PTEN表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞系EC

1、PTEN表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞系EC9706 作者：侯桂琴，魯照明，薛樂勛，田芳，范天黎，劉蘭琦，許培榮 【摘要】 目的 篩選穩(wěn)定表達野生型PTEN基因的食管鱗癌細胞株EC9706。方法 提取胎盤總RNA，設(shè)計引物，PCR擴增人野生型PTEN基因，經(jīng)測序鑒定后，連接于pcDNA3.1(+)真核表達載體，構(gòu)建pcDNA3.1PTEN，用脂質(zhì)體介導的方法將其轉(zhuǎn)染EC9706。而后加抗生素G418篩選穩(wěn)定表達株，用RTPCR方法檢測穩(wěn)定表達株P(guān)TEN基因的mRNA水平，通過繪制生長曲線觀察細胞生長情況。結(jié)果 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，在1 500bp左右有一明顯亮帶，測序結(jié)果與GenBan

2、k上PTEN序列完全一致；穩(wěn)定表達PTEN基因的細胞株RTPCR結(jié)果顯示，PTEN的mRNA水平比對照細胞株相比明顯升高；生長曲線結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后的細胞生長速度明顯減慢。結(jié)論 所擴基因為野生型PTEN基因，所構(gòu)建的載體為野生型PTEN基因真核表達載體，并篩選出PTEN基因穩(wěn)定表達的食管鱗癌細胞株。 【關(guān)鍵詞】 PTEN；食管鱗癌；mTOR；轉(zhuǎn)染Abstract：Objective To establish stable expression cell line transfected with eukaryotic expression vector of PTEN. Methods To c

3、lone the wildtype PTEN gene, total RNA was isolated from human placenta tissues. A cDNA of human PTEN was obtained by optimized RTPCR and sequenced, and then the cDNA fragment was put into the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+) to construct pcDNA3.1PTEN. Cells of esophageal squamous cell canc

4、er cell line EC9706 were transferred with pcDNA3.1PTEN using lipofectamine. The stable expression cells were screened by G418. RTPCR and growth curve were done for identifying the screened cells. Results The cDNA fragment produced by RTPCR had 100% homology with wildtype PTEN gene sequence on GenBan

5、k by BLAST. The mRNA level of PTEN increased notably in the cell line we screened, and the growth of the cell line was very solely compared with control cell lines. Conclusion Because of cells of esophageal squamous cell cancer which stably express PTEN were successfully screened, it is concluded th

6、at a PTEN eukaryotic vector for stable expression in esophageal squamous cell cancer cell line has been constructed.Key words：PTEN；Esophageal cancer；mTOR；Transfection0 引言 mTOR(Mammalian target of rapamycin)是一種進化上高度保守的絲/蘇氨酸蛋白酶。越來越多的證據(jù)顯示， mTOR信號轉(zhuǎn)導在細胞的生存、生長與增殖中起中心調(diào)控作用，其通路的異常與多種惡性腫瘤有關(guān)1，已成為腫瘤治療的新靶點2,3，雷帕

7、霉素是mTOR的特異性抑制劑4。抑癌基因PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10)是1997年發(fā)現(xiàn)并被克隆的第一個具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因,并被證實與十幾種人類腫瘤的惡性增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)5。據(jù)報道，PTEN的缺失或突變可以使mTOR信號通路異常激活6,7。目前國內(nèi)對PTEN的研究僅集中在腫瘤中PTEN蛋白的表達情況，PTEN基因突變檢測及PTEN基因的抑癌效果方面8,9，而其表達水平變化對mTOR通路的影響及其引起的細胞對雷帕霉素敏感性的變化在國內(nèi)外均未見報道。由于河南省是食管癌的高發(fā)區(qū),故本研究以食管

8、鱗癌為研究對象，從胎盤中克隆野生型PTEN基因，構(gòu)建真核表達載體并轉(zhuǎn)染食管癌細胞，篩選出穩(wěn)定的表達株，為進一步研究PTEN與mTOR通路之間的關(guān)系提供了很好的實驗基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 細胞株及組織人食管鱗癌細胞株EC9706由本校病理教研室提供；正常人胎盤組織來源于河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，液氮保存。1.1.2 載體與宿主菌 pcDNA3.1(+)載體購自Invitrogen公司，pMD18T 載體購自大連寶生物公司；大腸桿菌JM109由本室保存。1.1.3 酶及試劑內(nèi)切酶及試劑盒購自大連寶生物（TaKaRa）公司；DNA marker、IPTG、Xgal購自上海生物工程公司

9、；G418為Sigma公司產(chǎn)品。1.1.4 培養(yǎng)基RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibco公司，含Amp的LB（LA）培養(yǎng)基本室配制。1.1.5 引物根據(jù)GenBank上登錄的人野生型PTEN及Actin序列用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計三對引物。 引物1：PTEN全序列擴增引物：上游P1 5AAG CTT ATG ACA GCC ATC ATC AAA GAG AT 3，含Hind酶切位點，下游P2 5GGA TCC GGA ATA AAA CGG GAA AGT GCC 3，含BamH酶切位點,下劃線部分為相應酶切位點，序列全長為1 512bp； 引物2：

10、PTEN的RTPCR檢測引物：上游P11 5TTG AAG ACC ATA ACC CAC CA 3下游P22 3GGT CAG TCT CCG CGA TAC AC 5長度為257bp； 引物3：內(nèi)參Actin基因引物：上游AP1：5ACC AAC TGG GAC GAC ATG GAG AAA ATC 3,下游AP2：5GTA GCC GCG CTC GGT GAG GAT CTT CAT 3,長度為409bp。引物均由北京奧克生物工程公司合成。1.2 方法1.2.1 胎盤總RNA的提取將約50mg液氮保存的胎盤組織剪碎，然后按Trizol試劑說明書提取總RNA。1.2.2 PTEN基因的

11、RTPCR擴增根據(jù)TaKaRa一步法RNA PCR Kit 說明書進行,反應體系50l。RTPCR擴增條件: 50 30min，94 2min；94 30sec，52 30sec，72 6min，共35個循環(huán)；繼之72 延伸10min，4終止。結(jié)束后取5l 產(chǎn)物電泳檢測。1.2.3 PTEN基因的克隆及鑒定回收PCR 產(chǎn)物并與T 載體連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18PTEN，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，37過夜培養(yǎng)。隨機挑取白色菌落，接種于LA液體培養(yǎng)基中，37震蕩過夜培養(yǎng)。提質(zhì)粒，Hind和BamHI 37雙酶切，酶切產(chǎn)物進行電泳鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒測序。1.2.4 真核表達載體的構(gòu)建及鑒

12、定把經(jīng)測序鑒定正確的重組質(zhì)粒用Hind和BamH雙酶切，回收約1.5kb的PTEN片段；同樣用Hind和BamH雙酶切pcDNA 3.1(+)載體，回收大片段。連接兩片段并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，過夜培養(yǎng)，挑克隆，提質(zhì)粒，雙酶切鑒定。然后用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取鑒定正確的質(zhì)粒備用。1.2.5 細胞培養(yǎng)食管鱗癌細胞株EC9706用含10% FBS 的RPMI1640培養(yǎng)基于37、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.2.6 轉(zhuǎn)染接種細胞于24孔板中培養(yǎng)，當細胞達80%90%融合時，按LipofectamineTM2000說明，把pcDNA 3.1PTEN 轉(zhuǎn)染EC9706，以轉(zhuǎn)染p

13、cDNA3.1(+)空載體及不轉(zhuǎn)染細胞為對照。培養(yǎng)24h后按600g/ ml加入G418篩選陽性細胞克隆。1.2.7 檢測轉(zhuǎn)染細胞中PTEN水平培養(yǎng)陽性細胞克隆，提取細胞總RNA，RTPCR檢測轉(zhuǎn)染細胞中PTEN水平變化。1.2.8 生長曲線繪制穩(wěn)定生長的陽性細胞克隆按1×104/孔接種于24孔板中，每天取3個復孔進行計數(shù)，共計7天，繪制生長曲線。1.2.9 統(tǒng)計學處理數(shù)值以±s表示，行單因素方差分析（ANOVA）；抑制率=（處理孔細胞計數(shù)值對照孔細胞計數(shù)值）/對照孔細胞計數(shù)值，t檢驗，在SPSS13.0上完成。2 結(jié)果2.1 胎盤總RNA及PCR擴增結(jié)果總RNA電泳結(jié)果顯

