動(dòng)物寄生蟲病PCR診斷技術(shù)

1、動(dòng)物寄生蟲病PCR診斷技術(shù)聚合酶鏈反響 Polymerase Chain Reaction, PCR 技術(shù)是一種既敏感又特異的 DNA 體外擴(kuò)增方法， 它可將一小段目的 DNA 擴(kuò)增上百萬倍，其擴(kuò)增效率使得該方法可檢測到單個(gè)蟲體或僅局部蟲體的微量 DNA 。通過設(shè)計(jì)種、 株特異的引物， 此法只擴(kuò)增出種、 株特異的 PCR 產(chǎn)物， 具有很高的特異性。 而且 PCR 技術(shù)的操作過程也相對(duì)簡便快捷，無需對(duì)病原進(jìn)行別離純化；同時(shí)可以克服抗原和抗體持續(xù)存在的干擾， 直接檢測到病原體的 DNA ，既可用于蟲種、株的鑒別，動(dòng)物寄生蟲病的臨床診斷，又可用于動(dòng)物寄生蟲 病的分子流行病學(xué)調(diào)查。隨著 PCR技術(shù)的不

2、斷完善與開展，它已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物技術(shù)、臨床 醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，具有廣泛的應(yīng)用前景。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊笳莆誔CR診斷技術(shù)所涉及實(shí)驗(yàn)的根本原理，全面熟悉 PCR診斷技術(shù)的操作過程，其中包括寄生蟲DNA的提取、PCR引物的設(shè)計(jì)、PCR條件的優(yōu)化、對(duì)目的片斷的擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳及結(jié)果分析、PCR產(chǎn)物的純化等等。二、實(shí)驗(yàn)儀器和材料一寄生蟲基因組 DNA的提取及純化1. 蟲體材料。 單個(gè)蟲體。2. 器具。 超凈工作臺(tái)、 恒溫培養(yǎng)箱、 TGL-16G 高速臺(tái)式離心機(jī)、 旋渦振蕩器、 微量取液器及配套吸頭、 微量離心管、一次性注射器、微型眼科鑷、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有機(jī)架等。 乙二胺四乙酸

3、Ethyle ne diami netetra acetic acid , EDTA、十二烷基磺酸鈉 Sodium dodecyl sulfate, SDS、三羥甲基氨基甲烷 -鹽酸Tri (Hydroxymethyl) Ami no metha ne-HQ Tris-HCI、氯化鈉、蛋白酶 K25剛Q、異丙醇80%、雙蒸水、滅菌超純水等。(2) DNA 裂解液：500 mM NaCl 70 lP 100 mM Tris-HCl pH30 卜 50 mM EDTA pH150 Q 10%SDS 30 l。(3) Wizard TM DNA Clean-Up 試劑盒或類似的 DNA 提取試劑盒。

4、二 PCR 擴(kuò)增及瓊脂糖電泳1 材料。 提純的蟲體 DNA 。2 .器具。 超凈工作臺(tái)、微型高速臺(tái)式離心機(jī)、微量取液器2/20/200/1000 qI、PCR擴(kuò)增儀、瓊脂糖電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、微波爐、4 C /-20 C冰箱、紫外透射儀、微型離心管 200/500/1500 Q、有機(jī)架、一次性手套、透明膠帶、量筒 100 ml、三角瓶500 ml、等。3. 試劑。(1) 10 x PCR Buffer無 Mg2+、dNTP2.5 mM each、ddH?。、MgCI 225 mM、Primers、Ex Taq 酶5 U/ I、瓊脂糖、EB 10mg/ml、Tris 堿、硼酸Boric ac

5、id、去離子水、EDTA 0.5 mol/L , pH 8.0、 10x載樣緩沖液。x TBE緩沖液：準(zhǔn)確秤取 Trisgg，充分溶解于 800 ml去離子水中，加 10ml 0.5 mol/L EDTA pH8.0， 用去離子水定容至 1000ml 。三 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化1 .材料。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。2 .器具。TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)；三用電熱恒溫水箱；微量取液器2/20/200/1000 Q、瓊脂糖電泳系統(tǒng)、微波爐、電子天平、4C /-20C冰箱、紫外透射儀、微型離心管500/1500 Q、有機(jī)架、透明 膠帶、一次性注射器、量筒 100ml 、三角瓶 500ml 、手術(shù)刀、保

