電鏡練習題及參考答案

1、一、電鏡練習題及答案一、透射電鏡標本取材的基本要求并簡要說明。答：取材的基本要求如下：組織從生物活體取下以后，如果不立即進行及時固定處理，就有可能出現缺血缺氧后的細胞超微結構的改變，如細胞出現細胞器變性或溶解等現象，這些都可造成電鏡觀察中的人為假象，直接影響觀察結果分析，甚至導致實驗失敗。此外，由于處理不當造成組織微生物污染，導致細胞的超微結構結構遭受破壞。因此，為了使細胞結構盡可能保持生前狀態(tài)，取材成敗是關鍵，取材成功的關鍵在于操作者必須要注意把握“快、小、冷、準”四個取材要點。(1)快：就是指取材動作要迅速，組織從活體取下后應在最短時間 (爭取在12分鐘之內)投入前固定液。對于實驗動物，最

2、好在斷血流、斷氣之前就進行取材，以免缺血缺氧后使細胞代謝發(fā)生改變而破壞細胞的超微結構。當然，最好是采用灌注固定法。為了使前固定的效果更佳，組織塊要充分和固定液混合，應采用振蕩固定10分鐘以上，有條件的可采用微波固定法固定。(2)?。河捎诔Ｓ玫墓潭▌B透能力較弱，組織塊如果太大，塊的內部將不能得到良好的固定。因此所取組織的體積要小，一般不超過1mm3。為便于定向包埋，可將組織修成大小約1mm1mm2mm長條形。(3)冷：為了防止酶對自身細胞的酶解作用，取材操作最好在低溫(515)環(huán)境下進行，這樣可以降低酶的活性，防止細胞自溶。所采用的固定劑以及取材器械要預先在冰箱(5）中存放一段時間。(4)準：

3、就是取材部位要準確，這就要求取材者對所取的組織解剖部位要熟悉，必須取到與實驗要求相關的部位，不同實驗組別間要取相同部位，如需要定向包埋的標本，則要作好定向取材工作。此外，還要求操作動作輕柔，熟練，盡量避免牽拉、挫傷與擠壓對組織造成的人為損傷。二、 什么是瑞利準則？電鏡與光鏡在原理上有何相似和不同之處？答：1、光線通過二個比較靠近的小孔時，這二個小孔的衍射圖會重疊在一起。當一個衍射圖的中央亮斑正好落在另一個衍射圖的第一暗環(huán)中心時，這二個點剛可以分辯。這就是顯微鏡分辯本領的瑞利準則。2、相似點：光學顯微鏡是利用玻璃制作的透鏡對光進行折射，將一物點發(fā)出不同角度的光線最終會聚成一個像點。電子顯微鏡是以

4、電子束作為光源，利用電磁透鏡產生的電場或磁場折射電子束，并通過電子束轟擊熒光屏激發(fā)熒光而達到成像目的。不同點：光鏡的照明源是可見光，而電鏡是用電子束照明。光鏡的透鏡用玻璃制成，而電鏡的透鏡是軸對稱的電場或磁場。三、 簡述透射電鏡及掃描電鏡樣品制作流程答：1、透射電鏡樣品制作流程為取材漂洗（生理鹽水）前固定（2.5%戊二醛，4C冰箱2小時以上）漂洗（0.1M 磷酸緩沖液，3次，45分鐘）后固定(1%鋨酸1小時左右)漂洗（0.1M 磷酸緩沖液，3次，45分鐘）塊染（1%醋酸鈾2小時）梯度脫水（50%、70%、80%、90%丙酮各15分鐘， 100%丙酮 2次，各10分鐘）浸透（丙酮：包埋液=1：1

5、，37 C烘箱2小時；丙酮：包埋液=1：4， 37C烘箱過夜；純包埋液45C烘箱2小時）包埋聚合（45C烘箱3小時，65C烘箱48小時）。 2、掃描電鏡樣品制作流程為取材（做好樣品觀察面的標志）漂洗（生理鹽水或緩沖液）固定（2.5%戊二醛2小時以上）漂洗（0.1M磷酸緩沖液，3次，45分鐘）后固定（1%鋨酸，2小時）脫水（ 50%、70%、80%、90%、95%各15分鐘，換醋酸異戊酯15分鐘或叔丁醇15分鐘）干燥（零界點干燥或冷凍干燥）鍍膜（真空鍍膜儀或離子濺射儀）四、常用的化學固定方法有哪些？答;常用的化學固定方法有1、浸泡固定法（也稱組織塊固定）：就是將組織塊直接浸泡入固定液當中進行固定

6、。2、游離細胞固定法：適用于培養(yǎng)細胞、周圍血、骨髓、胸腹水或其他滲出液。如為貼壁生長的培養(yǎng)細胞，應先用橡皮刮子將細胞從培養(yǎng)管壁上輕輕刮下，或用酶消化，使細胞脫離管壁。3、原位固定法：就是在組織未取下之前，在組織器官原來的位置進行預固定的方法。原位固定可分為點滴固定法和注射固定法兩種。點滴固定法：就是將實驗動物麻醉后暴露出所需的器官表面，小心地剝開包膜，將預冷的固定液直接滴在組織的表面上，并保持固定液適當濃度不使揮發(fā)干燥。注射固定法：就是將實驗動物麻醉后，將固定液用細注射針直接注射到所需固定的組織中或空腔臟器的內部。4、灌注固定法就是利用血液循環(huán)的途徑將固定液灌注到所需固定的組織中，其特點是灌注

