人膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cDNA克隆原核表達(dá)及抗血清制備

1、人膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cDNA克隆、 原核表達(dá)及抗血清制備【摘要】 目的: 克隆人膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CETP） cDNA序列, 利用大腸桿菌表達(dá)人CETP, 制備兔抗人CETP的多克隆抗血清。方法: 采用RTPCR方法, 將人CETP基因克隆到pET30b(+)上, 構(gòu)建CETP原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌, IPTG誘導(dǎo)表達(dá), 切膠純化蛋白后免疫家兔, 制備CETP抗血清, 以ELISA、 Western blot、 細(xì)胞免疫熒光方法對(duì)抗血清效價(jià)及特異性進(jìn)行鑒定。結(jié)果: SDSPAGE分析表明, 經(jīng)IPTG誘導(dǎo), CETP基因在大腸桿菌BL21(DE3)的包涵體中高效表達(dá), 最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為4

2、 h。將切膠純化的蛋白免疫家兔, ELISA法測(cè)定的抗血清效價(jià)為15.12×105。Western blot及細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示, 抗血清可以與CETP原核及真核表達(dá)蛋白特異結(jié)合。結(jié)論: 成功地將CETP進(jìn)行了原核表達(dá)并制備了高效價(jià)、 高特異性的兔抗人CETP抗血清, 為進(jìn)一步研究CETP的結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 原核表達(dá) 抗血清Abstract AIM: To clone human cholesteryl ester transfer protein (CETP) cDNA, express and purify human CETP in E

3、.coli and prepare CETPspecific rabbit antiserum. METHODS: by RTPCR method, the encoding sequence of human cholesteryl ester transfer protein (CETP) was cloned into pET30b(+) vector. Then BL21 (DE3) of E.coli transformed with recombinant vector pETCETP was induced to express CETP in high level by IPT

4、G. The expressed protein was purified from SDSpolyacrylamide gel, and the antiserum against CETP was raised in rabbit. The titer and specificity of rabbit antiserum were evaluated by ELISA, Western blot and immunofluorescence assay. RESULTS: The results of SDSPAGE showed that CETP was expressed in t

5、he form of inclusion bodies in BL21(DE3) and the best expression time was about 4 hours. The titer of the rabbit antiserum prepared with CETP purified from SDSPAGE was 15.12×105 and the antiserum reacted specifically with CETP expressed in BL21 (DE3) and COS7 cells. CONCLUSION: The preparation

6、of the specific rabbit antiserum against CETP will be valuable for the study on the structure and function of human CETP.Keywordscholesteryl ester transfer protein; prokaryotic expression; antiserum摘 要 目的: 克隆人膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CETP） cDNA序列, 利用大腸桿菌表達(dá)人CETP, 制備兔抗人CETP的多克隆抗血清。方法: 采用RTPCR方法, 將人CETP基因克隆到pET30b(+)上

7、, 構(gòu)建CETP原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌, IPTG誘導(dǎo)表達(dá), 切膠純化蛋白后免疫家兔, 制備CETP抗血清, 以ELISA、 Western blot、 細(xì)胞免疫熒光方法對(duì)抗血清效價(jià)及特異性進(jìn)行鑒定。結(jié)果: SDSPAGE分析表明, 經(jīng)IPTG誘導(dǎo), CETP基因在大腸桿菌BL21(DE3)的包涵體中高效表達(dá), 最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為4 h。將切膠純化的蛋白免疫家兔, ELISA法測(cè)定的抗血清效價(jià)為15.12×105。Western blot及細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示, 抗血清可以與CETP原核及真核表達(dá)蛋白特異結(jié)合。結(jié)論: 成功地將CETP進(jìn)行了原核表達(dá)并制備了高效價(jià)、 高特異性的

8、兔抗人CETP抗血清, 為進(jìn)一步研究CETP的結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白; 原核表達(dá); 抗血清 人膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（cholesteryl ester transfer protein, CETP）是一個(gè)極度疏水的糖蛋白, 包含476個(gè)氨基酸, 非極性氨基酸占45%1。在逆向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中, CETP促進(jìn)膽固醇酯從高密度脂蛋白（HDL）轉(zhuǎn)運(yùn)到含載脂蛋白B（apoB）的脂蛋白顆粒中, 同時(shí)反向轉(zhuǎn)運(yùn)甘油三脂, 因參與了血漿脂蛋白膽固醇水平的調(diào)控和脂蛋白顆粒的重塑, CETP在脂蛋白代謝中的作用近年來倍受重視2。然而, 到目前為止, 盡管人們已經(jīng)獲得了幾種CETP的抑制劑3, 但對(duì)CE

