二仙湯及其組方中藥對幼年大鼠腎上腺雌激素受體表達的影響

1、二仙湯及其組方中藥對幼年大鼠腎上腺雌激素受體表達的影響 作者：陶仕英,牛建昭,王繼峰,趙丕文【摘要】 目的 通過觀察二仙湯及其組方中藥對幼年大鼠腎上腺雌激素受體(ER)表達的影響,探討其對腎上腺功能的影響機制。方法 幼年SD大鼠54只,分為正常對照、陽性對照、二仙湯、淫羊藿、仙茅、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏和知母9組,各組給藥6 d后麻醉大鼠,取血清測量睪酮的含量,分離摘取雙側(cè)腎上腺,稱重后常規(guī)石蠟包埋切片,行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果 陽性對照組、二仙湯組腎上腺系數(shù)增加,二仙湯組、淫羊藿組、仙茅組和知母組血清睪酮水平降低,以二仙湯組最明顯(P<0.01)。ER主要分布于腎上腺皮質(zhì)球狀帶和束

2、狀帶細胞的細胞質(zhì)中,二仙湯組平均光密度值升高,而陽性對照組下降;ER主要分布于腎上腺皮質(zhì)球狀帶和束狀帶細胞的細胞核中,二仙湯組、淫羊藿組、仙茅組和知母組平均光密度值與陽性對照組比較下降。結(jié)論 二仙湯及其方中溫腎藥(淫羊藿、仙茅)和滋陰藥(知母)通過影響不同類型ER在腎上腺皮質(zhì)中的分布發(fā)揮植物雌激素樣作用, 【關(guān)鍵詞】 二仙湯;腎上腺;雌激素受體;大鼠Abstract：Objective To explore the possible functional mechanism of Er-xian Decoction and its component herbs on the expressi

3、on of extrogen receptor (ER) in adrenal development rats. Methods Fifty-four development female SD rats were randomly divided into nine groups：normal control group (A), positive control group (B), Er-xian Decoction group (C), Herba Epimedii group (D), Rhizoma Curculiginis group (E), Radix Morindae O

4、fficinalis group (F), Radix Angelicae Sinensis group (G), Cortex Phellodendri group (H), Rhizoma Anemarrhenae group (I). After the rats were administrated for six days, serum were got to measure testosterone (T). Bilateral adrenal gland was weighed and embedded by paraffin. Mean optical density (MOD

5、) were studied by the immunohistochemical method and image analyzing system. Results The adrenal coefficient was increased in group B and C, and the level of T was decreased in group C, D, E and I. ER was mainly observed in the cytoplasm of zona glomerulosa and zona fasciculate. MOD in group C was i

6、ncreased while declined in group B. ER was mainly observed in nucleus of zona glomerulosa and zona fasciculate. MOD in group C, D, E and I was less than group B. Conclusion Er-xian Decoction and its component herbs of warming Shen (Herba Epimedii, Rhizoma Curculiginis) and nourishing Yin (Rhizoma An

7、emarrhenae) play a phytoestrogen role by influencing the expression of ER and ER in the adrenal cortex.Key words：Er-xian Decoction;adrenal gland;estrogen receptor;rat二仙湯是名醫(yī)張伯訥教授20世紀(jì)中期創(chuàng)制的方劑,臨床主要用于治療圍絕經(jīng)綜合征等腎陽虛所致病癥,具有溫補腎陽、改善體內(nèi)雌激素分泌的作用1。體內(nèi)產(chǎn)生雌激素的器官有卵巢、腎上腺和胎盤。因此,在絕經(jīng)后的婦女中,雖然卵巢功能已衰退,但體內(nèi)仍可檢測到一定量的雌激素。已有研究表明,雌

8、激素主要通過雌激素受體(ER)發(fā)揮作用,ER在不同組織分布、數(shù)量、種類不同2。本實驗通過觀察二仙湯及其組方中藥對幼年大鼠腎上腺ER的影響,探討二仙湯的植物雌激素樣作用,為二仙湯應(yīng)用于圍絕經(jīng)綜合征的治療提供實驗依據(jù)。1 實驗材料1.1 動物SD雌性未成年正常大鼠54只,出生后21 d(剛斷乳),體重5060 g,購自北京維通利華實驗動物中心,合格證號：SCXK京(2007-0001)。實驗期間飼喂在二級動物室,溫度(25±1)。1.2 藥物淫羊藿、仙茅、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏、知母6味中藥為免煎顆粒劑,首創(chuàng)大地藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。蒸餾水溶解,6味中藥分別配制成原藥材含量為0.1 g/mL藥液