7、快速、均勻，缺點是固定操作復雜、要求高。灌注固定法可分為全身固定和局部固定兩種。通常采用的固定劑為2%4%戊二醛溶液或者4%多聚甲醛溶液。五、普通透射電鏡包括那些結構？請簡要敘述。答：透射式電子顯微鏡（簡稱透射電鏡）由四部分組成，即電子光學系統(tǒng)（即鏡筒）、真空排氣系統(tǒng)、電源系統(tǒng)和水冷系統(tǒng)。電子光學系統(tǒng)包括：照明系統(tǒng)、樣品室、成像系統(tǒng)和觀察記錄系統(tǒng)。真空排氣系統(tǒng)包括：機械泵、油擴散泵、真空管道、閥門及檢測系統(tǒng)組成。電源系統(tǒng)包括：主要的電源供給包括高壓電源、電子槍燈絲電源、控制極電源、透鏡電源、真空系統(tǒng)電源等部分。水冷系統(tǒng)主要靠冷卻水循環(huán)裝置來完成或者直接用自來水降溫。六、簡述電鏡在生命科學中的應

8、用答: 電鏡在生命科學上的應用幾乎包括所有的學科研究領域都已經用到或即將用到電鏡技術。比如動物或植物細胞的超微結構（包括細胞核、細胞質及其細胞器等內容物、細胞間的連接等）的形態(tài)觀察，通過對比觀察，對動植物形態(tài)在超微結構水平上進行分類、分型，以探討遺傳、變異及病理病因的機理或機制，為生命科學的基礎研究所不可或缺的研究手段。 利用常規(guī)電鏡技術和特殊電鏡技術如免疫電鏡技術、電鏡酶細胞化學技術、電鏡原位雜交技術等可以進行細胞細胞超微結構及超微病理分析，以及細胞內抗原、酶等的定位、定性甚至定量研究等。七、簡述電鏡的球差和畸變及其形成原因。答：1、球差：由于電子束光源通過透鏡受到偏轉，通過樣品，從物平面向

9、下發(fā)射，形成物點孔徑角。從物點發(fā)出的射線，到達下一級透鏡又被聚集。如果透鏡有缺陷或孔徑角太大，則靠近光軸的射線和遠離光軸的射線，受到電磁場的作用就會不同，這些射線在光軸上會聚的位置不同，結果遠離光軸的射線就會在像面上形成一個最小模糊圈。此時可有圖象中央凸起感。球差是目前影響電鏡分辨率的一個主要因素。 2、畸變：由于離軸較遠處的徑向磁場的作用力強，使放大倍數隨物點離軸的距離而變化，進而使圖象發(fā)生改變而產生的。畸變常見的有枕形畸變、桶形畸變和S形畸變等。八、簡述電磁透鏡及其聚焦原理答：由于軸對稱彎曲磁場對電子束有聚焦作用，因而可以得到電子光學像。我們稱這種具有軸對稱彎曲磁場裝置構成的電子透鏡為電磁

10、透鏡（electron magnetic lenses）。由于電磁透鏡磁場非均勻分布，物、像點在磁場之外，電子在磁場中既受到軸向分量的作用，又受到徑向分量的作用，使平行于軸進入磁場的電子束可獲得聚焦。九、什么是反差？簡述電鏡熒光圖像反差形成的原因。答：1、人的眼睛在區(qū)分物體時，主要根據物體不同部位或物體之間的光強度與波長的差別，這些差別構成了物體的反襯度，又稱為“反差”。電鏡與光鏡一樣也存在反差現象。2、由于電鏡標本上的不同部位的物質結構不同，經過電子染色后，其疏密度也不同，它們散射電子的能力也各不相同，散射電子能力強的地方，顯現為暗像；相反，散射能力弱的地方，顯現為亮像。因此，在熒光屏上所看

11、到的是由暗像與亮像組成的具有一定反差的熒光圖像。 十、游離細胞取材方法有哪些?并簡述其處理方法。 答：血漿凝集法：將抗凝全血離心分層（2000轉/每分鐘，1020分鐘），用毛細吸管沿著管壁輕輕的將上清夜吸?。ú灰茐陌准毎麑樱又梦芪」潭ㄒ?，并沿著管壁將2.5%戊二醛固定液慢慢地加入進行固定，然后把它放在4冰箱內保存。血漿（血清）混合法：如為細菌、病毒、脫落細胞、培養(yǎng)細胞則先將它們制成懸液放置于離心管內（最好是玻璃的），離心成團（10003000轉/分鐘，10分鐘，下同），去上清液后加入2.5%戊二醛固定10分鐘左右，離心，再棄去多余的固定液，然后和少量抗凝血漿或血清混合均勻，離心成團