9、TP究竟是抗動(dòng)脈粥樣硬化(AS)因子還是致AS因子一直存在爭(zhēng)議。在逆向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中, HDL顆粒內(nèi)的膽固醇酯被CETP轉(zhuǎn)運(yùn)到含apoB的脂蛋白中, 隨后, 這些脂蛋白被肝吸收分解, 由于促進(jìn)了外周組織多余膽固醇向肝的運(yùn)送, 避免了膽固醇在血管內(nèi)的富集, CETP被認(rèn)為是抗動(dòng)脈粥樣硬化的。然而, 另一方面, 這個(gè)過程直接導(dǎo)致了具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)水平的下降, 因此, CETP又被認(rèn)為是促動(dòng)脈粥樣硬化的。大量的流行病學(xué)及動(dòng)物研究顯示, CETP抗動(dòng)脈粥樣硬化和促動(dòng)脈粥樣硬化特性之間可能存在內(nèi)在平衡, 其確切功能依賴于代謝環(huán)境和遺傳背景1。 我們?cè)谝寻l(fā)表的人CETP

10、 cDNA序列基礎(chǔ)上, 通過RTPCR方法擴(kuò)增得到CETP成熟蛋白編碼序列并克隆到原核表達(dá)載體中, 化學(xué)誘導(dǎo)重組蛋白的高效表達(dá), 并制備出相應(yīng)的特異性抗血清, 為深入研究CETP在AS中的確切功能以及CETP蛋白水平的檢測(cè)等奠定了基礎(chǔ)。1 材料和方法1.1 材料人肝組織來自北京協(xié)和醫(yī)院外科肝部分切除的手術(shù)標(biāo)本。新西蘭大耳白兔(雄性, 體質(zhì)量2.53.0 kg)購自中國(guó)藥品生物制品檢定所。pET30b(+)質(zhì)粒載體購自Novagen公司。BL21(DE3)菌株為本室凍存。限制性內(nèi)切酶及pyrobest DNA聚合酶等工具酶購自TaKaRa公司。SuperScript FirstStrand Sy

11、nthesis System for RTPCR及pcDNA3.1/mycHis(-)A質(zhì)粒購自Invitrogen公司。弗氏完全佐劑、不完全佐劑和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。蛋白標(biāo)準(zhǔn)購自Fermentas公司。COS7細(xì)胞購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。高效真核轉(zhuǎn)染試劑盒購自威格拉斯儀器有限公司。BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒及HRP和FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自Santa Cruze公司。1.2 方法1.2.1 CETP cDNA克隆提取人肝組織總RNA并純化mRNA, 將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 根據(jù)參考文獻(xiàn)4中的人CETP cDNA序

12、列設(shè)計(jì)引物: 5GGAATTCCATATGTGCTCCAAAGGCACCTCGC3（含Nde I位點(diǎn)和起始密碼子）; 5ACGCGTCGACGCTCAAGCTCTGGAGGAAATCCAC3（含Sal I位點(diǎn)和終止密碼子）。用Pyrobest DNA polymerase進(jìn)行PCR: 94 4 min; 94 1 min, 56 1 min, 72 3 min, 2 個(gè)循環(huán); 94 1 min, 68 1 min, 72 3 min, 28 個(gè)循環(huán), 最后72延伸10 min, 得到人CETP RTPCR產(chǎn)物, 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.2.2 CETP原核表達(dá)載體pETCETP的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物電泳

13、回收后, 與pET30b(+)質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行Nde 和Sal I雙酶切。將酶切后的PCR產(chǎn)物與載體連接, 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）, 小量提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定, 鑒定引物為: 5CCAGCAGCCAGGTGGAGC3, 5GGAGGTCCTCTGAGACATTCTTG3。將PCR鑒定為陽性的克隆送北京三博遠(yuǎn)志生物有限公司測(cè)序。1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將CETP原核表達(dá)載體pETCETP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3), 挑取單克隆進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)（1 mmol/L）, 收集菌體, 超聲破碎, 離心, 分別將上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE電泳分析, 確定CETP的表達(dá)形式, 之后將

14、CETP原核表達(dá)菌株分別誘導(dǎo)表達(dá)07 h, 超聲破碎菌體后進(jìn)行SDSPAGE電泳, 以確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間。1.2.4 重組蛋白的純化將pETCETP轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá), 離心收菌, 超聲破碎, 收集并洗滌包涵體, 用8 mol/L尿素溶解后進(jìn)行SDSPAGE電泳分離。從膠的兩邊分別切一條膠, 于速染液中染色約10 min, 脫色。比照染色的兩邊膠條, 將未染色膠對(duì)應(yīng)于目的蛋白的部分切下來, 搗碎。加入適量的TrisHCl buffer（10 mmol/L, pH8.0）, 4搖床上搖擺過夜。收集上清, SDSPAGE電泳鑒定蛋白純度,定量后凍存于-20, 作為免疫原。1.2.5 兔抗C