9、;二仙湯按淫羊藿、仙茅、巴戟天當(dāng)歸、黃柏、知母為32配制成原藥材含量1 g/mL藥液;陽性藥物為己烯雌酚(批號20080104),0.5 mg×100片/瓶,合肥久聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)。以上藥物均購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院。1.3 試劑一抗：ER(MC-20)和ER(H-150)為Santa Cruz公司產(chǎn)品;過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒(SP-9001)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;血清睪酮(T)檢測試劑盒購自北京華英生物技術(shù)研究所。2 實驗方法2.1 分組與給藥將實驗動物按體重均衡和隨機的原則分為9組：正常對照組、陽性對照組、二仙湯組以及6個單味藥組。實驗動物適應(yīng)性飼

10、養(yǎng)3 d后開始實驗。正常對照組給予等體積蒸餾水;陽性對照組按0.18 mg/(kg·d)給予己烯雌酚;二仙湯組按7.5 g/(kg·d)給藥;淫羊藿、仙茅、巴戟天組按1.5 g/(kg·d)給藥;當(dāng)歸、黃柏和知母組按1.0 g/(kg·d)給藥。灌胃分早、晚2次進行,給藥均持續(xù)6 d。2.2 動物取材與血清提取給藥6 d,處死前禁食12 h。用10%水合氯醛按4 mL/kg腹腔注射麻醉,沿大鼠腹正中線打開腹腔,自腹主動脈取血,經(jīng)室溫靜置2 h后,3 000 r/min離心10 min,取其上清液,分別保存于EP管中,-20 保存?zhèn)溆?。將腎上腺與周圍組織完

11、全剝離后取出,稱重,用中性甲醛固定后制成石蠟切片。2.3 血清睪酮的測定具體步驟參照所購試劑盒說明書。2.4 免疫組織化學(xué)染色步驟石蠟切片脫蠟至水,微波修復(fù)抗原10 min;入3%過氧化氫室溫孵育30 min;正常山羊血清封閉液室溫孵育20 min,傾去,分別用兔抗大鼠ER或ER抗體(1150,Santa Cruz)孵育切片(4 ,過夜);羊抗兔二抗37 孵育30 min,辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37孵育30 min,DAB染色。每步驟間用0.O1 mol/L PBS充分洗滌,常規(guī)脫水,透明,封片,光鏡下觀察,攝片。染成棕黃色顆粒者為陽性。陰性對照采用PBS代替一抗孵育切片。2.5 圖像分析

12、采用通用醫(yī)學(xué)圖像分析儀,光鏡下觀察各組染色結(jié)果,用NIS-Elements Basic Research數(shù)據(jù)分析軟件分析相應(yīng)抗體的表達量,每組取6張切片,每張切片取5個視野,計算每視野陽性染色平均光密度值(Mean Optical Density,MOD)。3 統(tǒng)計學(xué)方法所有統(tǒng)計資料用(統(tǒng))±s表示,統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11.5軟件,單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。4 結(jié)果4.1 對大鼠腎上腺ER、ER表達的影響采用免疫組織化學(xué)法檢測。ER在各組大鼠的腎上腺皮質(zhì)中均有表達,而在髓質(zhì)中則未見表達,主要表達于腎上腺皮質(zhì)的細胞質(zhì)中,以球狀帶和束狀帶為主,呈深

