細(xì)胞培養(yǎng)攻略

1、一、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)和步驟細(xì)胞培養(yǎng)基大全：細(xì)胞原代培養(yǎng)步驟：細(xì)胞傳代培養(yǎng)步驟：更多細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：二、細(xì)胞培養(yǎng)常見問答1、加到培養(yǎng)基中的血清 必須滅活嗎？ 答：不是必須的，看做什么實(shí)驗(yàn)了。 2、四季青胎牛血清滅活是56 30分鐘嗎？ 答：如果用于培養(yǎng)大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞，血清一般是不需要滅活的，這樣可以有效保存血清中的生長因子 。但是如果用于培養(yǎng)一些表面具有補(bǔ)體受體的細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞，血清是需要滅活，一般是56 ，30 min。 3、我要做滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，胎牛血清要滅活嗎？ 答：進(jìn)口的一般都已滅活，國產(chǎn)的不一定，最好還是滅活一下再用較安全。4、我用病毒上清

2、轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)用的血清需要滅活嗎？因?yàn)檠逯锌赡苡行┭a(bǔ)體和抗體 ，是不是會影響轉(zhuǎn)染？我想未滅活的血清中含些抗體 補(bǔ)體可能會和病毒相結(jié)合，影響轉(zhuǎn)染，正確嗎？細(xì)胞是單核細(xì)胞白血病細(xì)胞，病毒是病毒包裝細(xì)胞PT67 收集的病毒上清。為什么要用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時，目的是什么？ 答：血清一定要滅活，可以先用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時以后再加血清。避免雜蛋白對病毒和宿主結(jié)合過程的干擾，一般是2-6小時，根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)決定。血清不一定需要滅活，滅活的目的是將血清中的補(bǔ)體滅活！這要根據(jù)實(shí)際情況而定，如果沒有把握那就滅活吧，也不麻煩56度半個小時。5、(1)我買的是杭州四季青的新生牛血清，要

3、滅活嗎？有些說法是需要，有些說直接解凍后就可以加入到培養(yǎng)基中；我配制胰蛋白酶 液，用的是D-PBS，有關(guān)系嗎？ 答：關(guān)于血清的熱滅活，是很多人感興趣也存在一定爭議的話題。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室將血清的熱滅活還是作為常規(guī)來執(zhí)行，因?yàn)橛袃蓚€作用，第一是滅活補(bǔ)體，第二是滅活血清中可能存在的支原體。但是實(shí)驗(yàn)者并沒有考慮熱處理對血清中的生長因子 、氨基酸 等成分帶來的負(fù)面影響。 我在實(shí)驗(yàn)室處理血清的時候，有一次水浴 箱在滅活過程中出現(xiàn)故障，溫度升高到80 ，血清變成了凝膠狀，我重新處理了另外一份血清，將兩份血清對比，發(fā)現(xiàn)高溫直接影響到血清所含的抗體蛋白。在56 下滅活半小時以上，肯定也會對里面

4、的蛋白起到破壞作用。下次有機(jī)會我做個延長滅活時間的實(shí)驗(yàn)試試，看看到底有多大的影響。熱滅活之后，血清放在四度冰箱久了，就會有沉淀產(chǎn)生，這常常會被認(rèn)為是微生物污染或者是黑膠蟲污染。為了驗(yàn)證到底有沒有污染，常常又會把血清放置37 溫育，但是血清中的蛋白會進(jìn)一步析出，最后還是要做鏡檢，無菌培養(yǎng)試驗(yàn)，和革蘭氏染色試驗(yàn)，非常麻煩。 我看過一份資料，里面提到70%的實(shí)驗(yàn)者認(rèn)為滅活是理所當(dāng)然的。常規(guī)滅活建議的溫度在45 到62 之間，而時間則從15分鐘到60分鐘不等。其中最常用的手法是56熱處理30分鐘。隨著血清采集、處理、加工工藝的提高，許多早先認(rèn)為是熱滅活的原因已經(jīng)不再成立，只有少數(shù)對血清進(jìn)行熱