15、ETP抗血清的制備用1 mg/kg抗原加等體積完全弗氏佐劑以背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射進(jìn)行基礎(chǔ)免疫, 2周后用0.5mg/kg抗原加不完全佐劑進(jìn)行加強(qiáng)免疫, 以后間隔710d加強(qiáng)1次, 加強(qiáng)2次后取耳緣靜脈血, 用間接ELISA法進(jìn)行抗體效價(jià)檢測(cè)。效價(jià)>14000時(shí)動(dòng)脈放血, 43500 r/min離心10 min分離血清, 分裝凍存于-20。1.2.6 抗血清效價(jià)的檢測(cè)通過間接ELISA法測(cè)定了抗血清的效價(jià)。以純化的CETP為抗原包被, 4過夜, 洗滌。加不同稀釋度的待測(cè)抗血清, PBS為空白對(duì)照, 免疫前血清為陰性對(duì)照, 37 2 h, 洗滌。加HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（11000稀釋度

16、） 37 2 h, 洗滌。加新配制的OPD（鄰苯二胺）底物溶液37 30 min, 加終止液, 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定A490值, P/V>2.1, 即抗血清A值比陰性對(duì)照血清A值大2.1倍以上時(shí)為陽性。1.2.7 抗血清特異性的Western blot及細(xì)胞免疫熒光檢測(cè) 將BL21(DE3)菌株、 轉(zhuǎn)化pET30b(+)空質(zhì)粒的菌株、 轉(zhuǎn)化pETCETP質(zhì)粒的菌株進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá), 收集菌體, 超聲破碎, 收集并洗滌包涵體, 用8 mol/L尿素溶解后進(jìn)行SDSPAGE電泳分離, 并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上, 依次加12000的兔抗血清（4孵育過夜, PBST洗膜3次, 每次10

17、 min）及15000的HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（室溫孵育1 h, 洗膜同上）。然后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒的試劑顯影, 并在暗室中用X光片感光1 min5。 為了檢測(cè)抗血清與真核表達(dá)CETP的反應(yīng)性, 將CETP cDNA蛋白編碼序列克隆入pcDNA3.1/mycHis(-)A載體中, 構(gòu)建CETP真核表達(dá)載體pcDNA3.1CETP（方法同CETP原核表達(dá)載體構(gòu)建）, 分別將pcDNA3.1CETP、 pcDNA3.1/mycHis(-)A質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞, 72 h后進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測(cè), 一抗為本研究制備的兔抗人CETP多克隆抗血清, 二抗為FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG6。2 結(jié)

18、果2.1 CETP cDNA克隆及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建人肝組織mRNA經(jīng)RTPCR反應(yīng)擴(kuò)增出的PCR片段約為1500 bp, 與預(yù)計(jì)結(jié)果相符（圖1）。 將PCR產(chǎn)物克隆入pET30b(+)質(zhì)粒載體, 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5, 挑取單菌落小量提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。鑒定結(jié)果顯示, 以人肝cDNA及所選菌落的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增均得到1條約500 bp的片段, 與預(yù)計(jì)結(jié)果一致。將PCR鑒定為陽性的克隆送公司測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果用NCBI的BLAST程序分析, 結(jié)果表明, 獲得的CETP蛋白編碼序列同GenBank中登錄的序列一致, 且在原核表達(dá)載體中的連接方向和閱讀框架正確。2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表

19、達(dá)與純化 將pETCETP轉(zhuǎn)化BL21（DE3）菌株, IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3 h后, 將菌體超聲破碎后所得上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE電泳。在pETCETP轉(zhuǎn)化菌株超聲破碎后的沉淀中有1條Mr約53000的特異蛋白帶, 該蛋白Mr與根據(jù)CETP cDNA蛋白編碼序列所推導(dǎo)的蛋白Mr相符, 說明CETP能夠在BL21（DE3）菌株中表達(dá), 且在包涵體中表達(dá)（圖2）。 將CETP原核表達(dá)菌株分別誘導(dǎo)表達(dá)07 h, 超聲破碎菌體后收集包涵體進(jìn)行SDSPAGE電泳, 確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間。從圖中可看出, 在誘導(dǎo)表達(dá)4 h后, CETP的表達(dá)量最大（圖3）。 將CETP原核表達(dá)菌株進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá), 切膠

