人膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白的cDNA克隆原核表達及抗血清制備

1、人膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白的cDNA克隆、 原核表達及抗血清制備【摘要】 目的: 克隆人膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白（CETP） cDNA序列, 利用大腸桿菌表達人CETP, 制備兔抗人CETP的多克隆抗血清。方法: 采用RTPCR方法, 將人CETP基因克隆到pET30b(+)上, 構(gòu)建CETP原核表達載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌, IPTG誘導表達, 切膠純化蛋白后免疫家兔, 制備CETP抗血清, 以ELISA、 Western blot、 細胞免疫熒光方法對抗血清效價及特異性進行鑒定。結(jié)果: SDSPAGE分析表明, 經(jīng)IPTG誘導, CETP基因在大腸桿菌BL21(DE3)的包涵體中高效表達, 最佳誘導表達時間為4

2、 h。將切膠純化的蛋白免疫家兔, ELISA法測定的抗血清效價為15.12×105。Western blot及細胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示, 抗血清可以與CETP原核及真核表達蛋白特異結(jié)合。結(jié)論: 成功地將CETP進行了原核表達并制備了高效價、 高特異性的兔抗人CETP抗血清, 為進一步研究CETP的結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白 原核表達 抗血清Abstract AIM: To clone human cholesteryl ester transfer protein (CETP) cDNA, express and purify human CETP in E

3、.coli and prepare CETPspecific rabbit antiserum. METHODS: by RTPCR method, the encoding sequence of human cholesteryl ester transfer protein (CETP) was cloned into pET30b(+) vector. Then BL21 (DE3) of E.coli transformed with recombinant vector pETCETP was induced to express CETP in high level by IPT

4、G. The expressed protein was purified from SDSpolyacrylamide gel, and the antiserum against CETP was raised in rabbit. The titer and specificity of rabbit antiserum were evaluated by ELISA, Western blot and immunofluorescence assay. RESULTS: The results of SDSPAGE showed that CETP was expressed in t

5、he form of inclusion bodies in BL21(DE3) and the best expression time was about 4 hours. The titer of the rabbit antiserum prepared with CETP purified from SDSPAGE was 15.12×105 and the antiserum reacted specifically with CETP expressed in BL21 (DE3) and COS7 cells. CONCLUSION: The preparation

6、of the specific rabbit antiserum against CETP will be valuable for the study on the structure and function of human CETP.Keywordscholesteryl ester transfer protein; prokaryotic expression; antiserum摘 要 目的: 克隆人膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白（CETP） cDNA序列, 利用大腸桿菌表達人CETP, 制備兔抗人CETP的多克隆抗血清。方法: 采用RTPCR方法, 將人CETP基因克隆到pET30b(+)上

7、, 構(gòu)建CETP原核表達載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌, IPTG誘導表達, 切膠純化蛋白后免疫家兔, 制備CETP抗血清, 以ELISA、 Western blot、 細胞免疫熒光方法對抗血清效價及特異性進行鑒定。結(jié)果: SDSPAGE分析表明, 經(jīng)IPTG誘導, CETP基因在大腸桿菌BL21(DE3)的包涵體中高效表達, 最佳誘導表達時間為4 h。將切膠純化的蛋白免疫家兔, ELISA法測定的抗血清效價為15.12×105。Western blot及細胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示, 抗血清可以與CETP原核及真核表達蛋白特異結(jié)合。結(jié)論: 成功地將CETP進行了原核表達并制備了高效價、 高特異性的

8、兔抗人CETP抗血清, 為進一步研究CETP的結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白; 原核表達; 抗血清 人膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白（cholesteryl ester transfer protein, CETP）是一個極度疏水的糖蛋白, 包含476個氨基酸, 非極性氨基酸占45%1。在逆向膽固醇轉(zhuǎn)運中, CETP促進膽固醇酯從高密度脂蛋白（HDL）轉(zhuǎn)運到含載脂蛋白B（apoB）的脂蛋白顆粒中, 同時反向轉(zhuǎn)運甘油三脂, 因參與了血漿脂蛋白膽固醇水平的調(diào)控和脂蛋白顆粒的重塑, CETP在脂蛋白代謝中的作用近年來倍受重視2。然而, 到目前為止, 盡管人們已經(jīng)獲得了幾種CETP的抑制劑3, 但對CE

