高效液相色譜操作基礎(chǔ)知識(shí)拓展

1、高效液相色譜知識(shí)高效液相色譜知識(shí) 一、液相色譜的原理 二、HPLC的特點(diǎn) 三、HPLC 的組成 四、流動(dòng)相 五、緩沖溶液的作用 六、梯度洗脫的流動(dòng)相調(diào)整 七、遇到問(wèn)題的解決 八、氣相與液相的區(qū)別上海波粒儀器科技有限公司友情供一、液相色譜的原理 原理原理：溶于流動(dòng)相(mobile phase)中的各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出 。( (反相色譜中，溶質(zhì)按其疏水性大小進(jìn)行分離，極性越大疏水性越小的溶質(zhì)，越不易與非極性的固定相結(jié)合，所以先被洗脫下來(lái)) 正相

2、色譜正相色譜：流動(dòng)相使用非極性的疏水性溶劑（流動(dòng)相極性固定相極性），常用于分離中等極性或極性較強(qiáng)的化合物（如酚類、胺類、酸基類及氨基類）;流出峰順序?yàn)闃O性小的先流出。 反相色譜反相色譜：流動(dòng)相極性固定相極性；流出峰順序?yàn)闃O性大的先流出上海波粒儀器科技有限公司友情供二、HPLC的特點(diǎn) 高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過(guò)色譜柱，必須對(duì)載液加高壓。高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。高靈敏度：紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在uL數(shù)量級(jí)。應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是

3、高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)。分析速度快、載液流速快：較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在1530分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。 上海波粒儀器科技有限公司友情供三、HPLCHPLC 的組成 HPLC系統(tǒng)一般由高壓輸液泵、進(jìn)樣器、OL Apple系列色譜柱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成 。 一、高壓輸液系統(tǒng) 1、泵的性能流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)0.5%，這對(duì)定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.110 ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100 ml/min；輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150300 kg/cm2

4、；液缸容積??；密封性能好，耐腐蝕。 2、梯度洗脫 上海波粒儀器科技有限公司友情供三、HPLCHPLC 的組成 HPLC有等強(qiáng)度(isocratic)和梯度(gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形，提高檢測(cè)靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。 梯度洗脫有兩種實(shí)現(xiàn)方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內(nèi)梯度）。 兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意

5、程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進(jìn)行梯度洗脫。 在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來(lái)一些特殊問(wèn)題，必須充分重視：上海波粒儀器科技有限公司友情供三、HPLCHPLC 的組成 要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時(shí)更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時(shí)，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心。 梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富

6、集在色譜柱頭后會(huì)被強(qiáng)溶劑洗脫下來(lái)。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡。 混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時(shí)粘度增大很多，此時(shí)的柱壓大約是甲醇或水為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過(guò)程中壓力超過(guò)輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。 每次梯度洗脫之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓1030倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡上海波粒儀器科技有限公司友情供三、HPLCHPLC 的組成 二、進(jìn)樣器 HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣 （我

7、們是自動(dòng)進(jìn)樣器） 注意事項(xiàng)：樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45m濾膜過(guò)濾；為防止緩沖鹽和樣品殘留在進(jìn)樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。 三、色譜柱實(shí)驗(yàn)室所用為OLC18柱（注：C18柱對(duì)PH要求比較嚴(yán)格，PH28之間。）上海波粒儀器科技有限公司友情供三、HPLCHPLC 的組成在色譜操作過(guò)程中，需要注意下列問(wèn)題，以維護(hù)OL色譜柱。避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩（如前所述）。應(yīng)逐漸改

8、變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然。一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜

9、質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要5075ml。上海波粒儀器科技有限公司友情供三、HPLCHPLC 的組成 四、檢測(cè)器通用型紫外檢測(cè)器 UV檢測(cè)器是HPLC中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)范圍包括可見光時(shí)，又稱為紫外-可見檢測(cè)器。它靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對(duì)流速和溫度均不敏感，可于制備色譜。由于靈敏高，因此既使是那些光吸收小、消光系數(shù)低的物質(zhì)也可用UV檢測(cè)器進(jìn)行微量分析。但要注意流動(dòng)相中各種溶劑的紫外吸收截止波長(zhǎng)。如果溶劑中含有吸光雜質(zhì)，則會(huì)提高背景噪音，降低靈敏度（實(shí)際是提高檢測(cè)限）。此外，梯度洗脫

