紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)

1、紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)Measuring for erythrocyte osmotic fragility【教學(xué)對(duì)象與學(xué)時(shí)】一、教學(xué)對(duì)象：五年制本科二、學(xué)時(shí)：4學(xué)時(shí)【預(yù)習(xí)要求】預(yù)習(xí)紅細(xì)胞生理特性【目的要求】一、 操作：學(xué)習(xí)用試管法測(cè)定紅細(xì)胞滲透脆性二、 理論：1.了解紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)的原理。2. 觀察紅細(xì)胞對(duì)不同滲透張力的細(xì)胞外溶液的抵抗力，進(jìn)一步理解細(xì)胞外液滲透張力對(duì)維持紅細(xì)胞正常形態(tài)與功能的重要性?！局攸c(diǎn)和難點(diǎn)】一、重點(diǎn)1. 準(zhǔn)確配制不同滲透張力的溶液，掌握正確的紅細(xì)胞滲透脆性測(cè)量方法。2. 理解紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)的原理。二、難點(diǎn)1. 準(zhǔn)確配制不同滲透張力的溶液。2. 掌握正確的紅細(xì)胞滲透

2、脆性測(cè)量方法?！窘虒W(xué)過(guò)程設(shè)計(jì)】1. 課前提問(wèn)和預(yù)習(xí)檢查。2. 講解紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)的原理。3. 介紹不同滲透張力溶液的配制法和抗凝血液的制備。4. 學(xué)生分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察紅細(xì)胞對(duì)蒸餾水、1.9%尿素溶液和不同濃度的NaCl溶液的抵抗力。5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前匯總?cè)鄬?shí)驗(yàn)結(jié)果，討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果，理解實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)的原因?！菊n前預(yù)習(xí)檢查或提問(wèn)】一、 何謂紅細(xì)胞滲透脆性？其正常值是多少？二、 影響紅細(xì)胞滲透脆性的因素有哪些？【課前講解】一、 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理將紅細(xì)胞懸浮于低滲鹽溶液中，水將在滲透壓的作用下滲入細(xì)胞，于是紅細(xì)胞發(fā)生膨脹，由正常的雙凹圓碟形(圖1A)變成球形（圖1B），并開(kāi)始破裂而發(fā)生溶血。紅細(xì)胞在

3、低滲鹽溶液中發(fā)生膨脹破裂的現(xiàn)象稱紅細(xì)胞滲透脆性。但紅細(xì)胞對(duì)低滲鹽溶液具有一定的抵抗力，這種抵抗力的大小可作為衡量紅細(xì)胞滲透脆性的指標(biāo)。對(duì)低滲鹽溶液抵抗力小，表示滲透脆性高；相反，則表示滲透脆性低。同一個(gè)體的紅細(xì)胞對(duì)低滲鹽溶液的抵抗力并不相同。將血液滴入不同濃度的低滲NaCl溶液中可檢測(cè)其抵抗力的大小，剛開(kāi)始出現(xiàn)溶血的NaCl溶液濃度為該血液中紅細(xì)胞的最小抵抗力；出現(xiàn)完全溶血溶液濃度，為該血液中紅細(xì)胞的最大抵抗力。前者代表紅細(xì)胞的最大滲透脆性，后者代表紅細(xì)胞的最小滲透脆性。生理學(xué)上將滲透壓與血漿的滲透壓相等的溶液稱為等滲溶液；能使懸浮于其中的紅細(xì)胞保持正常體積和形態(tài)的溶液稱為等張溶液。等滲溶液不

4、一定是等張溶液，如1.9%的尿素溶液雖是等滲溶液，但不是等張溶液；而等張溶液溶液一定是等滲溶液，如濃度為0.85%的NaCl溶液既是等滲溶液又是等張溶液。 A B圖1. 紅細(xì)胞形態(tài) (A:正常；B：低滲NaCl溶液中球形紅細(xì)胞).二、實(shí)驗(yàn)方法1. 制備不同濃度的NaCl溶液。先配制1%濃度的低滲NaCl溶液100ml，然后取口徑相同的干凈小試管12支，編號(hào)排列在試管架上，按下表分別向各試管內(nèi)加入1%NaCl溶液和蒸餾水后混勻，配制成12種0.68%0.24%不同濃度的低滲NaCl溶液(圖2) 圖2 用于配制低滲NaCl溶液的試管 表1 紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)中不同濃度的NaCl溶液配制法試管編號(hào)

5、1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121%NaCl溶液（ml） 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6蒸餾水（(ml) 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9NaCl溶液濃度（%）0.68 0.64 0.60 0.56 0.52 0.48 0.44 0.40 0.36 0.32 0.28 0.242. 分別配制0.85%濃度的NaCl溶液、1.9%濃度的尿素溶液。另取3支小試管，編號(hào)1315，分別盛2.5ml 0.85%NaCl溶液、1.9%尿素溶液和蒸餾水。3. 碘酒