6、鮮紙等。X TBE緩沖液；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒；UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒；異丙醇80% 等。三、實(shí)驗(yàn)方法、步驟和操作要領(lǐng)(一)寄生蟲基因組DNA的提取及純化1. 實(shí)驗(yàn)原理。 應(yīng)根據(jù)研究目的來決定是從單個(gè)蟲體還是多個(gè)蟲體提取基因組DNA寄生蟲蟲體的各個(gè)部位都可以作為基因組 DNA的抽提材料，如果蟲體較大的話可取其中部而保存其頭部及尾部，以備形態(tài)學(xué) 鑒定以驗(yàn)證其種類。如果蟲體較小小于 1 cm，那么應(yīng)使用整條蟲體抽取DNA假設(shè)蟲體特別細(xì)小例如幼蟲，可用多條蟲體來提取 DNA為了獲得高含量、高純度的DNA最好使用新鮮材料。從凍干或50%-70% 乙醇保存的寄生蟲材料中也

7、可較容易地提取DNA。寄生蟲DNA的抽提方法有多種，不同種類的寄生蟲蟲體都有其最適合的抽提方法，但各種方法的根本原理都一樣，即先用機(jī)械的方法將蟲體組織破碎，然后參加DNA裂解液和蛋白酶 K,充分作用后，蟲體組織中的細(xì)胞膜破裂，蛋白質(zhì)變性，將蟲體基因組DNA釋放到溶液中。在裂解過程中，蟲體細(xì)胞碎片及大部分蛋白質(zhì)會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被DNA裂解液中的SDS包蓋，通過離心沉淀，這些復(fù)合物會(huì)從溶液中沉淀下來，變性劑也同時(shí)被除去，從而就可從上清中回收蟲體基因組DNA溶液?；厥蘸蟮南x體基因組DNA液用Wizard TM DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。純化時(shí)，DNA溶液與純化試劑盒中的清洗樹脂混合后，其

8、混合液在通過微型柱時(shí) DNA會(huì)結(jié)合在柱上，而其它雜質(zhì)會(huì)通過微型柱排出；再用80%異丙醇進(jìn)行沖洗，去除剩余雜質(zhì)。最后，在微型柱中參加預(yù)熱的TE緩沖液或超純水，使結(jié)合在微型柱上的DNA充分溶解，通過離心，其洗脫液即為純化的蟲體基因組DNA溶液。2實(shí)驗(yàn)方法、步驟和操作要領(lǐng)。(1) 蟲體材料的處理 ( 假設(shè)為新鮮或凍干保存的蟲體，那么不需要此步驟 )。ml 的離心管中。假設(shè)蟲體較小，取一整條蟲體經(jīng)如上洗滌處理。對(duì)于雞球蟲，將保存在 2.5%重鉻酸鉀溶液的卵囊懸液以2000X g離心10min，棄重鉻酸鉀溶液。以雙蒸水重懸，同法離心洗滌三次后，用20%次氯酸鈉處理卵囊 20min， 2000X g 離心

9、沉淀卵囊，用適量飽和鹽水重懸卵囊沉淀，1500X g離心10min，上清液參加4倍體積的滅菌雙蒸水，3000 X g離心10min。卵囊 沉淀再用上述方法重新漂浮、洗滌一次。用少量滅菌雙蒸水重懸卵囊沉淀，然后將其輕輕地加在0.6M 無菌蔗糖溶液之上，2000X g離心5min，取上層卵囊加 5倍體積的水，3000 X g離心10min，沉淀再用無菌 蔗糖溶液漂浮一次，即可得純潔的卵囊，可立即用于裂解以提取DNA。(2) 蟲體材料的裂解。用滅菌且經(jīng)紫外燈照射過的微型眼科剪刀將蟲體組織剪碎，參加280訕的SDS裂解緩沖液，輕輕混勻，再參加20訕25呃/認(rèn)的蛋白酶K溶液。對(duì)于原蟲如雞球蟲、隱孢子蟲，

