石榴皮中烏索酸和齊墩果酸含量的反相高效液相色譜測(cè)定

1、石榴皮中烏索酸和齊墩果酸含量的反相高效液相色譜測(cè)定         【摘要】  目的建立反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定石榴皮中烏索酸和齊墩果酸的含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察。方法色譜柱為Kromasil C18分析柱 (4.6 mm×250 mm, 5 m)，流動(dòng)相為甲醇-水-磷酸(88120.1)，流速0.8 ml·min-1，光電二極管陣列檢測(cè)器（PAD），檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫28 。結(jié)果在選定色譜條件下線(xiàn)性范圍良好，烏索酸和齊墩果酸的樣品加樣回收率分別為99.3%和98.5 %，RS

2、D為2.20%和1.78%。結(jié)論方法測(cè)定快速，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于石榴皮中烏索酸和齊墩果酸含量的定量分析。 【關(guān)鍵詞】  石榴皮 高效液相色譜法 烏索酸 齊墩果酸 光電二極管陣列檢測(cè)器Abstract:ObjectiveTo develop a quantitative method for simultaneous determination of ursolic acid and oleanolic acid in Cortex Granati by RP-HPLC.MethodsHPLC with photodiode array detector (PAD) was car

3、ried out on Kromasil C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 m) at 28 using methanol-water- phosphoric acid (88120.1) as mobile phase with a flow rate of 0.8 ml·min-1 and detected wavelength was at 210 nm.ResultsThe good linear relationship was obtained under the optimum conditions. The recoveries of

4、 the standards added for ursolic acid and oleanolic acid were 99.3% and 98.5%, respectively, while the relative standard deviations was 2.20 % and 1.78%. ConclusionThe method is rapid and precise.It can be used to determine the ursolic acid and oleanolic acid in Cortex Granati.Key words:Cortex Grana

5、ti;  HPLC;  Ursolic acid;  Oleanolic acid ;   Photodiode array detector石榴皮是石榴科植物石榴Punica granatum L.的干燥果皮，味酸、澀，性溫，具有澀腸止瀉、止血、驅(qū)蟲(chóng)之功效，可用于久瀉、久痢、便血、蟲(chóng)積腹痛等的治療，為歷版中國(guó)藥典所收錄，含量測(cè)定項(xiàng)以鞣質(zhì)為定量標(biāo)準(zhǔn)1。石榴皮含多種化學(xué)成分，如沒(méi)食子酸、石榴皮亭A、石榴皮亭B、鞣云實(shí)精、鞣花酸、安石榴林等2。安明等3研究了石榴中烏索酸的最佳提取工藝條件，并按中國(guó)藥典1995年版部山茱萸項(xiàng)下方法測(cè)定了石榴中烏索酸的

6、含量，但石榴皮中烏索酸和齊墩果酸的成分鑒定研究和含量測(cè)定均未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了石榴皮中烏索酸和齊墩果酸的含量，并進(jìn)行了定性鑒別，為藥材的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1  儀器與試藥1  儀器  高效液相色譜儀（515型泵，2996光電二極管矩陣檢測(cè)器，柱溫箱，Empower中文色譜工作站，美國(guó)）； CP225D分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；KS-1500超聲提取儀器(寧波科盛儀器廠(chǎng))。2   試藥 甲醇，色譜純（上海陸忠試劑廠(chǎng)）；95 %乙醇，分析純（江西同盟試劑廠(chǎng)）；水為高純水；烏

7、索酸和齊墩果酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110742-200314、110709-200304，供含量測(cè)定用)。石榴皮，市售。2  方法與結(jié)果2.1  檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取對(duì)照品和石榴皮樣品溶液進(jìn)樣，使用PAD檢測(cè)器在190600 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行光譜掃描，流動(dòng)相中烏索酸和齊墩果酸的紫外光譜吸收特征一致，最大吸收波長(zhǎng)均為202.2 nm (見(jiàn)圖1)。為了消除流動(dòng)相在短波長(zhǎng)處的末端干擾，提高信噪比，提取不同波長(zhǎng)的色譜圖進(jìn)行比較，選擇210 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)信噪比高，基線(xiàn)平穩(wěn)。2.2  色譜條件色譜柱：Kromasil C18柱（4.6 mm×250

8、 mm，5 m)；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（88:12:0.1）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流速：0.8 ml/min；柱溫：28；進(jìn)樣量：20 l。外標(biāo)法定量分析，烏索酸和齊墩果酸分離度為1.95，理論塔板數(shù)均大于13 000。烏索酸、齊墩果酸對(duì)照品和石榴皮樣品溶液色譜見(jiàn)圖2。2.3  峰純度分析采用Empower色譜軟件適應(yīng)性模塊對(duì)此波長(zhǎng)的色譜峰進(jìn)行純度分析，對(duì)照品和樣品中烏索酸和齊墩果酸色譜峰的純度角值均小于閾值，純度角線(xiàn)均位于自動(dòng)閾值線(xiàn)下方，證實(shí)色譜峰為單一組分吸收率。烏索酸和齊墩果酸的色譜峰純度分析見(jiàn)圖3。      

