電化學(xué)方法測(cè)定羥自由基反應(yīng)速度常數(shù)

1、第32卷第3期2002年6月中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)學(xué)報(bào)JOURNA L OF UNIVER SIT Y OF SCIENCE AN D TECHN OLOG Y OF CHINA Vol. 32,No. 3Jun. 2002文章編號(hào):025322778(2002 0320288205袁倬斌1, 鄒2(1. 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)研究生院化學(xué)系, , 北京100037 摘要:在維生素C A 22, 在( DA 與甲醛、氨通過Hantzsch 反應(yīng), 生成產(chǎn)物3,52二甲酰. “清除劑”, 用電化學(xué)方法監(jiān)測(cè)3,52二甲酰21,42二, 以此求得羥自由基“清除劑”與羥自由基反應(yīng)的反應(yīng)速度常數(shù).關(guān)鍵詞:Hantz

2、sch反應(yīng); 羥自由基; 反應(yīng)速度常數(shù); 電化學(xué)法中圖分類號(hào):O657.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A0引言近年來人們?cè)絹碓街匾曈沙蹶庪x子自由基、H 2O 2等活性氧中間體對(duì)人體的損傷而導(dǎo)致的各種疾病. 其中這些活性氧中間體與一些金屬離子作用會(huì)產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的羥自由基, 其對(duì)生物靶分子如DNA 或生物膜造成危害, 則會(huì)引起某些疾病的發(fā)生或惡化, 如癌癥、衰老、炎癥等損傷.為了研究各種“羥自由基清除劑”的清除能力, 需要尋找簡(jiǎn)單、便捷的測(cè)定“羥自由基清除劑”與羥自由基反應(yīng)的二級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)的方法. 目前常見的方法是通過Fenton 反應(yīng)中產(chǎn)生的羥基自由基與脫氧核糖反應(yīng), 使脫氧核糖降解, 在酸性溶液中加熱可生

3、成M DA ,M DA 再與22硫代巴比妥酸(T BA 反應(yīng)生成紅色產(chǎn)物, 測(cè)定M DA 2T BA 加合物在532nm 處的最大吸收. 如果先加入清除羥自由基的抗氧化劑, 則M DA 的生成量將會(huì)減少, 由此計(jì)算抗氧化劑與羥自由基反應(yīng)的二級(jí)反應(yīng)速度常數(shù), 評(píng)價(jià)其清除羥自由基的能力1. 但是糖類、氨基酸和其它脂肪酸過氧化物也可與T BA 產(chǎn)生真正的T BA 2M DA 加合物, 所以T BA 試驗(yàn)缺乏特異性, 后來人們將T BA 試驗(yàn)與HP LC 法相結(jié)合, 測(cè)量則更精確并更具有特異性2.由于M DA 與醛類化合物、一級(jí)胺類化合物相互作用, 通過Hantzsch 反應(yīng)生成3,52二醛基21,4

4、2取代的二氫吡啶化合物35, 本文利用脫氧核糖與在Fenton 反應(yīng)中產(chǎn)生的羥自由基作用, 經(jīng)過降解生成M DA ,M DA 再與甲醛、氨相互作用, 生成具有電化學(xué)活性的3,52二甲酰21,42二氫吡啶, 通過監(jiān)測(cè)Hantzsch 反應(yīng)產(chǎn)物(3,52二甲酰21,42二氫吡啶 的還原峰, 建立了收稿日期:2000209227基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(29875027;29675022 、中科院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所電分析化學(xué)開放實(shí)驗(yàn)室基金(OC980003;OC200001 、北京市教委基金和北京市自然基金(22972003 資助項(xiàng)目作者簡(jiǎn)介:袁倬斌, 男,1938年生, 教授, 博士生導(dǎo)師.第3

5、期電化學(xué)方法測(cè)定羥自由基反應(yīng)速度常數(shù)289用于考察抗氧化劑清除羥自由基活性和測(cè)定抗氧化劑與羥自由基反應(yīng)的反應(yīng)速度常數(shù)的電化學(xué)方法, 并研究了3,52二甲酰21,42二氫吡啶的電化學(xué)行為.1實(shí)驗(yàn)部分1. 1儀器和試劑MP 21型溶出伏安儀; 滴汞電極為工作電極, ; M odel 264A 電化學(xué)分析儀(EG &G PARC :303, 鉑絲為對(duì)電極;pH 2C 型數(shù)字pH 計(jì).脫氧核糖(DR :110-3m ol/L ; H 2O 3, 實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水.1. 21. 2. 1在10(DR (110-3m ol/L 、0. 1m L 1. 2%H2O 2、510-3m ol/L Vc 、

6、210-4m ol/L Fe 3+、2. 1010-4m ol/L E DT A 和0. 1m ol/L KH 2PO 4+Na 2HPO 4(pH =7. 4 緩沖液, 總體積為6m L , 于37恒溫槽中加熱30min.1. 2. 2Hantzsch 反應(yīng)取出比色管, 加入4m L 0. 1m ol/L HCl 停止Fenton 反應(yīng), 于100沸水中加熱10min , 以便使M DA 完全生成, 然后取出1m L 溶液于另一支10m L 具塞比色管中, 加入0. 1m L 1%甲醛溶液, 再加入0. 04m ol/L NH 3H 2O +0. 4m ol/L NH 4Cl 緩沖液至刻度,

7、 于100加熱10min 后, 取出冷卻, 將溶液轉(zhuǎn)入電解池中進(jìn)行測(cè)量.2結(jié)果與討論2. 1脫氧核糖降解過程和H antzsch 反應(yīng)脫氧核糖降解過程:Fe 2+2E DT A +O 2=Fe 3+2E DT A +O 2-2O 2-+2H +H 2O 2+O 2Fe 2+2E DT A +H 2O 2OH -+OH +Fe 2+2E DT AOH +脫氧核糖碎片酸化、加熱M DAHantzsch 反應(yīng):M DA +CH 2O +NH 33,52二甲酰21,42二氫吡啶2. 2反應(yīng)條件的選擇脫氧核糖與羥基自由基反應(yīng)后形成脫氧核糖過氧化物, 在酸性條件下加熱, 生成M DA 2. 如果向溶液加入

8、NaOH 溶液, 使溶液的pH 為12, 此時(shí)可觀察到M DA 在-1. 35V (vs. SCE 處有一個(gè)還原峰, 但是該峰的靈敏度不高, 而且有一些中藥中的有效成分的還原峰會(huì)產(chǎn)生干擾, 所以本文選擇通過Hantzsch 反應(yīng), 使M DA 轉(zhuǎn)變?yōu)?,52二甲酰21,42二氫吡啶. 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):在Hantzsch 反應(yīng)中,pH 在4. 06. 0范圍之間, 均可生成3,52二甲酰21,42二氫吡啶, 得到峰P 1、P 2這兩個(gè)峰高大致相同的還原峰(-0. 60V , -0. 80V (圖1 , 在pH =2. 00中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)學(xué)報(bào)第32卷2902. 40范圍內(nèi), 峰P 1、P 2的峰電流與

9、pH 無關(guān), 而pH 在2. 406. 0之間, 峰P 1、P 2的E p/ pH 分別為-60mV 和-88mV. 用該方法所得峰P 1、P 2的峰電流靈敏度是在強(qiáng)堿條件下M DA 還原峰電流的20倍左右. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:加熱時(shí)間至少需要8min 才能使Hantzsch 反應(yīng)完全進(jìn)行, 所以本擇進(jìn)行Hantzsch 反應(yīng)的pH 0加熱時(shí)間; 陽離子型表面活性劑四丁基碘化銨、陰離子型表面活性劑十二烷基硫酸鈉、非離子型表面活性劑Triton X 2100均使峰P 1、P 2有不同程度下降; 峰P 1、P 2的常規(guī)脈沖極譜曲線均呈峰形; 峰P 1的%/ 為2. 0(10 、 、 , 峰P 2的溫度

10、系數(shù)(191. 1(2033-0. 12(3442、 、 , 這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表溫度系數(shù)為0. 7(10231. 7(1023-0. 62(3435明峰P 1、P 2具有吸附性質(zhì).2. 3. 2電極反應(yīng)的電子轉(zhuǎn)移數(shù)(n 和質(zhì)子轉(zhuǎn)移數(shù)(m 通過對(duì)峰P 1、P 2的i 2E 曲線進(jìn)行半對(duì)數(shù)分析, 得到一條直線(峰P 1 和一條折線(峰P 2經(jīng)計(jì)算求得:n 1=2. 0、n 2=2. 0、 P 2的半峰寬度分別為42. 7mV 2=0. 62, 實(shí)驗(yàn)得到峰P 1、和52. 0mV , 根據(jù)可逆和不可逆吸波的半峰寬公式W 1/2=90. 6/n (可逆 和62. 5/n (不可逆 , 也可求得n 1=2.