10、時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生漂移。 注：將溶劑裝入1cm的比色皿，以空氣為參比，逐漸降低入射波長(zhǎng)，溶劑的吸光度A1時(shí)的波長(zhǎng)稱為溶劑的截止波長(zhǎng)。也稱極限波長(zhǎng)。上海波粒儀器科技有限公司友情供四、流動(dòng)相流動(dòng)相由于高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它對(duì)組分有親和力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)。因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是： （1）溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。 （2）溶劑要與檢測(cè)器匹配。對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器，應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比溶劑的紫外截止波長(zhǎng)要長(zhǎng)。所謂溶劑的紫外截止波長(zhǎng)指當(dāng)小于截止波長(zhǎng)的輻射通過(guò)溶劑時(shí)，溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干

11、擾組分的吸收測(cè)量。（3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長(zhǎng)值增加50IOOnm。上海波粒儀器科技有限公司友情供四、流動(dòng)相流動(dòng)相 （4）化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。 (5)低粘度。若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過(guò)于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離.上海波粒儀器科技有限公司友情供四、流動(dòng)相流動(dòng)相流動(dòng)相類別按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M份和多組份按極性分：極性、弱極性、非極性按使用方法分：等度洗

12、脫和梯度洗脫二、流動(dòng)相的選擇在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇流動(dòng)相的重要依據(jù)。（注：改變流動(dòng)相的組成、極性是改善分離的最重要的直接因素）常用溶劑的極性順序：水甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六環(huán)THF甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚異丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油 最常用的流動(dòng)相及其沖洗強(qiáng)度如下： H2O甲醇乙腈乙醇丙醇異丙醇四氫呋喃 上海波粒儀器科技有限公司友情供五、緩沖溶液的作用 在反相色譜中，流動(dòng)相的在反相色譜中，流動(dòng)相的PHPH值一般為值一般為2-82-8，當(dāng)被分析物在反，當(dāng)被分析物在反相條件下可離解，或樣品的相條件下可離解，或樣品的PHPH值在值在2-82-8之外時(shí)，就需

13、要緩沖之外時(shí)，就需要緩沖溶液。在反相條件下可離解的化合物一般都有氨基或羧基，溶液。在反相條件下可離解的化合物一般都有氨基或羧基，它們的它們的PKaPKa在在1-111-11之間，選擇正確的緩沖液之間，選擇正確的緩沖液PHPH值可保證可離值可保證可離解的官能團(tuán)以一種形式存在，離子形式或中性化合物形式，解的官能團(tuán)以一種形式存在，離子形式或中性化合物形式，如果樣品的如果樣品的PHPH值對(duì)柱子有傷害，則緩沖溶液可以使其變溫值對(duì)柱子有傷害，則緩沖溶液可以使其變溫和從而減小危害。和從而減小危害。 在選擇緩沖溶液的在選擇緩沖溶液的PHPH值時(shí)，應(yīng)先了解被測(cè)物的值時(shí)，應(yīng)先了解被測(cè)物的PKaPKa，高于或，高于

14、或低于低于PKa2PKa2個(gè)個(gè)PHPH單位的，有助于獲得好的、尖銳的峰。從以單位的，有助于獲得好的、尖銳的峰。從以下公式可知。下公式可知。 PH=PKa+logPH=PKa+log（AA- -/A/A）溶液的溶液的PHPH值高于或低于值高于或低于PKa2PKa2個(gè)單位，化合物中個(gè)單位，化合物中99%99%以一種形式以一種形式存在，而以一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳峰。存在，而以一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳峰。上海波粒儀器科技有限公司友情供六、梯度洗脫的流動(dòng)相調(diào)整1、由強(qiáng)到弱，一般先用90%甲醇（乙腈）/水（或緩沖溶液）試驗(yàn)，這樣可以很快得到分離效果，然后調(diào)整有機(jī)溶劑的比例。、三倍

15、規(guī)則：每減少10%的有機(jī)溶劑的量，容量因子增加三倍，調(diào)整過(guò)程中注意各峰的分離情況。、粗調(diào)轉(zhuǎn)細(xì)調(diào)：當(dāng)分離到一定程度，應(yīng)將10%有機(jī)溶劑改為5%，并依此規(guī)則逐漸降低調(diào)節(jié)量，直至各組分分離情況不改變。上海波粒儀器科技有限公司友情供六、梯度洗脫的流動(dòng)相調(diào)整1、相同條件下不同的配比分離效果好下：60/4050/5040/60上海波粒儀器科技有限公司友情供上海波粒儀器科技有限公司友情供七、樣品的測(cè)定 1、如果拿到一個(gè)樣品時(shí)，首先考慮是否適合液相來(lái)分析，一般適合液相分析的樣品通常具有這樣的性質(zhì)，在190-900nm之間有吸收（根據(jù)檢測(cè)器而定），性質(zhì)穩(wěn)定，不與流動(dòng)相發(fā)生反應(yīng)，沸點(diǎn)較高均，能夠用色譜柱（正反相）

16、分離； 2、樣品前處理 樣品能否溶于流動(dòng)相 用反相柱子分析的，注意濃度不能太高 配制后樣品如有雜質(zhì)，則需進(jìn)行過(guò)濾 3、流動(dòng)相的調(diào)整 4、做完后對(duì)儀器進(jìn)行沖洗。上海波粒儀器科技有限公司友情供八、遇到問(wèn)題的解決1、溶劑量不夠色譜柱會(huì)進(jìn)入空氣嗎？答：不會(huì)的。因?yàn)楸弥粫?huì)輸送液體，不能輸送氣體，所以不用擔(dān)心柱子里會(huì)充滿氣體而損壞柱子。2、液相色譜中紫外檢測(cè)器對(duì)溫度的要求高嗎？答：紫外檢測(cè)器對(duì)溫度變化不太敏感。3、基線突然提高，變粗，處理方法：檢查樣品池能量，若低于正常值，說(shuō)明檢測(cè)器污染。線噪音變大：未接地線，可在檢測(cè)器的外殼外接一根鐵絲連地； 燈能量不足，可在funk功能中查找燈的使用時(shí)間，或拆開機(jī)器外

17、殼，觀看紫外燈的強(qiáng)度； 檢測(cè)池污染，拆下柱子，用無(wú)體積連接器連接泵和檢測(cè)器，用異丙醇小流速?zèng)_洗半個(gè)小時(shí)即可； 流動(dòng)相污染或進(jìn)氣泡。4 、有時(shí)會(huì)出現(xiàn)樣品方法已建立，序列也已編好，就是運(yùn)行不了，什么原因？上海波粒儀器科技有限公司友情供九、氣相與液相的區(qū)別1、 GC：流動(dòng)相為惰性氣體，組分與流動(dòng)相無(wú)親合力LC：流動(dòng)相為液體2、 GC：樣品需加熱氣化或裂解；LC：樣品制成溶液即可3、 GC：加溫操作；LC：通常室溫操作，高壓泵操作4、 GC：通用型檢測(cè)器TCD，MSD，選擇性檢測(cè)器FID，ECD，F(xiàn)PD，NPDLC：通用型檢測(cè)器RID，ELSD，MSD，選擇性檢測(cè)器UVD，PDAD，F(xiàn)D，ECD5、 GC：分析低分子量、低沸點(diǎn)有機(jī)化合物和永久性氣體；配合程序升溫分析高沸點(diǎn)有機(jī)化合物；配合裂解技術(shù)分析高聚物；不能檢測(cè)揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差和離子型樣品；占有機(jī)物的20%。LC：既可分析低分子量、低沸點(diǎn)有機(jī)化合物；也可分析中、高分子量和高沸點(diǎn)有機(jī)化合物；對(duì)于熱不穩(wěn)定、難揮發(fā)、有生物活性及離子型化合物均可檢測(cè)；占有機(jī)物的80%