9、TP究竟是抗動脈粥樣硬化(AS)因子還是致AS因子一直存在爭議。在逆向膽固醇轉(zhuǎn)運中, HDL顆粒內(nèi)的膽固醇酯被CETP轉(zhuǎn)運到含apoB的脂蛋白中, 隨后, 這些脂蛋白被肝吸收分解, 由于促進了外周組織多余膽固醇向肝的運送, 避免了膽固醇在血管內(nèi)的富集, CETP被認為是抗動脈粥樣硬化的。然而, 另一方面, 這個過程直接導致了具有抗動脈粥樣硬化作用的高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)水平的下降, 因此, CETP又被認為是促動脈粥樣硬化的。大量的流行病學及動物研究顯示, CETP抗動脈粥樣硬化和促動脈粥樣硬化特性之間可能存在內(nèi)在平衡, 其確切功能依賴于代謝環(huán)境和遺傳背景1。 我們在已發(fā)表的人CETP

10、 cDNA序列基礎(chǔ)上, 通過RTPCR方法擴增得到CETP成熟蛋白編碼序列并克隆到原核表達載體中, 化學誘導重組蛋白的高效表達, 并制備出相應(yīng)的特異性抗血清, 為深入研究CETP在AS中的確切功能以及CETP蛋白水平的檢測等奠定了基礎(chǔ)。1 材料和方法1.1 材料人肝組織來自北京協(xié)和醫(yī)院外科肝部分切除的手術(shù)標本。新西蘭大耳白兔(雄性, 體質(zhì)量2.53.0 kg)購自中國藥品生物制品檢定所。pET30b(+)質(zhì)粒載體購自Novagen公司。BL21(DE3)菌株為本室凍存。限制性內(nèi)切酶及pyrobest DNA聚合酶等工具酶購自TaKaRa公司。SuperScript FirstStrand Sy

11、nthesis System for RTPCR及pcDNA3.1/mycHis(-)A質(zhì)粒購自Invitrogen公司。弗氏完全佐劑、不完全佐劑和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。蛋白標準購自Fermentas公司。COS7細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞中心。高效真核轉(zhuǎn)染試劑盒購自威格拉斯儀器有限公司。BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司。ECL化學發(fā)光試劑盒及HRP和FITC標記的山羊抗兔二抗購自Santa Cruze公司。1.2 方法1.2.1 CETP cDNA克隆提取人肝組織總RNA并純化mRNA, 將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 根據(jù)參考文獻4中的人CETP cDNA序

12、列設(shè)計引物: 5GGAATTCCATATGTGCTCCAAAGGCACCTCGC3（含Nde I位點和起始密碼子）; 5ACGCGTCGACGCTCAAGCTCTGGAGGAAATCCAC3（含Sal I位點和終止密碼子）。用Pyrobest DNA polymerase進行PCR: 94 4 min; 94 1 min, 56 1 min, 72 3 min, 2 個循環(huán); 94 1 min, 68 1 min, 72 3 min, 28 個循環(huán), 最后72延伸10 min, 得到人CETP RTPCR產(chǎn)物, 用于后續(xù)實驗。1.2.2 CETP原核表達載體pETCETP的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物電泳

13、回收后, 與pET30b(+)質(zhì)粒同時進行Nde 和Sal I雙酶切。將酶切后的PCR產(chǎn)物與載體連接, 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）, 小量提取質(zhì)粒進行PCR鑒定, 鑒定引物為: 5CCAGCAGCCAGGTGGAGC3, 5GGAGGTCCTCTGAGACATTCTTG3。將PCR鑒定為陽性的克隆送北京三博遠志生物有限公司測序。1.2.3 重組蛋白的誘導表達將CETP原核表達載體pETCETP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3), 挑取單克隆進行IPTG誘導表達（1 mmol/L）, 收集菌體, 超聲破碎, 離心, 分別將上清和沉淀進行SDSPAGE電泳分析, 確定CETP的表達形式, 之后將

14、CETP原核表達菌株分別誘導表達07 h, 超聲破碎菌體后進行SDSPAGE電泳, 以確定最佳誘導表達時間。1.2.4 重組蛋白的純化將pETCETP轉(zhuǎn)化菌株進行大量誘導表達, 離心收菌, 超聲破碎, 收集并洗滌包涵體, 用8 mol/L尿素溶解后進行SDSPAGE電泳分離。從膠的兩邊分別切一條膠, 于速染液中染色約10 min, 脫色。比照染色的兩邊膠條, 將未染色膠對應(yīng)于目的蛋白的部分切下來, 搗碎。加入適量的TrisHCl buffer（10 mmol/L, pH8.0）, 4搖床上搖擺過夜。收集上清, SDSPAGE電泳鑒定蛋白純度,定量后凍存于-20, 作為免疫原。1.2.5 兔抗C

15、ETP抗血清的制備用1 mg/kg抗原加等體積完全弗氏佐劑以背部皮內(nèi)多點注射進行基礎(chǔ)免疫, 2周后用0.5mg/kg抗原加不完全佐劑進行加強免疫, 以后間隔710d加強1次, 加強2次后取耳緣靜脈血, 用間接ELISA法進行抗體效價檢測。效價>14000時動脈放血, 43500 r/min離心10 min分離血清, 分裝凍存于-20。1.2.6 抗血清效價的檢測通過間接ELISA法測定了抗血清的效價。以純化的CETP為抗原包被, 4過夜, 洗滌。加不同稀釋度的待測抗血清, PBS為空白對照, 免疫前血清為陰性對照, 37 2 h, 洗滌。加HRP標記的羊抗兔二抗（11000稀釋度

16、） 37 2 h, 洗滌。加新配制的OPD（鄰苯二胺）底物溶液37 30 min, 加終止液, 用ELISA檢測儀測定A490值, P/V>2.1, 即抗血清A值比陰性對照血清A值大2.1倍以上時為陽性。1.2.7 抗血清特異性的Western blot及細胞免疫熒光檢測 將BL21(DE3)菌株、 轉(zhuǎn)化pET30b(+)空質(zhì)粒的菌株、 轉(zhuǎn)化pETCETP質(zhì)粒的菌株進行IPTG誘導表達, 收集菌體, 超聲破碎, 收集并洗滌包涵體, 用8 mol/L尿素溶解后進行SDSPAGE電泳分離, 并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上, 依次加12000的兔抗血清（4孵育過夜, PBST洗膜3次, 每次10

17、 min）及15000的HRP標記的山羊抗兔二抗（室溫孵育1 h, 洗膜同上）。然后用ECL化學發(fā)光試劑盒的試劑顯影, 并在暗室中用X光片感光1 min5。 為了檢測抗血清與真核表達CETP的反應(yīng)性, 將CETP cDNA蛋白編碼序列克隆入pcDNA3.1/mycHis(-)A載體中, 構(gòu)建CETP真核表達載體pcDNA3.1CETP（方法同CETP原核表達載體構(gòu)建）, 分別將pcDNA3.1CETP、 pcDNA3.1/mycHis(-)A質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染COS7細胞, 72 h后進行細胞免疫熒光檢測, 一抗為本研究制備的兔抗人CETP多克隆抗血清, 二抗為FITC標記的山羊抗兔IgG6。2 結(jié)

18、果2.1 CETP cDNA克隆及其原核表達載體的構(gòu)建人肝組織mRNA經(jīng)RTPCR反應(yīng)擴增出的PCR片段約為1500 bp, 與預(yù)計結(jié)果相符（圖1）。 將PCR產(chǎn)物克隆入pET30b(+)質(zhì)粒載體, 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5, 挑取單菌落小量提取質(zhì)粒進行PCR鑒定。鑒定結(jié)果顯示, 以人肝cDNA及所選菌落的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增均得到1條約500 bp的片段, 與預(yù)計結(jié)果一致。將PCR鑒定為陽性的克隆送公司測序, 測序結(jié)果用NCBI的BLAST程序分析, 結(jié)果表明, 獲得的CETP蛋白編碼序列同GenBank中登錄的序列一致, 且在原核表達載體中的連接方向和閱讀框架正確。2.2 重組蛋白的誘導表

19、達與純化 將pETCETP轉(zhuǎn)化BL21（DE3）菌株, IPTG誘導表達3 h后, 將菌體超聲破碎后所得上清和沉淀進行SDSPAGE電泳。在pETCETP轉(zhuǎn)化菌株超聲破碎后的沉淀中有1條Mr約53000的特異蛋白帶, 該蛋白Mr與根據(jù)CETP cDNA蛋白編碼序列所推導的蛋白Mr相符, 說明CETP能夠在BL21（DE3）菌株中表達, 且在包涵體中表達（圖2）。 將CETP原核表達菌株分別誘導表達07 h, 超聲破碎菌體后收集包涵體進行SDSPAGE電泳, 確定最佳誘導表達時間。從圖中可看出, 在誘導表達4 h后, CETP的表達量最大（圖3）。 將CETP原核表達菌株進行大量誘導表達, 切膠