11、 0, pH 的關(guān)系, 求得m 1=2、2n 2=1. 20、2=0. 62, 再根據(jù)E p /m 2=2. 圖1Hantzsch 極譜圖( of the Hantzsch (pH =5. 0 為10min. 2. 32. 121,42二氫吡啶溶液的電毛細(xì)管曲2. 3. 3電極反應(yīng)機(jī)理綜上實(shí)驗(yàn)推測(cè)電極反應(yīng)機(jī)理為:表1葡萄糖與羥基自由基反應(yīng)的反應(yīng)速度常數(shù)T ab. 1The reaction rate constants of glucose with hydroxyl radicals -1K S /109M -12. 12. 65T BA 2M DA 法11. 02. 0T BA 2M DA

12、 法11. 01. 81. 7方法本法脈沖光解法1二甲亞砜法62. 4應(yīng)用在Fenton 反應(yīng)中, 若有某種抗氧化劑與羥基自由基反應(yīng), 則其與脫氧核糖相互競(jìng)爭(zhēng), 與羥基自由基反應(yīng), 這樣M DA 的量就會(huì)減少, 根據(jù)M DA 的減少量, 可得出該物質(zhì)清除羥基自由基的能力. 抗氧化劑與羥自由基反應(yīng)的二級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)可由下面公式得出:第3期電化學(xué)方法測(cè)定羥自由基反應(yīng)速度常數(shù)291i 0/i =1+K S S/K DR DRi 0為無抗氧化劑時(shí)3, 52二甲酰21, 42二氫吡啶時(shí)還原峰的峰電流, i 為有抗氧化劑存在時(shí)還原峰的峰電流,DR為脫氧核糖的濃度,K DR 為脫氧核糖與羥基自由基反應(yīng)的二級(jí)

13、反應(yīng)速度常數(shù), 等于1. 9109M -1s -11,S為抗氧化劑清除劑的濃度, K S 為清除劑與羥基自由基反應(yīng)的二級(jí)反應(yīng)速度常數(shù). (表1 , 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 本法的結(jié)果與文獻(xiàn)值基本吻合.如果該物質(zhì)是中藥中的有效成份, 可通過監(jiān)測(cè)3,51,42化, 求出該有效成份清除羥基自由基的Ic 50(. 表2Ic 50和反應(yīng)速度常數(shù), 其中與O 2-反應(yīng)的Ic .表2O 2-和OH 的Ic 50及其與OH 反應(yīng)的反應(yīng)速度常數(shù)T ab. 50of consituent in Chinese T raditionanl Herbal Drugs with for hydroxyl radicalanio

14、n radical and their reaction rate constants which react with hydroxyl radical化合物槲皮素穿心蓮內(nèi)酯土木香內(nèi)酯甘草酸甘草次酸清除O 2-的925363038清除OH 的429610089105與OH 反應(yīng)的10-1-1與OH 反應(yīng)的10-1-14. 01. 81. 71. 91. 61106參考文獻(xiàn)cence of 1, 42dihydropyridine derivatives relevantto age pigments J .Chem. Pharm. Bull. ,1987,35:465624660. 1Hal

15、liwell B , G utteridge J M C , Aruoma O I. The deoxyribose method :a simple “test 2tube ”assay for determination of rate constants for the reactionsof hydroxyl radicalsJ.Anal. Biochem. , 1987,165:2152219.2Cheeseman K H , Beavis A , Hermann E. Hydrox 2yl 2radical 2induced iron 2catalysed degradation

16、ofdeoxyriboseJ.Biochem. J. , 1988, 252:6492653.3K ikugawa K, K ato T , I wata A. Determination ofmalonaldehyde in oxidized lipids by the Hantzschfluorometric method J.Anal. Biochem. , 1988,174:5122521.4K ikugawa K, Nakahara T , Sakurai K. Fluores 25Nalr V , O fferman R J , Turner G A , et al. Fluo 2

17、rescent 1,42dihyropyridines :the malondialdehyde connection J .T etrahedron , 1988, 44(10 :279322803. 6Rekka E , K ourounakis P N. E ffect of hydroxyethyl rutosides and related compounds on lipid peroxida 2tion and free radical scavenging activity. S ome structural aspects J .J Pharm. Pharmacol. , 1

18、991, 43:4862491. 7鄒洪, 袁倬斌. 鄰苯三酚自氧化的電化學(xué)研究J.分析試驗(yàn)室,1997,16(4 :125.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)學(xué)報(bào)第32卷292A Simple Assay for Determination of R ate Constants for R eactions of H ydroxyl R adicals by E lectrochemical MethodY UAN Zhuo 2bin 1, Z OU H ong 2(1. Department o f Chemistry , Graduate School , Chinese Academy o f , (2

19、. Department o f Chemistry , Capital Normal Abstract :Hydroxyl radicals , generated by an plex with H 2O 2in the pres 2ence of ascorbic acid , attack to (M DA at low pH. M DA can react with formaldehyde conditions to form 1,42dihydropyrindine 23,52dicar 2“scavengers ”com pete with deoxyribose for the hydroxyl radicals produced 1,42dihydropyrindine 23,52dicarbaldehyde formation. A rate constan