RNAi能更高效、更特異地抑制靶基因的表達 9。我們根據(jù)OGT基因序列的特點設計了高效且特異性強的OGTsiRNA干擾片段。我們選取HEK293T細胞作為研究對象，因該細胞轉(zhuǎn)染效率高，且由于沒有內(nèi)源性tau蛋白的表達，可通過外源tau質(zhì)粒的轉(zhuǎn)入，直接觀察tau蛋白表達狀況。用熒光標記的FAM陰性對照檢測轉(zhuǎn)染

23、效率，轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后轉(zhuǎn)染效率可達約85%。轉(zhuǎn)染結(jié)束24小時后通過實時PCR檢測OGT基因mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)OGTsiRNA對OGT基因的沉默效率可達78.1%。轉(zhuǎn)染結(jié)束48小時后，用Western blot檢測tau蛋白糖基化與磷酸化修飾的變化，總的tau蛋白(磷酸化與非磷酸化的tau蛋白)沒有明顯的變化,而tau蛋白的糖基化水平明顯減少, tau蛋白的ser396位點磷酸化水平(pS396)顯著增高。ser396位于tau蛋白的C末端，它的磷酸化與tau蛋白的成纖維作用有密切關系10，還可能直接導致tau蛋白聚集形成PHFs，影響tau蛋白正常功能。 我們的實驗用RNAi的方法

24、干擾OGT基因的表達，致使tau蛋白的糖基化修飾減少而磷酸化修飾顯著增高。結(jié)果證明tau蛋白的糖基化負調(diào)節(jié)其磷酸化,葡萄糖攝入減少或代謝降低可能在AD的發(fā)病過程中起關鍵的作用。本實驗僅對tau蛋白Ser396位點的磷酸化進行了研究，我們還將對更多的相關磷酸化位點進行研究，為闡明AD的發(fā)病機制提供科學依據(jù)。 （本文圖1見彩色插圖）【參考文獻】 1 Arriagada PV, Growdon JH, HedleyWhyte ET, et al. Neurofibrillary tangles but not senile plaques parallel duration and severity

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26、hosphorylation of tau: a mechanism involved in Alzheimers diseaseJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101 (29): 10804-10809.4 Kazunari I,Masahiro S,Hajime K,et al. Reduction of cerebellar glucose metabolism in advanced Alzheimers diseaseJ.J Nucl Med ,1997，38:925-928.5 Hirono N, Hashimoto M, Ishii K,et al. Oneyear change in cerebral glu