6、、酒精消毒皮膚后用滅菌干燥的、肝素濕潤(rùn)的注射器從肘正中靜脈取血2ml（圖3），立即混勻，將其中1ml加入試管，余血依次向15支試管內(nèi)各加入1滴（圖4），輕輕混勻。肘正中靜脈圖3. 上臂大靜脈 圖4. 向試管內(nèi)加血示意圖 4. 觀察13、14、15管的變化，其余12管在室溫下靜置1小時(shí)，然后觀察混合液的顏色和透明度。1） 試管內(nèi)液體完全變成透明紅色，說(shuō)明紅細(xì)胞全部破裂，稱完全溶血（圖5A）。2） 試管內(nèi)液體下層為混濁紅色，上層為透明紅色，表示部分紅細(xì)胞破裂，稱不完全溶血（圖5B）。3） 試管內(nèi)下層為混濁紅色，上層無(wú)色透明，說(shuō)明紅細(xì)胞全部沒(méi)有破壞（圖5C）。CBA 圖5. 溶血程度示意圖5. 記錄

7、實(shí)驗(yàn)結(jié)果。包括受試者姓名和紅細(xì)胞滲透脆性范圍（即最小抵抗力的NaCl溶液濃度和最大抵抗力的NaCl溶液濃度）以及1315管的結(jié)果。6. 取第6管和第13管混合液各1滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察紅細(xì)胞形態(tài)。圖6. 等滲NaCl溶液中紅細(xì)胞形態(tài) 成敗關(guān)鍵（注意事項(xiàng)） 1. 血液最好新鮮制備。 2. 準(zhǔn)確配制不同濃度的低滲鹽溶液。 3. 所有玻璃器皿要求干燥清潔。 4. 向試管內(nèi)滴加血液時(shí)不可用力擠壓，不可將血泡沫注入試管?；靹蚝t細(xì)胞的液體時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕，以免造成溶血。 5. 觀察溶血情況時(shí)以白色為背景。 6. 為使各管加血量相同，加血時(shí)持針角度應(yīng)一致。 7. 各試管應(yīng)準(zhǔn)確編號(hào)。 8. 玻

8、璃器皿應(yīng)小心輕放，以免損壞?！镜湫徒Y(jié)果】1. 紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2） 表2 紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)結(jié)果試管編號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15結(jié) 果2. 第6管和第13管混合液中紅細(xì)胞形態(tài) 第6管：第13管：【分析討論】一、 結(jié)果分析二、 非預(yù)期結(jié)果及可能原因分析【參考結(jié)論】【實(shí)驗(yàn)報(bào)告要點(diǎn)】1. 列表記錄紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2. 記錄第6管和第13管混合液中紅細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果。3. 討論結(jié)果產(chǎn)生的原理。4. 結(jié)論。【思考題】一、 為什么同一個(gè)體的紅細(xì)胞滲透脆性有最大值和最小值？二、 紅細(xì)胞在等滲的1.9%尿素溶液中會(huì)發(fā)生什么現(xiàn)象？為何出現(xiàn)這種現(xiàn)象

9、？【參考內(nèi)容】一、紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)的臨床意義測(cè)定紅細(xì)胞滲透脆性是一種生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，它能夠檢測(cè)出紅細(xì)胞膜對(duì)由于胞內(nèi)水聚集所造成的物理牽張力的抵抗能力。這主要取決于紅細(xì)胞表面積與其體積之比。表面積大而體積小對(duì)低滲鹽水抵抗力較大(脆性較小)；反之，則脆性增加。正常參考值：0.46%0.42%的NaCl溶液開(kāi)始溶血；0.34%0.32% 的NaCl溶液完全溶血。    患者與正常對(duì)照，溶血管的NaCl濃度相差0.4%具有診斷價(jià)值。從診斷學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)看，紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)?zāi)芊直娉鲆韵聝煞N不同的病理狀態(tài)：紅細(xì)胞滲透脆性增高見(jiàn)于：遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥，自身免疫性溶血性貧血伴繼發(fā)

10、球形紅細(xì)胞增多等。某些藥物或過(guò)冷、過(guò)熱也可引起。紅細(xì)胞滲透脆性減低見(jiàn)于：缺鐵性貧血，各型地中海貧血，鐮形細(xì)胞貧血，脾切除，阻塞性黃疸等。二、紅細(xì)胞滲透脆性實(shí)驗(yàn)的其他方法（一）紅細(xì)胞孵育滲透脆性試驗(yàn)(RIOFT)本試驗(yàn)是將血液置37孵育24h后，進(jìn)行滲透脆性試驗(yàn)。在孵育過(guò)程中，紅細(xì)胞能源消耗，貯備的ATP減少，導(dǎo)致需要能量的紅細(xì)胞膜對(duì)陽(yáng)離子的主動(dòng)傳遞受阻，造成鈉離子在RBC內(nèi)集聚，細(xì)胞膨脹，孵育滲透脆性增加。有細(xì)胞膜缺陷及某些酶缺陷的RBC能源很快耗盡，孵育滲透脆性明顯增加。參考值：未孵育：50%溶血為0.40%0.45% NaCl溶液；37孵育24h：50%溶血為0.46%0.60% NaCl