20、純化目的蛋白, SDSPAGE電泳檢測蛋白純度。結(jié)果顯示, 純化回收的蛋白Mr只在約53000處有1條特異的蛋白帶, 經(jīng)Quantity One軟件分析, 蛋白純度達到了100%, 可以用作免疫原（圖4）。2.3 抗血清的效價檢測將純化的CETP免疫家兔制備抗血清, 間接ELISA法檢測效價, 結(jié)果表明, 兔抗人CETP抗血清的效價為15.12×105。2.4 抗血清的特異性鑒定采用Western blot檢測抗血清與CETP原核表達蛋白的反應(yīng)性, 結(jié)果表明(圖5), CETP抗血清與轉(zhuǎn)化pETCETP質(zhì)粒菌株的包涵體蛋白反應(yīng), 產(chǎn)生一條Mr約為53000的清晰著色帶, 而與其他對照

21、不發(fā)生反應(yīng), 由此可見, 所產(chǎn)生的抗血清可以與原核表達的CETP特異結(jié)合。通過細胞免疫熒光檢測抗血清與CETP真核表達蛋白的反應(yīng)性, 結(jié)果顯示（圖6）, 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1CETP重組質(zhì)粒的COS7細胞質(zhì)中出現(xiàn)綠色熒光, 而對照質(zhì)粒pcDNA3.1/mycHis(-)A轉(zhuǎn)染的細胞則沒有, 說明本研究制備的兔抗人CETP抗血清可以與真核表達的CETP蛋白發(fā)生特異反應(yīng)結(jié)合。3 討論 為了得到特異性比較高的CETP抗血清, 我們克隆了人CETP cDNA成熟蛋白編碼序列并進行了原核表達。結(jié)果顯示, 人CETP的原核表達產(chǎn)物主要以不可溶的形式存在于大腸桿菌的包涵體中, 這可能與CETP蛋白Mr大且疏

22、水性氨基酸含量比較高有關(guān)。在CETP原核表達蛋白的純化中, 首先使用鎳離子柱進行了純化, 經(jīng)過條件優(yōu)化后, 純化的蛋白中仍有較多的雜蛋白（結(jié)果沒有顯示）, 所以最終采用了切膠純化回收的方法。結(jié)果表明, 該法操作簡便、 蛋白損失小, 純化得到的蛋白純度高, 完全符合制備抗血清的要求。純化抗原免疫家兔后, 得到的抗血清效價很高, 且可以與CETP原核及真核表達蛋白發(fā)生特異反應(yīng), 說明我們得到的抗血清為CETP的特異性抗血清。 CETP是一個參與脂質(zhì)代謝的重要蛋白,但其在AS中的確切功能還不清楚。除與AS密切相關(guān)外,CETP還和很多其他疾病如冠心病、 糖尿病、腎病等也密切相關(guān)。CETP與冠心病之間的

23、關(guān)系隨代謝環(huán)境而定。當HDLC水平較低時, CETP活性與冠心病風險之間正相關(guān), 當HDLC水平明顯升高時, 不管CETP活性如何, 冠心病的風險都比較低7。糖尿病患者血清CETP活性明顯高于健康人, 呈現(xiàn)動脈硬化性脂蛋白譜改變, 心腦血管疾病的危險性增加8。慢性腎臟疾病患者中, 血清CETP活性明顯高于正常對照組, 常伴有脂質(zhì)代謝異常, 并有較高的AS發(fā)病率9。盡管CETP與這些疾病的確切關(guān)系還在研究中, 但隨著CETP功能的進一步闡明, CETP水平可能成為這些疾病預(yù)防和臨床監(jiān)測的重要指標。本研究中,我們獲得了大量CETP原核表達蛋白及CETP特異性抗血清, 為進一步研究CETP在AS等疾

24、病中的確切功能及CETP水平的檢測提供了有力的工具?！緟⒖嘉墨I】 1 Sviridov D, Nestel PJ. Genetic factors affecting HDL levels, structure, metabolism and functionJ. Curr Opin Lipidol, 2007, 18(2): 157-163.2 Ohashi R, Mu H, Wang X, et al. Reverse cholesterol transport and cholesterol efflux in atherosclerosisJ. QJM, 2005, 98(12): 845-856.3 El Harchaoui K, van der Steeg WA, Stroes ES, et al. The role of CETP inhibition in dyslipidemiaJ. Curr Atheroscler Rep, 2007, 9