13、棕黃色顆粒狀,網(wǎng)狀帶亦有表達,呈淺黃色顆粒狀。ER主要表達于各組大鼠的腎上腺皮質(zhì)的細胞核中,而在髓質(zhì)中未見表達。以球狀帶和束狀帶為主,呈深棕黃色,網(wǎng)狀帶亦有表達,呈淺黃色。結(jié)果見表1。表1 各組大鼠腎上腺中ER、ER的表達(達)±s)注：與陽性對照組比較,#P<0.05,#P<0.01;與正常對照組比較,*P<0.05,*P<0.01(下同)4.2 對腎上腺系數(shù)和血清睪酮的影響(見表2)表2 各組大鼠腎上腺系數(shù)和血清T含量比較(腎)±s)5 討論腎上腺是體內(nèi)的一對重要的內(nèi)分泌腺。在組織學(xué)上,腎上腺由周圍的皮質(zhì)和中央的髓

14、質(zhì)構(gòu)成。皮質(zhì)根據(jù)組成細胞的排列方式和功能的不同由外向內(nèi)依次為球狀帶、束狀帶、網(wǎng)狀帶。網(wǎng)狀帶可分泌一定量的雄烯二酮,通過芳香化酶轉(zhuǎn)化為雌酮,也可被17-醇甾-脫氫酶轉(zhuǎn)化成睪酮,睪酮再被芳香化成為雌二醇3。本實驗采用腎上腺系數(shù)而非腎上腺濕重,旨在消除大鼠體重因素產(chǎn)生的誤差。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：陽性對照組、二仙湯組腎上腺系數(shù)均增加。對血清T水平的影響,二仙湯組降低最明顯,方中溫腎藥(淫羊藿、仙茅)和滋陰瀉火藥(知母)亦使T水平降低。因此,我們推測是否與植物雌激素的作用機制有關(guān)。雌激素是類固醇激素,透過細胞膜進入細胞內(nèi),與細胞質(zhì)內(nèi)ER上的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合,并使受體二聚體化,結(jié)合后的復(fù)合物穿過核膜,在核內(nèi),ER上的

15、DNA結(jié)合區(qū)與靶基因啟動子上的雌激素應(yīng)答元件結(jié)合,從而啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄,從而加速蛋白質(zhì)的合成,使細胞增生4。在我們的研究中,應(yīng)用免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)ER主要分布于腎上腺皮質(zhì)球狀帶和束狀帶細胞的細胞質(zhì)中,其中全方組表達量明顯升高,因此,全方組腎上腺系數(shù)增加。而陽性組雖然ER表達量明顯下降,但其系數(shù)亦明顯升高,可能是己烯雌酚發(fā)揮作用的途徑與機制與植物雌激素不同,還需進一步研究。ER主要位于腎上腺皮質(zhì)球狀帶和束狀帶細胞的細胞核,網(wǎng)狀帶亦有少量分布,這與薛氏等5研究結(jié)果相一致。與陽性對照組比較,全方組、淫羊藿組、仙茅組和知母組均降低,進一步推測己烯雌酚與植物雌激素作用機制的可能不一致。Kuiper GG

16、等6研究表明,植物雌激素對ER的親和力遠高于ER。另外,Brookes JD等7研究發(fā)現(xiàn),植物雌激素作用于與合成雌激素相關(guān)的酶,如5-二氫睪酮和3-羥類固醇脫氫酶,從而影響體內(nèi)激素的合成。因此,我們推測二仙湯及其組方中藥淫羊藿、仙茅和知母可能通過影響這些酶的活性,從而使腎上腺皮質(zhì)球狀帶分泌的睪酮進一步轉(zhuǎn)化為雌激素,使血清睪酮含量下降。【參考文獻】 1 王續(xù)武.二仙湯加減治療女性更年期綜合征40例小結(jié)J.甘肅中醫(yī), 2000,13(6)：41.2 Kuiper GG, Carlsson B, Grandien K, et al. Comparison of the ligand binding

17、specificity and transcript tissue distribution of estrogen receptors alpha and betaJ. Endocrinology,1997,138(3)：863-870.3 王淑貞.婦產(chǎn)科理論與實踐M.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社,1995.98.4 Morito K, Hirose T, Kinjo J, et al. Interaction of phytoestrogens with estrogen receptors alpha and beta()J. Biol Pharm Bull,2002,25(1)：48-52.5 薛曉鷗,師莉莉,牛建昭,等.卵巢切除對大鼠腎上腺雌激素受體亞型表達的影響J.解剖學(xué)報,2008,39(2)：223-226.6 Kuiper GG, Lemmen JG, Carlsson B, et al. Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens