實驗設(shè)計-外顯子的捕捉與鑒定

1、外顯子的捕捉與鑒定一、 實驗目的通過本實驗了解外顯子捕捉的實驗原理，掌握外顯子捕捉和采用DNA探針檢測特定DNA片段的遺傳分析方法。二、 實驗原理1. 真核生物的基因結(jié)構(gòu)不同于原核生物，真核生物基因的編碼序列是不連貫的，即在兩個編碼序列之間有一段不編碼蛋白質(zhì)的非編碼序列。編碼序列稱為外顯子（exon），非編碼序列稱為內(nèi)含子（intron）。兩個外顯子之間插入了一個內(nèi)含子。外顯子是出現(xiàn)在mRNA分子中的基因序列；內(nèi)含子則是不出現(xiàn)在mRNA分子中的基因序列。2. 外顯子捕捉“外顯子捕捉( exon trapping ) ”曾稱exon amplification, 是從基因組克隆片段中分離可表達序

2、列的技術(shù)之一，在“人類基因組計劃”中得到了廣泛的應(yīng)用，是通過構(gòu)建一種載體，從其插入片段中識別和回收外顯子序列的實驗方法。捕捉外顯子的載體pETV-SD是一種反轉(zhuǎn)錄病毒穿梭載體（shuttle vector），即其可在不同種的生物中如大腸桿菌和酵母中，細菌和哺乳動物細胞中進行復制的載體。 因為凡是含有內(nèi)含子和外顯子的基因在轉(zhuǎn)錄后都要經(jīng)過RNA剪接，這就需要有剪接供體（splicing donor，SD）位點和剪接受體（splicing acceptor，SA）位點。因此，SA位點可作為基因的標志。pETV-SD載體的片段中含有無SA的位點。它含有珠蛋白(HBG)基因的第1個外顯子、其有功能的SD

3、位點、該基因的間隔序列（IVS）和，-半乳糖苷酶（，-GAL）基因。3. 原位雜交（in situ hybridization）定位原位雜交是將待定基因的特定DNA序列或該基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA分子作為探針，在標記了放射性同位素或非放射性化學物質(zhì)后與變性后的染色體DNA雜交，該探針就會同染色體DNA中與其互補的序列結(jié)合成為雙鏈，通過放射自顯影技術(shù)或顯色技術(shù)，就可顯示標記了放射性同位素或非放射性化學物質(zhì)的探針的位置，達到基因定位的目的。用放射性化學物質(zhì)如熒光素標記探針后，則在熒光顯微鏡下，探針所在的位置上可呈現(xiàn)出熒光，這稱為熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridiza

4、tion，F(xiàn)ISH）。4. 操作步驟及基本原理如下：（1） 提取細胞核中的基因組DNA；（2） 特定的限制性內(nèi)切酶切割真核基因組DNA，獲得所要檢測的DNA小片段；（3） 將獲得的DNA小片段克隆在位于“外顯子捕捉序列”下游的克隆位點上；（4） 將獲得的重組載體感染反轉(zhuǎn)錄病毒的專宿包裝細胞系（ecotropic retroviral packaging cell line）2細胞系。2細胞提供蛋白質(zhì)產(chǎn)物使載體（自身不能合成病毒蛋白質(zhì)）成為反轉(zhuǎn)錄病毒在細胞里增殖。當反轉(zhuǎn)錄病毒在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄時，插入的DNA片段中包含有功能的SA位點，會發(fā)生RNA剪接反應(yīng)而將IVS切除；（5） 2細胞培養(yǎng)液中含有包裝

5、了已剪接和未剪接病毒RNA的病毒子（virion），用來感染組成型產(chǎn)生SV40T（腫瘤）抗原的COS細胞。病毒RNA基因組被反轉(zhuǎn)錄，并在載體上的SV40復制起點作用下，以環(huán)狀DNA附加體形式進行復制。（6） 從COS細胞中回收復制的附加體DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Dpn 酶切后轉(zhuǎn)化細菌。在含卡那霉素（Kn）和5-氯-4溴-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）的培養(yǎng)基上挑選轉(zhuǎn)化子。-半乳糖苷酶可水解X-gal而生成藍色產(chǎn)物，不產(chǎn)生-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)化子菌落則呈白色。（7） 只挑選白色菌落作進一步研究的材料。白色菌落的生成可以有兩種原因。一是由于基因發(fā)生突變，使-半乳糖苷酶失去活性；二是由于在反轉(zhuǎn)錄病毒

6、生活周期的RNA 時期中發(fā)生了剪接反應(yīng)，從而丟失了，-半乳糖苷酶基因。（8） 如果是真正發(fā)生了RNA剪接事件，準確的剪接反應(yīng)可切除作為標記的IVS，使人珠蛋白基因的第1外顯子與落入了捕捉陷阱的插入片段中的外顯子序列直接連接；（9） 從白色菌落制成的菌液中分離載體，采用可以和該段外顯子特定核酸序列互補的DNA探針進行原位雜交，可以鑒別該菌落是否是由捕獲了外顯子的轉(zhuǎn)化子形成的。三、 實驗材料畢赤酵母菌、pETV-SD載體、限制性內(nèi)切酶A、DNA連接酶、2細胞系、組成型產(chǎn)生SV40T（腫瘤）抗原COS細胞系、限制性內(nèi)切酶Dpn 酶、大腸桿菌四、 實驗用品和試劑五、 實驗步驟1. 畢赤酵母基因組DNA

7、的提?。?） 接種重組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子于5ml YPDZ培養(yǎng)基，GS115菌于YPD培養(yǎng)基作對照，30培養(yǎng)1618小時。（2） 室溫下，1500 g離心5-10min收集菌體。（3） 100 ul TE（pH 7.0）重懸，加入300 ul EDTA（pH 8.0），0.07M Tris-HCl，3 ul-巰基乙醇，1ul Lyticase ，37水浴30 min。（4） 10000g離心510min，取沉淀，加90ul TE重懸。（5） 200ul 飽和酚，200ul氯仿，混勻，離心30s ，取上層水相。（6） 加入兩倍體積無水乙醇以及1/10體積的NaAC，-20放置30min。（7） 10

8、000g離心20min，棄上清；75%乙醇漂洗沉淀一次。（8） 干燥后，加入15 µl的TE或H2O溶解，-20備用。2. 特定DNA片段的獲得和重組（1） 將限制性內(nèi)切酶A加入載體pETV-SD溶液中，從克隆位點處切開 pETV-SD載體，使其開環(huán)并形成特定的粘性末端。（2） 將限制性內(nèi)切酶A加入上一步獲得的酵母基因組DNA中，獲得特定小片段的DNA，該小片段DNA和上述載體具有相同的粘性末端。（3） 分別純化上述兩種溶液，獲得開環(huán)的載體溶液和小片段DNA溶液，并將小片段DNA溶液分成兩份，一份用于基因重組，另一份用于DNA探針的制備。（4） 將第三步中的載體溶液和其中一份小片段D

9、NA溶液混合，加入DNA連接酶和特定的緩沖溶液，使其進行連接反應(yīng)，獲得重組載體。3. DNA探針的制備（1）取步驟2.（3）中的另一份小片段DNA溶液來制備探針，制成缺口平移反應(yīng)體系。（2）在適當?shù)姆磻?yīng)條件下進行缺口平移反應(yīng)。（3） 凝膠電泳判斷探針大小，如片段大小偏大，則于延長反應(yīng)1030分鐘，再重復進行凝膠電泳，直至得到合適大小的探針。（4）向反應(yīng)體系中加入1l 0.5M EDTA和（或）70加熱5分鐘，以滅活酶，終止反應(yīng)，制得的探針于-20保存?zhèn)溆谩?. 外顯子捕獲（1） 將步驟2.所獲得的重組載體溶液加入2細胞系培養(yǎng)皿中進行感染；（2） 37培養(yǎng)2-3天，將所得的2細胞系培養(yǎng)液加入組成

10、型產(chǎn)生SV40T（腫瘤）抗原的COS細胞培養(yǎng)皿中進行克隆，37再培養(yǎng)2天；（3） 從COS細胞培養(yǎng)液中分離復制得到的重組載體DNA；（4） 向上述重組載體溶液中加入限制性內(nèi)切酶Dpn 進行酶切；（5） 酶切后的溶液加入大腸桿菌菌液當中，轉(zhuǎn)化細菌；（6） 把轉(zhuǎn)化反應(yīng)完成后的菌液涂布在含卡那霉素（Kn）和5-氯-4溴-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）的肉湯培養(yǎng)基上；（7） 培養(yǎng)2天之后觀察結(jié)果。（8） 在上述培養(yǎng)基上長出的藍色菌落附近挑取三個白色菌落，分別制成相應(yīng)的三份菌液；（9） 進一步將菌液制成玻片樣本。5. 熒光原位雜交鑒定捕獲的外顯子（1） 將步驟3.中制得的探針在75恒溫水浴中溫育5

11、min，立即置0，510min，使雙鏈DNA探針變性。（2） 采用烘烤玻片和加變性液的方式使步驟4.（9）中制得的載體DNA分子變性。（3）將已變性或預退火的DNA探針10L滴于已變性并脫水的玻片標本上，蓋上蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37雜交過夜（約1517h）。（4）洗脫，除去非特異性結(jié)合的探針。 （5）雜交信號的放大。（6）封片。（7）熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果。 六、試驗結(jié)果（預期）1. 外顯子捕獲步驟中用載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌培養(yǎng)結(jié)果肉湯培養(yǎng)基上出現(xiàn)藍色和白色兩種菌落，如下圖所示：2. 熒光原位雜交鑒定結(jié)果在熒光顯微鏡下，可以看到制成的玻片當中有熒光探針發(fā)出熒光，如下圖所

12、示：注：也有可能三個片子中只有其中一個或兩個當中能看到探針，甚至三個都沒有。七討論分析1. 實驗材料的選擇（1） 用于制備被捕獲外顯子的真核生物首先應(yīng)該優(yōu)先考慮模式生物，因為模式生物的基因組的序列信息和各個基因的結(jié)構(gòu)和功能基本上都是清楚的，在后續(xù)過程中會對其基因組進行限制性內(nèi)切酶的剪切，以獲得可以捕獲的外顯子，因而對切下來的這小段DNA有兩個最基本的要求：一是必須在兩邊有相同的且是特異的限制性內(nèi)切酶位點，可以經(jīng)過兩端切割后脫離基因組DNA形成小片段，而其他部分的DNA片段不會被切下來；二是這段基因中必須含有剪接受體（splicing acceptor，SA）位點，否則也無法發(fā)生剪接反應(yīng)，得不到

13、后續(xù)的實驗結(jié)果。（2） 限制性內(nèi)切酶A限制性內(nèi)切酶A中的“A”只是一個代號，因為還沒有確定，它的選擇應(yīng)該基于上述小片段DNA的特點，就是說這種限制性內(nèi)切酶能夠特異性識別該種小片段DNA兩邊的核酸序列，把它從基因組DNA中切出來，而不會切割其他部分。（3） 對載體的要求 對載體的說明在前面的原理部分闡述得比較多了，特別要說明的一點就是對它克隆位點的要求，必須要有能被限制性內(nèi)切酶A切割的克隆位點，不過這個要求應(yīng)該不難達到，因為也可以用人工合成被限制性內(nèi)切酶A切割的多克隆位點結(jié)合上去，已最終形成和小片段DNA相同的粘性末端。2. 實驗步驟的選擇（1）在理論課本對外顯子捕獲原理的敘述中其實還有一項，但

14、在這個實驗設(shè)計中被省去了，這一步是在用重組載體感染2細胞系得到細胞培養(yǎng)液，收集其中含已剪接和未剪接的病毒RNA的病毒子（virion），并用來感染兼宿反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞系（amphotropic retrobiral packaging cell line）PA-317。這使反轉(zhuǎn)錄病毒再進行一輪復制，并產(chǎn)生能感染猴腎細胞系COS細胞的高效價病毒原種。這樣做是由于上一輪克隆在病毒中的插入片段的剪接效率極低，而在第二輪復制時則大大提高了RNA剪接的機會。但我主要是出于以下的原因去掉了這一步：課本中的原理講的是外顯子捕捉在“人類基因組計劃”中的應(yīng)用，那么其前提是所要捕獲的外顯子是通過“霰彈法”切成的

15、很多未知的基因組DNA片段，在這種前提之下，首先能與載體結(jié)合的DNA片段只占一部分，與載體結(jié)合后結(jié)構(gòu)完整的特別是含有剪接受體位點的又只占一小部分，所以在第一輪克隆中剪接效率極低，但在本實驗中，要插入的是已知特定的DNA序列，它能順利結(jié)合在載體上并具有剪接受體位點，因此只要連接上去就能剪接，所以應(yīng)該是能保證只進行一輪就獲得較高的剪接效率的。（2）在獲得藍白菌落后，直接將制得的菌液制片，然后進行熒光原位雜交鑒定，而不是先從菌液中提取載體DNA再進行熒光原位雜交鑒定，這一步的簡略主要是出于簡化實驗步驟的考慮，而兩個不同步驟得出的結(jié)果應(yīng)該是一致的，即還是捕獲了外顯子的載體發(fā)熒光，沒有捕獲外顯子的載體不

16、發(fā)熒光。（3）獲得藍白菌落后挑取的白色菌落數(shù)目暫定為三個，但其實可能三個片子不夠，因為白色菌落的出現(xiàn)很有可能是突變的結(jié)果，探針不能雜交，沒有熒光出現(xiàn)，如果這種情況發(fā)生的概率比較大的話，那么就需要增加挑取菌落的數(shù)量。（4）在用限制性內(nèi)切酶A切割分別獲得載體DNA和小片段DNA之后增加了一個分離提純的步驟，將限制性內(nèi)切酶A除去，分別獲得單獨的載體DNA溶液和小片段DNA溶液，將其混合后再加連接酶進行連接反應(yīng)。但其實這幾個步驟可以在同一個體系中一次性發(fā)生，即直接把載體和基因組DNA，以及限制性內(nèi)切酶A這三種材料加在一起反應(yīng)，等反應(yīng)較完全的時候，加入特定的失活劑使限制性內(nèi)切酶A失活，停止切割，然后直接

17、加鏈接酶進行進一步的連接反應(yīng)，但主要是出于這幾個原因我還是沒有簡化：a)這兩個體系是否可以這樣“混用”；b)連接酶能否在使限制性內(nèi)切酶A失活的條件下自身卻保持較高的催化活性；c)限制性內(nèi)切酶A能否完全失活，會不會把它留在體系中，它會繼續(xù)作用，切割連接好的重組DNA分子。（5）在本實驗中，DNA探針是以第一步提取到的小片段DNA為模板的制備的，如前所述，如果我們對該段DNA小片段的序列了解得比較清楚的話，也可以直接人工合成。3. 實驗注意事項（1）將2細胞系培養(yǎng)液加入組成型產(chǎn)生SV40T（腫瘤）抗原的COS細胞培養(yǎng)皿中時應(yīng)注意兩點: 一是吸取2細胞系培養(yǎng)液時動作要輕緩，盡量不要把2細胞吸上來；二

18、是在加液進入COS細胞培養(yǎng)皿中時也要輕緩，不要攪動細胞使其脫壁。（2）酶切、連接、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化各步應(yīng)遵循嚴格的反應(yīng)條件和反應(yīng)時間進行。參考文獻1 張秀清,宋莉,楊煥明. 1997.外顯子捕獲J.中華醫(yī)學遺傳學雜志,14( 5): 307-311.2 朱冠山,繆為民,焦炳華. 1997. 外顯子捕捉法快速分離新基因的原理和方法J. 生物化學與生物物理進展, 24(3): 207-210.3 趙壽元,喬守怡. 2008. 現(xiàn)代遺傳學M. 北京: 高等教育出版社.4 張貴有. 2003. 普通遺傳學實驗指導M. 北京: 清華大學出版社.5 黎杰強, 伍育源, 朱碧巖. 2006. 遺傳學實驗M. 長沙: 湖南科學技術(shù)出版社.6 Nicole A. Datson et al.