14、示，提取的RNA較完整，見圖1。PCR擴增結(jié)果顯示，在約1.5kb處有一明顯亮帶，見圖2。2.2 陽性克隆鑒定及測序結(jié)果分析陽性質(zhì)粒用BamHI和HindIII雙酶切鑒定如圖3顯示，四個質(zhì)粒均有大小正確的插入片段，測序結(jié)果與GenBank上人野生型PTEN基因序列完全相同。2.3 篩選陽性細胞株轉(zhuǎn)染的食管鱗癌細胞培養(yǎng)24h后加600g/ml G418進行篩選，23天更換1次新鮮培基，繼續(xù)加G418篩選，至正常細胞全部死亡后停止篩選，兩株轉(zhuǎn)染細胞還有少數(shù)存活，即為陽性細胞。挑取陽性單克隆細胞至新培養(yǎng)孔中，低濃度G418（200g/ml）維持培養(yǎng)。2.4 RTPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)染前的細胞相比，轉(zhuǎn)染PT

15、EN的細胞mRNA水平明顯升高，而轉(zhuǎn)染空載體的細胞無明顯變化，見圖4。內(nèi)參為Actin,大小為409bp。2.5 生長曲線與未轉(zhuǎn)染細胞相比，轉(zhuǎn)染細胞生長速度明顯減慢，而轉(zhuǎn)染PTEN的細胞生長速度最慢，見圖5。細胞計數(shù)結(jié)果及統(tǒng)計學處理，見表1。表1 三種細胞株計數(shù)結(jié)果及F值（略）注：1組代表未轉(zhuǎn)染細胞株；2組代表轉(zhuǎn)染空載體細胞株；3組代表轉(zhuǎn)染重組載的體細胞株；從第3天開始，經(jīng)單因素方差分析，3組間細胞計數(shù)有明顯差異（P<0.001） 轉(zhuǎn)空載體及重組載體在不同時間對細胞的抑制率見表2。經(jīng)t檢驗，轉(zhuǎn)空載體細胞和轉(zhuǎn)PTEN重組質(zhì)粒載體的細胞在第3天抑制率在統(tǒng)計學上無差異(P0.05)；從

16、第4天開始，2組間的細胞生長抑制率有明顯差異（D47均P<0.01），即與轉(zhuǎn)空載體細胞比較，轉(zhuǎn)PTEN重組質(zhì)粒載體的細胞生長明顯受抑制。表2 37d轉(zhuǎn)空載體細胞株和轉(zhuǎn)重組載體細胞株的抑制率（略）注：本表中2組和3組第37天的抑制率按照公式抑制率=（處理孔細胞計數(shù)值對照孔細胞計數(shù)值）/對照孔細胞計數(shù)值計算得出。2組代表轉(zhuǎn)空載體細胞株；3組代表轉(zhuǎn)重組載體細胞株3 討論 抑癌基因PTEN作為迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，在十幾種惡性腫瘤中廣泛存在突變10，自發(fā)現(xiàn)以來一直是研究的熱點。mTOR又叫FRAP、RAFT1或RAP1，是新發(fā)現(xiàn)的蛋白激酶家族中的一員，在由磷酸肌醇

17、激酶3（PI3K）/Akt傳導通路介導的增生信號的傳導中起重要作用。多數(shù)腫瘤中存在PTEN的缺失或突變，而PTEN的缺失或突變又可引起mTOR異常激活11,12。 從本試驗結(jié)果可以看出，PCR擴增PTEN全序列的條帶非常特異，而測序結(jié)果也表明所克隆的片段為野生型PTEN基因。根據(jù)轉(zhuǎn)染細胞PTEN的 RTPCR結(jié)果，可以看出在轉(zhuǎn)染PTEN的細胞中，PTEN的水平有了顯著的升高，生長曲線圖顯示，轉(zhuǎn)PTEN細胞比轉(zhuǎn)空載體細胞及未轉(zhuǎn)染細胞的生長速度明顯減慢（從第3天開始P<0.001）。我們推測，轉(zhuǎn)染細胞中PTEN蛋白表達確實對細胞生長起抑制作用，說明野生型PTEN已成功轉(zhuǎn)入食管鱗癌細胞

18、中。 總之，本試驗克隆了人野生型PTEN基因并導入食管鱗癌細胞中，成功篩選出PTEN穩(wěn)定表達株，且PTEN蛋白對細胞生長有抑制作用。由于食管鱗癌在河南的發(fā)病率高，并且PTEN在食管癌中的研究已取得了一定進展13，本研究篩選出的穩(wěn)定表達株為進一步研究食管癌細胞中PTEN蛋白表達水平對mTOR通路的影響提供了實驗依據(jù)，也為從分子水平上治療食管癌奠定了基礎(chǔ)。 【參考文獻】 1Kim JE, Chen J. Cytoplasmicnuclear shuttling of FKBP12rapamycinassociated protein is involved in rapamycinsensitiv

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