9、   2.4  溶液配制分別精密稱(chēng)定烏索酸、齊墩果酸對(duì)照品3.59 mg和1.74 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對(duì)照品混合溶液，備用。2.5   線(xiàn)性關(guān)系考察分別精密吸取烏索酸和齊墩果酸對(duì)照品混合溶液中1，4，8，12，16 l進(jìn)樣分析，按色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(g)為橫坐標(biāo)，峰面積(V·s)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性擬合，得烏索酸線(xiàn)性回歸方程為：Y=6.44×105X-5.83×104（r=0.999），齊墩果酸線(xiàn)性回歸方程為：Y=7.54×105X-3.70

10、15;104(r=0.999)。表明當(dāng)烏索酸進(jìn)樣量在0.3595.744 g，齊墩果酸進(jìn)樣量在0.1742.784 g時(shí)，線(xiàn)性關(guān)系良好。2.6  精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取烏索酸和齊墩果酸的對(duì)照品混合液進(jìn)樣分析，平行5次，測(cè)得烏索酸峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.47%（n=5），齊墩果酸峰面積RSD為0.66 %（n=5）。表明進(jìn)樣方法和儀器系統(tǒng)精密度良好。2.7  重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)精密稱(chēng)取同一批石榴皮樣品5份，制備樣品溶液，進(jìn)樣分析。測(cè)得烏索酸峰面積RSD為1.49 %（n=5），齊墩果酸峰面積RSD為2.05 %(n=5)，表明重現(xiàn)性良好。2.8  加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)

11、取已知烏索酸和齊墩果酸含量的石榴皮樣品6份，分高、中、低3種濃度分別加入烏索酸和齊墩果酸對(duì)照品適量，樣品同時(shí)處理，制備石榴皮樣品溶液，進(jìn)樣分析，測(cè)定樣品中烏索酸和齊墩果酸的含量，計(jì)算加樣回收率。烏索酸和齊墩果酸的平均加樣回收率分別為99.3%（RSD=2.20%）和98.5%（RSD=1.78%）。2.9   樣品含量的測(cè)定取不同石榴皮樣品溶液在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，平行3次，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算烏索酸和齊墩果酸平均含量。不同石榴皮樣品中烏索酸和齊墩果酸存在較大差異，但兩者相對(duì)含量較為穩(wěn)定，烏索酸含量約為齊墩果酸的2.5倍。結(jié)果見(jiàn)表1。表1  石榴皮中烏索酸

12、和齊墩果酸的含量（略）3  討論采用二極管陣列檢測(cè)器掃描分離組分的紫外吸收光譜快速、簡(jiǎn)便，可快速確定被檢測(cè)組分在色譜流動(dòng)相中的最大吸收波長(zhǎng)，提取不同波長(zhǎng)的色譜進(jìn)行比對(duì)，能在有效消除背景干擾時(shí)保證檢測(cè)的靈敏度4。HPLC法定量分析，一般采用紫外檢測(cè)器，以保留時(shí)間定性，峰面積定量。但由于色譜方法的定量能力強(qiáng)而定性能力弱，對(duì)于成分復(fù)雜的中藥樣品來(lái)說(shuō)，往往有不同的組分在同一時(shí)間或極相近的時(shí)間出峰，甚至兩組分完全疊加，因而只用保留時(shí)間定性可能會(huì)造成分析結(jié)果產(chǎn)生意外誤差。二極管陣列檢測(cè)器可以同時(shí)在設(shè)定波長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)的各波長(zhǎng)下進(jìn)行立體數(shù)據(jù)采集，既可以察看各波長(zhǎng)下的色譜圖又可以察看各時(shí)間下的光譜圖，在比

13、對(duì)保留時(shí)間的基礎(chǔ)之上，加以光譜確認(rèn)，因而可以克服僅以保留時(shí)間一項(xiàng)指標(biāo)定性的缺點(diǎn)，增強(qiáng)了定性的確定性。此外，二極管陣列檢測(cè)器與Empower色譜工作站系統(tǒng)適應(yīng)性軟件聯(lián)用，可分析組分色譜峰峰純度，進(jìn)一步增強(qiáng)色譜方法的定性能力5。烏索酸和齊墩果酸為同分異構(gòu)體，屬五環(huán)三萜類(lèi)化合物，結(jié)構(gòu)和極性相似，紫外分光光度法和薄層色譜法均難以使2組分有效地分離，測(cè)定的結(jié)果為烏索酸和齊墩果酸的總含量。采用本文建立的HPLC法測(cè)定時(shí)烏索酸和齊墩果酸達(dá)基線(xiàn)分離，分離度大于1.95。經(jīng)光譜歸一化和峰純度積分分析，烏索酸和齊墩果酸色譜峰均為單一組分峰5。【參考文獻(xiàn)】  1國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典，部S.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005：63. 2李海霞,王 釗,劉延澤.石榴科植物化學(xué)成