12、，去上清液（留少許），用吸管吸取2.5%戊二醛固定液沿著離心管壁緩慢滴入，盡量避免團塊分散，靜置于4冰箱內保存?zhèn)溆?。十一、簡述超薄切片流程并簡要說明。答：超薄切片流程包括以下幾個步驟：1、切片前的準備：銅網清洗（用丙酮和乙醇浸洗）2、支持膜制備：常用Formvar膜（用聚乙烯醇縮甲醛和氯仿配置，濃度為0.5%）3、玻璃刀制備：專用制刀機制作。4、半薄切片光鏡定位（主要確定超薄切片的位置）。5、修塊（表面修成梯形或長方形）。6、超薄切片：專用超薄切片機切片，厚度在 50100 nm 之間較為合適。7、撈片：將超薄切片撈在載網上。8、染色：鉛-鈾雙重染色法，如已有過塊染，則只需鉛染色30分鐘即可。

13、十二、簡述負染技術及其應用。答：負染技術是利用重金屬鹽（常用磷鎢酸鹽或醋酸鈾溶液）沉積到樣品四周，樣品四周散射電子的能力就較強，因而表現為暗區(qū)；樣品本身散射電子的能力較弱，則表現為亮區(qū)，這樣便能把樣品的外形與表面結構清楚地襯托出來。是觀察微小顆粒狀生物材料的外部形狀常用的染色方法。主要應用于病毒、支原體、細菌等微生物外部形態(tài)的觀察以及納米級生物材料的形態(tài)觀察。十三、簡述石蠟塊做超薄切片的樣品制作流程答、石蠟塊做超薄切片的樣品制作流程如下：1、取材：從石蠟塊上相應部位切下約1mm3 的小塊。2、溶蠟：將取下的標本放在一張濾紙上，40烘箱內烘1小時，然后轉放入二甲苯溶液中40烘箱內繼續(xù)浸泡812h

14、。3、水化：純丙酮30分鐘、90%、80%、70%丙酮各15分鐘。4、漂洗：用緩沖液漂洗（0.1M磷酸緩沖液PBS)3次，每次15分鐘。5、固定：2.5%戊二醛固定2小時，PBS漂洗3次,而后1%鋨酸后固定12小時。6、漂洗、塊染、脫水、浸泡、包埋聚合同常規(guī)透射電鏡標本制作方法。二、選擇題及答案1、 人眼的平均分辨率為（B）A 0.4mm B 0.2mm C 0.3mm D O.2m E 0.4m2、 電子槍產生的電子是（A ）A 入射電子 B 透射電子 C 彈性散射電子 D 二次電子 E 俄歇電子3、 用來顯示組織和細胞的內部超微結構像的電子為（B）A 入射電子 B 透射電子 C 彈性散射電

15、子 D 二次電子 E 反射電子4、 下面哪項不屬于透射電鏡樣品制備技術（ A ）A 鍍膜 B 負染技術 C 電鏡細胞化學技術D 超薄切片技術 E 半薄切片技術5、下面哪項不屬于掃描電鏡樣品制備技術（B ）A 表面干燥法 B 浸透包埋 C 冷凍復型D 冷凍割斷法 E 組織導電法6、下面哪種電鏡可以在觀察結構的同時，對組織細胞內的元素成分進行分析（C）A 透射電鏡 B 掃描電鏡 C 分析電鏡D 超高壓透射電鏡 E 原子力顯微鏡7、觀察組織細胞內部超微結構應選用哪種電鏡（B）A 原子力顯微鏡 B 透射電鏡 C 掃描電鏡D 磁力顯微鏡 E 側向力顯微鏡8、下面哪項不是超高壓電子顯微鏡的優(yōu)點（E ）A

16、可用于觀察厚切片 B 可以提高分辨率 C 可提高圖像質量D 可觀察復雜的結構 E 減少輻射損傷范圍9、下面對掃描電鏡的描述錯誤的是（B）A 利用反射電子和二次電子成像B 用于觀察組織細胞表面形貌C 樣品室大，可用于觀察塊狀樣品D 景深長，立體感強E 樣品可被升降和傾斜10、電子槍由（D）組成A 陰極、陽極 B 陰極、柵極 C 陽極、柵極D 陰極、陽極、柵極 E 正極、負極、柵極11、二次電子監(jiān)測系統(tǒng)不包括（E）A 檢測器 B 陰極射線管 C 閃爍器D 光電倍增器 E 視頻放大器12、固定液中戊二醛的常用濃度為（C）A 0.5% B 2.0% C 2.5% D 4% E 10%13、下面對透射電鏡描述不正確的是（D）A 利用透射電子成像B 觀察細胞內部超微結構 C 可觀察負染標本D 景深長、立體感強E 分辨率高，性能最完善14、透射電鏡的反差取決于樣品對（B）的散射能力A 二次電子 B 入射電子 C 透射電子D 散射電子 E 反射電子15、觀察生物樣品時，透射電鏡的加速電壓一般為（C）A 20-50KV B 50-80KV C 80-100KV D 100-120KV E 120KV以上16、超薄切片是指厚度小于（ D）的切片A 200nm B 300nm C 400nm D 100nm E 500nm1