5、滅活的研究者在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了這一步驟的有效性和必要性。有人比較過11個不同細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)其中熱滅活對6 個細(xì)胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纖維細(xì)胞，MRC-5)的生長帶來負(fù)面影響，三個細(xì)胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受熱滅活的影響，而只有兩個細(xì)胞株(Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid)，在熱滅活之后，細(xì)胞生長有輕微的改善。所以，在正常的操作下，熱滅活通常對細(xì)胞的生長沒有明顯的促進(jìn)作用。 你可以摸索一下，血清從-20 冰箱拿出來之后在常溫解凍，然后混勻分裝成兩份，一份滅活，一份不滅活，比較這兩種血清對細(xì)胞是否有影響。然后再確定是滅活還是不滅活。這個過

6、程最多也就一個星期。同時你還要考慮血清滅活與否對你后續(xù)的實(shí)驗(yàn)有沒有影響。 (2)分裝后的血清從-20取出放4讓其液化，卻見血清比較混濁，有沉淀產(chǎn)生，這屬正常嗎？ 答：正常。 6、如何選用培養(yǎng)基？  培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長?？傊走xMEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無血清培養(yǎng)的首選是AIM V培養(yǎng)基（SFM）。在開始進(jìn)行新的細(xì)胞培養(yǎng)時，可以參考下表所列的條件：  7、為什么要熱滅活血清？加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)

7、胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清。   8、L谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？   L谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定。L谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。  9、GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？

8、0;  GlutaMAX-I二肽是L谷氨酰胺的衍生物，將其不穩(wěn)定的氨基用L丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L谷氨酰胺幾乎完全降解。  10、為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？   酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人

9、員在做流式細(xì)胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。  11、如何用臺盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？   用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到2002 000個/毫升，在0.1毫升的細(xì)胞中加入0.1毫升的0.4的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞?；罴?xì)胞排斥臺盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。  12、如何消除組織培養(yǎng)的污染？  當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。 高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細(xì)胞系有毒

10、性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。1） 在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。2 ）分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。3 ）每天觀測細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。4 ）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞23代。5

11、 ）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。6 ）重復(fù)步驟4。7 ）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6代，確定污染是否以已被消除。  13、培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？   丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源。盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。  14、為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀？   GIBICO的胎牛血清 沒有預(yù)老化，儲存在28 時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會影響血清的質(zhì)量。推薦在20 儲存胎牛血

12、清，避免反復(fù)凍融。  15、目錄上說，Hank's 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？ Hank's 平衡鹽溶液（HBS）和Earle's平衡鹽溶液（EBS）有什么本質(zhì)的功能差別？   HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需

13、要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。  16、Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?  Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執(zhí)行的所有的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)程序，而且除了這些標(biāo)準(zhǔn)檢測，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測： End-Point Determination of Endotoxin Content 噬菌體檢驗(yàn) 生物化學(xué)檢測  激素的檢測 血紅蛋白檢測 Sf9 細(xì)胞生長促進(jìn)及方法學(xué)檢測  17、二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入E

14、DTA的目的是什么？   二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。  18、制備 lipid-DNA的方法會影響轉(zhuǎn)染效率嗎？   是的。對于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在100 l OPTI-MEM中，稀釋DNA在100l OPTI-MEM中。混合兩種溶液在室溫下孵育15分鐘。對于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養(yǎng)基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效

15、率。確保復(fù)合物在沒有血清的情況下形成。孵育15分鐘后，在復(fù)合物中加入含有血清的培養(yǎng)基（800 l）。（注意以上是35 mm培養(yǎng)皿使用體積）。對于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應(yīng)該在與脂質(zhì)體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個很小的體積下混合DNA和脂質(zhì)體，接下來可以不需要換培養(yǎng)基的情況下直接加入。對于每一種脂質(zhì)體的詳細(xì)的信息可以參考產(chǎn)品說明書。  19、我使用SF900 時，細(xì)胞生長良好，但是為什么我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好？  如果目的蛋白是一個

16、后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達(dá)，這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1），讓血清給蛋白酶提供作用底物。  20、如何檢測內(nèi)毒素(熱源)水平？   LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗(yàn)是可用的最敏感和特異的檢測細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。Levin和Bang 發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內(nèi)的凝集作用。內(nèi)毒素啟動一個細(xì)胞內(nèi)酶原系統(tǒng)（絲氨