20、純化目的蛋白, SDSPAGE電泳檢測(cè)蛋白純度。結(jié)果顯示, 純化回收的蛋白Mr只在約53000處有1條特異的蛋白帶, 經(jīng)Quantity One軟件分析, 蛋白純度達(dá)到了100%, 可以用作免疫原（圖4）。2.3 抗血清的效價(jià)檢測(cè)將純化的CETP免疫家兔制備抗血清, 間接ELISA法檢測(cè)效價(jià), 結(jié)果表明, 兔抗人CETP抗血清的效價(jià)為15.12×105。2.4 抗血清的特異性鑒定采用Western blot檢測(cè)抗血清與CETP原核表達(dá)蛋白的反應(yīng)性, 結(jié)果表明(圖5), CETP抗血清與轉(zhuǎn)化pETCETP質(zhì)粒菌株的包涵體蛋白反應(yīng), 產(chǎn)生一條Mr約為53000的清晰著色帶, 而與其他對(duì)照

21、不發(fā)生反應(yīng), 由此可見, 所產(chǎn)生的抗血清可以與原核表達(dá)的CETP特異結(jié)合。通過細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)抗血清與CETP真核表達(dá)蛋白的反應(yīng)性, 結(jié)果顯示（圖6）, 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1CETP重組質(zhì)粒的COS7細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)綠色熒光, 而對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1/mycHis(-)A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則沒有, 說明本研究制備的兔抗人CETP抗血清可以與真核表達(dá)的CETP蛋白發(fā)生特異反應(yīng)結(jié)合。3 討論 為了得到特異性比較高的CETP抗血清, 我們克隆了人CETP cDNA成熟蛋白編碼序列并進(jìn)行了原核表達(dá)。結(jié)果顯示, 人CETP的原核表達(dá)產(chǎn)物主要以不可溶的形式存在于大腸桿菌的包涵體中, 這可能與CETP蛋白Mr大且疏

22、水性氨基酸含量比較高有關(guān)。在CETP原核表達(dá)蛋白的純化中, 首先使用鎳離子柱進(jìn)行了純化, 經(jīng)過條件優(yōu)化后, 純化的蛋白中仍有較多的雜蛋白（結(jié)果沒有顯示）, 所以最終采用了切膠純化回收的方法。結(jié)果表明, 該法操作簡(jiǎn)便、 蛋白損失小, 純化得到的蛋白純度高, 完全符合制備抗血清的要求。純化抗原免疫家兔后, 得到的抗血清效價(jià)很高, 且可以與CETP原核及真核表達(dá)蛋白發(fā)生特異反應(yīng), 說明我們得到的抗血清為CETP的特異性抗血清。 CETP是一個(gè)參與脂質(zhì)代謝的重要蛋白,但其在AS中的確切功能還不清楚。除與AS密切相關(guān)外,CETP還和很多其他疾病如冠心病、 糖尿病、腎病等也密切相關(guān)。CETP與冠心病之間的

23、關(guān)系隨代謝環(huán)境而定。當(dāng)HDLC水平較低時(shí), CETP活性與冠心病風(fēng)險(xiǎn)之間正相關(guān), 當(dāng)HDLC水平明顯升高時(shí), 不管CETP活性如何, 冠心病的風(fēng)險(xiǎn)都比較低7。糖尿病患者血清CETP活性明顯高于健康人, 呈現(xiàn)動(dòng)脈硬化性脂蛋白譜改變, 心腦血管疾病的危險(xiǎn)性增加8。慢性腎臟疾病患者中, 血清CETP活性明顯高于正常對(duì)照組, 常伴有脂質(zhì)代謝異常, 并有較高的AS發(fā)病率9。盡管CETP與這些疾病的確切關(guān)系還在研究中, 但隨著CETP功能的進(jìn)一步闡明, CETP水平可能成為這些疾病預(yù)防和臨床監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。本研究中,我們獲得了大量CETP原核表達(dá)蛋白及CETP特異性抗血清, 為進(jìn)一步研究CETP在AS等疾

24、病中的確切功能及CETP水平的檢測(cè)提供了有力的工具。【參考文獻(xiàn)】 1 Sviridov D, Nestel PJ. Genetic factors affecting HDL levels, structure, metabolism and functionJ. Curr Opin Lipidol, 2007, 18(2): 157-163.2 Ohashi R, Mu H, Wang X, et al. Reverse cholesterol transport and cholesterol efflux in atherosclerosisJ. QJM, 2005, 98(12): 845-856.3 El Harchaoui K, van der Steeg WA, Stroes ES, et al. The role of CETP inhibition in dyslipidemiaJ. Curr Atheroscler Rep, 2007, 9