10、將純化好的卵囊 3000rpm/min離心10min，去掉大局部上清后參加與卵囊體積相同的玻璃珠，漩渦震蕩直到有95%卵囊破壁后，即可參加SDS裂解緩沖液及蛋白酶 K溶液?；靹蚝?，放于恒溫培養(yǎng)箱中，37 C作用1248 h，其間不時(shí)搖動(dòng)離心管， 使蟲體組織裂解充分。(3) 蟲體 DNA 的抽提和純化。首先進(jìn)行蟲體 DNA提取，然后按Promega公司試劑盒 WizardTM DNA Clean-Up System使用說明對(duì)DNA 進(jìn)行純化。方法如下： 取出于恒溫培養(yǎng)箱中作用了約 20小時(shí)的離心管，旋渦震蕩器震蕩混勻，10000rpm離心2min，上清即為蟲體DNA溶液。將上清轉(zhuǎn)移至一新的離心管

11、中，參加1ml清洗樹脂按50500訕懸液/1 ml清洗樹脂的比例 ，旋渦震蕩混勻。 取一支 5ml 的一次性注射器，去針頭，拔出注射器內(nèi)芯推液筒，接上 Wizard TM 微型柱。 將 DNA- 樹脂混合液全部轉(zhuǎn)移到注射器中，用注射器內(nèi)芯推液筒，慢慢地將 DNA- 樹脂混合液推過 微型柱，排出廢液。 將注射器從微型柱上拔出后，拿去注射器內(nèi)芯推液筒，再將注射器套在微型柱上，向注射器內(nèi)加入2 ml柱洗溶液80%的異丙醇，用注射器內(nèi)芯推液筒慢慢將洗柱液通過微型柱，以洗滌DNA-樹脂樣品。 拔去注射器，將微型柱套在潔凈的1.5ml離心管上，10000rpm離心20sec,以除去殘留的異丙醇。 將微型柱

12、從注射器上轉(zhuǎn)移到一新的離心管上，在柱中央?yún)⒓?050訕預(yù)熱6070C的超純水或1 x TE緩沖液，靜置1 min , 10000rpm離心20sec。離心管內(nèi)的液體即為 DNA溶液。可將 DNA溶液轉(zhuǎn) 移至0.5 ml離心管中于-20C冰箱保存?zhèn)溆谩６纳x DNA的 PCRT增及瓊脂糖電泳1. 實(shí)驗(yàn)原理。(1) PCR引物設(shè)計(jì)。PCR反響成功擴(kuò)增的一個(gè)關(guān)鍵條件在于寡核甘酸引物的正確設(shè)計(jì)。PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對(duì)適宜的寡核甘酸片段，使其能有效地與目的片段兩端的序列互補(bǔ)。設(shè)計(jì)引物時(shí)要遵循以 下原那么： 長度不能太長，也不能太短，一般在 18 25 個(gè)堿基左右； G+C含量及Tm值：弓I物的

13、G+C含量以40%60%為宜。弓I物的Tm值是指寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下 50%寡核苷酸雙鏈的解鏈溫度。PCR 引物應(yīng)保持合理的 G+C 含量。含有 50%G+C的20個(gè)堿基的引物其 Tm值約界于5662C,這可為有效退火提供足夠的溫度。由于G+C間的氫鍵數(shù)較A+T 間多，因此， G+C 含量高的 DNA 片段其 Tm 值也高。對(duì)于短于 20 個(gè)堿基的引物， Tm 值可按 Tm=4(G+C)+2(A+T) 計(jì)算。而對(duì)于較長的引物， Tm 值的計(jì)算較為復(fù)雜。 由于 PCR 擴(kuò)增的特異性取決于兩 條引物與相應(yīng)模板的結(jié)合，因此，反響中退火溫度應(yīng)根據(jù)兩個(gè)Tm 值折衷選擇。 堿基的組成盡

14、量隨機(jī)，盡量不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在；尤其是3'末端不應(yīng)超過 3個(gè)連續(xù)的 G或 C； 引物內(nèi)部不應(yīng)有互補(bǔ)序列，否那么引物自身會(huì)折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物本身復(fù)性。這樣二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì) 因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。 假設(shè)引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基達(dá) 3個(gè)以上， 就容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 兩個(gè)引物之間不能互補(bǔ)，尤其應(yīng)防止3'末端的互補(bǔ)重疊以防止形成引物二聚體。兩個(gè)引物不應(yīng)有4 個(gè)以上的堿基連續(xù)相同或互補(bǔ)； 引物的 3'末端應(yīng)與目的片段完全相配。這對(duì)于獲得好的擴(kuò)增結(jié)果非常重要。如果能確定一個(gè)保守 氨基酸，可將其密碼子的前 2個(gè)堿基作為 3'末端。 引物的 5'末端可不