11、溶液。臨床意義 1.本試驗(yàn)用于輕型遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥、先天性非球形紅細(xì)胞溶血性貧血的診斷和鑒別診斷。2.增加：見(jiàn)于遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥、遺傳性橢圓形紅細(xì)胞增多癥、先天性非球形細(xì)胞溶血性貧血。3.減低：見(jiàn)于地中海貧血、缺鐵性貧血、鐮狀細(xì)胞貧血、脾切除術(shù)后。（二）全自動(dòng)智能紅細(xì)胞脆性檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)管放入RC，蓋好，按OK，讀數(shù)。全自動(dòng)智能紅細(xì)胞脆性檢測(cè)系統(tǒng)是一種臨檢用紅細(xì)胞脆性檢測(cè)系統(tǒng)，包括紅細(xì)胞脆性檢測(cè)儀-ERYFRATEST READER及檢測(cè)試劑-ERYFRATEST MONOTEST，可用于檢測(cè)紅細(xì)胞滲透脆性（EOF）和紅細(xì)胞滲透阻力（EOR）。本系統(tǒng)采用紅細(xì)胞脆性檢測(cè)儀及M

12、onotest檢測(cè)試劑盒進(jìn)行體外紅細(xì)胞滲透阻力的定量檢測(cè)。微型、簡(jiǎn)易的紅細(xì)胞脆性檢測(cè)系統(tǒng)盡可在醫(yī)生辦公室、在病房、在病人床頭使用。首次實(shí)現(xiàn)了取血數(shù)分鐘內(nèi)即可獲得紅細(xì)胞脆性定量結(jié)果。三、何謂地中海貧血？地中海貧血（Thalassemia）簡(jiǎn)稱海貧或海洋性貧血，于 1925 年由 Cooley 和 Lee 首先描述，最早發(fā)現(xiàn)于地中海區(qū)域，當(dāng)時(shí)稱為地中海貧血，國(guó)外亦稱海洋性貧血。實(shí)際上，本病遍布世界各地，以地中海地區(qū)、中非洲、亞洲、南太平洋地區(qū)發(fā)病較多。在我國(guó)以廣東、廣西、貴州、四川為多。這是一類由于常染色體遺傳性缺陷，引起珠蛋白鏈合成障礙，使一種或幾種珠蛋白數(shù)量不足或完全缺乏，因而紅細(xì)胞易被溶解破

13、壞的溶血性貧血。我國(guó)自然科學(xué)名詞審定委員會(huì)建議本病的名稱為珠蛋白生成障礙性貧血，習(xí)慣上仍稱為地中海貧血。呈小細(xì)胞低色素性貧血，紅細(xì)胞大小不均，可見(jiàn)異形，靶形紅細(xì)胞 (可有 0-66 ) ，網(wǎng)織紅細(xì)胞增多。紅細(xì)胞滲透脆性降低。有種族和家族史特征?！緦I(yè)英語(yǔ)選讀】Osmotic fragilityBeutler E,Lichtman M,Coller B,et al. Williams Hematology,5th ed .New Yock, McGraw-Hill, 19951. The osmotic fragility test is a simplified means of estima

14、ting the surface area/volume ratio of erythrocytes. As this ratio falls the cell becomes more sensitive to osmotic lysis. Its greatest usefulness is in the diagnosis of hereditary spherocytosis, but it has also been used in screening for thalassemia.2. Either heparinized or defibrinated blood is sui

15、table for osmotic fragility studies. 3. It is usually desirable to determine the osmotic fragility both of the freshly drawn blood and of autoincubated blood. For the latter, 2 ml of the sterile blood is placed in a sterile 5-ml screw-cap vial and incubated for 24 h at 37. A series of solutions cont

16、aining phosphate-buffered sodium chloride solutions equivalent in osmolarity from 0.15 to 0.80% NaCl are dispensed into tubes. A one-hundredth volume of blood is added to each tube, as well as to a tube containing distilled water, which serves as the blank. After being allowed to stand at room tempe

17、rature for 60 min, the tubes are centrifuged and optical density of the supernatant is read at 540 nm.4. The percent hemolysis in each tube is calculated as follows:% hemolysis = (ODs-ODB)×100 OdoWhere ODs is the optical density in a supernatant, ODB is the optical density of the 0.09% saline s

18、upernatant, and ODo is the optical density of the distilled water tube. 5. The normal range of values is presented as follows:NaCl, % Lysis, %Fresh Incubated0.20 95-1000.30 97-100 85-1000.35 90-99 75-1000.40 50-95 65-1000.45 5-45 55-950.50 0-6 40-850.55 0 15-700.60 0-400.65 0-100.70 0-50.75 06. Cells with a low surface area/cell volume ratio,demonstrate increased osmotic fragility; Cells with a high