17、酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)），通過修飾凝集素，產(chǎn)生一種透明的膠，LAL中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質(zhì)。LAL試劑緩沖的鱟（血細(xì)胞）裂解物。 胎牛血清的內(nèi)毒素檢測是在Grand Island，按照手冊上Gel-clot 方法進(jìn)行的。在對血清產(chǎn)品進(jìn)行內(nèi)毒素檢測前，用無熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘，以消除抑制劑。（通常，血液中的內(nèi)毒素結(jié)合成份的出現(xiàn)會抑制凝膠過程，使內(nèi)毒素不能與LAL反應(yīng)。樣品預(yù)先熱處理可以消除這種抑制作用。）   21、我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養(yǎng)基嗎？   如果使用固體形式的培養(yǎng)基，需要加入瓊脂。

18、瓊脂加入前要先滅菌。應(yīng)該避免MS培養(yǎng)基的直接滅菌，應(yīng)該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養(yǎng)基中。  22、20 下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎？   對于普通使用的緩沖液，pH值隨溫度變化而變化。 下表列出溫度改變10 時，pH值的變化情況 例如 20 下配制pH7.4 Tris緩沖液,40 時pH值為 7.4-（2x0.310）6.78  23、室溫下(25 )配制的Tris-HCl溶液，在37 使用時PH值是多少？  緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50 mM Tris-HC 溶液在4

19、 ，25 ，37 時，不同的PH值。 24、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的最適PH值和滲透壓是多少？   生長培養(yǎng)基的PH值對細(xì)胞的增值和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會產(chǎn)生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細(xì)胞系，在PH值 6.06.4范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類昆蟲細(xì)胞系時，培養(yǎng)基的最適滲透壓是 345380 mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細(xì)胞培養(yǎng)方式，減少技術(shù)問題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。  25、High Five細(xì)胞有任何其它名稱嗎？   High Five細(xì)胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-

20、5B1-4。 編輯： 嗚咽1. 胰酶消化法實(shí)驗(yàn)方法原理將動物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實(shí)際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。最常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)材料胎鼠新生鼠試劑、試劑盒1640培養(yǎng)基牛血清胰酶Hanks液碘酒儀器、耗材培養(yǎng)箱培養(yǎng)瓶青霉素瓶小玻璃漏斗平皿吸管移液管

21、紗布手術(shù)器械血球計(jì)數(shù)板離心機(jī)水浴箱實(shí)驗(yàn)步驟一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備1.  Hanks液配方：KH2PO4 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4·H2O 0.06 g，加H2O至 1 000 ml。Hanks液可以高壓滅菌。4下保存。二、具體操作1.  將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中。 2.  用Hanks液洗

22、滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。 3.  用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1 mm2），再用Hanks液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。 4.  視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37中消化20-40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。 5.  加入3-5 ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。 6.  靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。 7.  1 000 rpm，離心10分鐘，棄上清液。 8.  加入Han

23、ks液5 ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。 9.  加入培養(yǎng)液1-2 ml（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。 10.  將細(xì)胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37下培養(yǎng)。 收起注意事項(xiàng)1.  自取材開始，保持所有組織細(xì)胞處于無菌條件。細(xì)胞計(jì)數(shù)可在有菌環(huán)境中進(jìn)行。 2.  在超凈臺中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。 3.  凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細(xì)菌落入。4.  操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺后手要用75%酒

24、精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。 5.  點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。 6.  操作動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機(jī)會。 7.  不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。 8.  瓶子開口后要盡量保持45°斜位。 9.  吸溶液的吸管等不能混用。實(shí)驗(yàn)方法原理培養(yǎng)細(xì)胞傳代根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法。

25、貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細(xì)胞用直接吹打可傳代；懸浮生長的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞試劑、試劑盒D-Hanks液小牛血清RPMI1640雙抗胰蛋白酶EDTANHClNaHCO3儀器、耗材凈化工作臺離心機(jī)恒溫水浴箱冰箱倒置相差顯微鏡培養(yǎng)箱吸管玻璃瓶培養(yǎng)瓶廢液缸吸頭槍頭膠塞離心管量加樣槍紅血球計(jì)數(shù)板實(shí)驗(yàn)步驟1.  貼壁細(xì)胞的消化法傳代：（1）吸除或倒掉瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。（2）D-Hanks液洗23次。 （3）向瓶內(nèi)加入適量消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面。（4）然后吸掉或倒掉消化液后