15、與目的片段互補(bǔ)， 可被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。 引物的 5'末端修飾包括：加酶切位點(diǎn)，標(biāo)記生物素、熒光、同位素、地高辛等。還可引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列、引入突變位點(diǎn)、引入翻譯起始密碼子、啟動(dòng)子序列等。所附加的限制性酶切位點(diǎn)應(yīng)是不會(huì)在引物以外的DNA上切割的。為了有效地切割限制性酶切位點(diǎn)，在限制性酶識(shí)別序列的5'端常需添加 2-3 個(gè)非特異的額外堿基。 假設(shè)是設(shè)計(jì)種或株特異性引物， 引物與非特異序列的相似性不能超過70%或有連續(xù) 8個(gè)以上的互補(bǔ)堿基相同?？捎?DNAstar、 MegAlign 軟件比擬相似性，用 Oligo50 來設(shè)計(jì)引物。(2) PCR的根本原理。在存在DN

16、A模板、弓I物、dNTR適當(dāng)緩沖液Mg+的反響混合物中，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化下，對(duì)一對(duì)寡核苷酸引物所界定的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。這種擴(kuò)增是通過模板DNA引物之間的變性，退火復(fù)性，延伸三步反響為一周期cycle，循環(huán)進(jìn)行，使目的 DNA片段得以擴(kuò)增。 由于每一周期所產(chǎn)生的 DNA片段均能成為下一次循環(huán)的模板，故PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加，經(jīng) 30個(gè)周期后，特定DNA片段的數(shù)量在理論上可增加109倍。在實(shí)際應(yīng)用中，一般多用3035個(gè)循環(huán)。(3) 瓊脂糖電泳的根本原理。瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，于沸水中溶解，45C開始形成多孔性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶

17、負(fù)電荷，在外加電場的作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法別離DNA主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。溴化乙錠EB為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其發(fā)射的熒光強(qiáng)度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強(qiáng)度大10倍以上，且熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。2. 實(shí)驗(yàn)方法、步驟和操作要領(lǐng)。(1) PCR擴(kuò)增。 先按單倍擴(kuò)增體系中各試劑的量計(jì)算好n倍除去模板DNA量擴(kuò)增體系中各試劑相對(duì)應(yīng)的量，然后在適合體積的離心管中依次

18、參加試劑如nx 2.5卩I10X PCR Buffer、nx 2 ldNTP , nx 4 卩 MgCI 2、n x 0.5 卩 Forward primer、nx 0.5 卩 Reverse primer、nx 14.4 uldH2O、n x 0.125 卩 lx Taq 酶，最后總體積為 nx 24卩，經(jīng)離心混勻后，分裝至n個(gè)200卩的離心管中包括陰陽性對(duì)照，在各管中參加模板DNA如擴(kuò)增體系為25卩那么參加1卩1模板DNA，混勻后于PCR擴(kuò)增儀中按已設(shè)好的 PCR 擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。如細(xì)胞色素 c氧化酶第一亞基(cytochrome c oxidase subunit 1, cox1基因的

19、擴(kuò)增體系為：試劑體積卩ddH2O10x PCR BufferMgCl 2 (25 mM)dNTPs (2.5 mM each)2Forward primer (100 pmol/ l, JB3)Reverse primer (100 pmol/ l, JB4.5)Ex Taq (5 U/ l)模板(gDNA)125總量coxI基因的PCR擴(kuò)增條件:擴(kuò)增完畢后，取出 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于4C /-20C冰箱保存?zhèn)溆谩?4 C變性5 min94 C變性30 s55 C復(fù)性30 s30個(gè)循環(huán)72 C延伸30 s72 C延伸5 min(2)瓊脂糖凝膠電泳。制備凝膠：膠濃度視具體情況而定。以配制0.8%瓊脂

20、糖凝膠為例，準(zhǔn)確稱取0.8 g瓊脂糖參加至100 x TBE電泳緩沖液，于微波爐中或經(jīng)高壓熔化均勻，冷卻至50C左右，參加溴化乙錠EB 10 mg/ml,參加量為8.3 yFB/100 ml瓊脂糖凝膠液，混勻后倒入已封好的凝膠灌制膠模中，插上樣品梳。待膠凝固 后，從膠模上除去封帶，拔出梳子放入電泳槽中，參加足夠量的電泳緩沖液要求緩沖液液面高出凝膠外 表約1 mm。 點(diǎn)樣：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物35卩,與適量的加樣緩沖液Loading buffer, LB混勻假設(shè)為6XLB ,3-5卩擴(kuò)增產(chǎn)物加1 ylX LB，然后用取液器將樣品參加點(diǎn)樣孔中，同時(shí)設(shè)以適宜的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物marker作為參照。 電

21、泳：接通電極，使 DNA 向陽極移動(dòng)，在 110 V/cm 凝膠的電壓下常用 100 V 進(jìn)行電泳。當(dāng) 加樣緩沖液中的溴酚藍(lán)遷移至足夠別離 DNA 片段的距離時(shí)，關(guān)閉電源。 結(jié)果觀察：將電泳好的瓊脂糖膠置于紫外透射儀中，翻開紫外燈，假設(shè)看到橙紅色的核酸條帶， 那么說明有擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物；根據(jù)條帶粗細(xì)，可粗略估計(jì)該條帶的 DNA 量；根據(jù)分子量的標(biāo)準(zhǔn) DNA 對(duì)照，通過線性 DNA 條帶的相對(duì)位置可初步估計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量。如果僅出現(xiàn)預(yù)期分子量大小的條帶 而無非特異性條帶，那么說明擴(kuò)增的特異性較好。如果擴(kuò)增結(jié)果比擬滿意，那么用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行攝影，保存圖像。三PCF擴(kuò)增產(chǎn)物的純化1. 實(shí)驗(yàn)原

22、理。為驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的種或株特異性，往往需對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證。為了建立種、株特異的 PCR診斷技術(shù)，需要確定種、株特異的遺傳標(biāo)記。在這樣的情況下，往往需要將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化， 連接到克隆載體， 轉(zhuǎn)化宿主菌， 然后經(jīng)菌落 PCR 及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定篩選陽性菌落進(jìn)行 測序。獲得純度高的 PCR 產(chǎn)物是進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、測序的前提條件。 PCR 產(chǎn)物的純化方法一般有兩種： 一種是切膠回收， 另一種是 PCR 產(chǎn)物直接回收。 切膠回收的原理就是通過瓊脂糖凝膠電泳， 將要回收的目 的片段從凝膠上切下來， 然后再通過 DNA 膠回收試劑盒進(jìn)行純化， 以去除 DNA 樣品中除了目的基因片段

23、 外的所有雜質(zhì)。而 PCR 產(chǎn)物直接回收法那么是將擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物直接用 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。 兩種方法各有利弊，切膠純化的純度較高，但回收率低； PCR 產(chǎn)物直接純化，回收率高，但純度較低。如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物很特異，且引物長度小于60 bp，那么兩種方法都可選用，但如果有非特異性條帶或引物長度大于 60 bp 時(shí)，就必須用切膠純化的方法。2. 實(shí)驗(yàn)方法、步驟和操作要領(lǐng)。1切膠純化法按生工生物工程上海UNIQ-5柱式DNA交回收試劑盒說明進(jìn)行： 取4050皿PCR產(chǎn)物于0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳約4050 min可適當(dāng)縮短電泳時(shí)間以提高回收效率。注意： 必須將電泳槽用自來水充分

24、沖洗， 電泳緩沖液一定要換新鮮干凈的， 以保證不會(huì)有其它 DNA 污染。 于紫外透射儀中鋪上一塊新鮮的保鮮紙，將凝膠放在保鮮紙上以盡量提高DNA 回收的純度 ，翻開長波紫外燈用干凈的手術(shù)刀快速將目的片段從瓊脂糖凝膠上切下來盡可能去除多余的瓊脂糖膠。切下來的膠塊放入一新鮮、滅菌的 1.5 ml 的離心管中，用電子天平稱重并作好記錄。 按每100 mg瓊脂糖凝膠或100 4的DNA溶液參加400認(rèn)Binding buffer的量來計(jì)算，參加相應(yīng)體 積的Bin di ng buffer，混勻后置于5060C水浴中10分鐘，使膠徹底融化加熱融膠時(shí)，每 2分鐘混勻一 次。 將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套放于2

25、ml收集管的UNIQ-10柱中，室溫放置2 min，用臺(tái)式離心機(jī)高速8000 rpm丨離心1 min。適當(dāng)降低離心轉(zhuǎn)速有助于提高DNA結(jié)合率。 取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的廢液， 將 UNIQ-10 柱放回收集管中， 參加 500 4lWash solution， 高速離心 10000 rpm 30 sec。 重復(fù)步驟“一次。 取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的廢液，將 UNIQ-10 柱放回收集管中，高速離心 10000 rpm 1 min。 將UNIQ-10柱放入一新鮮潔凈的1.5 ml離心管中，在柱膜中央加30 Elution Buffer或雙蒸水pH>7.0到U

26、NIQ-10柱中，室溫或37C放置2 min。提高洗脫溫度至 55-80C有利于提高 DNA的洗脫效率 10000 rpm高速離心1 min，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于 -20 C備用。 取35 UPCR純化產(chǎn)物加適量加樣緩沖液混合，瓊脂糖電泳檢查回收率，可根據(jù)帶的亮度估算 DNA回收純化后的濃度。(2) PCR產(chǎn)物直接純化法按生工生物工程 (上海)UNIQ-5柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明進(jìn)行： 取PCR產(chǎn)物4050 d，參加3倍體積的Binding buffer，混勻。 把混合液轉(zhuǎn)移到套放于 2 ml收集管的UNIQ-10柱中，室溫放置 2 min，用臺(tái)式離心機(jī)高

27、速8000 rpm 離心 1 min 。適當(dāng)降低離心轉(zhuǎn)速有助于提高 DNA 結(jié)合率。 倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一收集管中，參加500 dWash solution，高速離心10000 rpm 30 sec。 重復(fù)“步驟一次。 倒掉收集管中的廢液，將 UNIQ-10 柱放回收集管中，高速離心 10000 rpm 1 min。 將UNIQ-10柱放入一根新鮮潔凈的 1.5 ml離心管中，在柱膜中央?yún)⒓?30 dElution Buffer或雙蒸 水pH>7.0到UNIQ-10柱中，室溫或 37C放置2 min提高洗脫溫度至 55-80C有利于提高 DNA的洗 脫效率。 1

28、0000 rpm高速離心1 min，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于 -20 C備用。 取510 d PCR純化產(chǎn)物加適量加樣緩沖液混合，電泳檢查回收率，可根據(jù)帶的亮度估算DNA回收純化后的濃度。六動(dòng)物寄生蟲病特異PCR診斷技術(shù)實(shí)例以檢測雞柔嫩艾美爾球蟲感染為例，選用 Fernandez 等 2003報(bào)道的柔嫩艾美爾球蟲種特異的引物(Tn-01-F : 5'-CCGCCCAAACCAGGTGTCACG-3'Tn-01-R : 5'-CCGCCCAAACA TGCAAGA TGGC-3 '),建立特異、敏感、快速的特異PCR診斷技術(shù)，用于雞柔

29、嫩艾美爾球蟲感染的診斷及分子流行病學(xué)調(diào)查。1 . PCR反響。 按常規(guī)方法進(jìn)行，在 0.2ml PCR管配制反響液，總體積為25 dL其中：試劑體積 dl10x PCR BufferMgCl 2 25 mM dNTPs2.5 mM each2Forward primer Tn-01-F, 50 pmol/ l d Reverse primerTn-01-R, 50 pmol/ ld ddH2O rTaq 5 U/ dl模板 gDNA1同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照和空白對(duì)照。2 .反響在PCR儀上進(jìn)行。反響條件為：96C預(yù)變性5 min，然后94C變性1min、65C退火2min ,共30個(gè)循環(huán)，最后72 C后延伸7 min。3. 結(jié)果判定。 PCR 產(chǎn)物在 1.0%TBE 瓊脂糖凝膠電泳， 用溴化乙錠染色， 紫外投射儀下觀察結(jié)果。 陽 性對(duì)照可見分子量大小約 530bp 的條帶；臨床樣品如有同樣大小條帶判為陽性；陰性對(duì)照不見擴(kuò)增條帶。四、實(shí)驗(yàn)考前須知一寄生蟲基因組 DNA的提取及純化1操作中所使用的鑷子和剪刀一定要事先滅菌并于超凈工作臺(tái)中紫外照射11.5 h,以保證沒有污染其它 DNA 。2吸取上清液時(shí),應(yīng)注意勿將下層沉淀物吸入以免帶入雜質(zhì),但也不要余下太多上清液,致使DNA損失較多。3整個(gè)操作過程中, 一