神經(jīng)生物學常用形態(tài)學研究方法-病理學精品課

1、組織材料的處理組織材料的處理1.固定(fixation) 目的：防止組織自溶，保護組織免受微生 物侵襲，保存組織成份不被破壞丟失， 維持組織結構使之正確的反應生活狀態(tài)。 固定劑：4%多聚甲醛（常用） 方法：浸泡固定，灌注固定2.切片(section)：石蠟切片，冰凍切片一、一般染色方法一、一般染色方法（一）尼氏染色方法（一）尼氏染色方法(Nissl staining)： 1. 1.定義：定義： 是用堿性染料染神經(jīng)組織的一種方法，神經(jīng)組織中可與堿性染料結合的主要成份是核酸，神經(jīng)元胞體中有大量核糖核酸，主要以尼氏小體的形式存在。細胞核中染色質少，故染色淺，但有明顯的核仁。神經(jīng)膠質細胞的核中染色質較

2、多，著色較深，但胞漿不著色。電鏡下尼氏小體是許多規(guī)則平行排列并相互夠通的粗面內(nèi)質網(wǎng)以及其間的游離核糖體組成。焦油紫（cresyl violet）硫堇（thionine）甲苯胺藍 (toluidine blue)2.用于尼氏染色的常用染料有用于尼氏染色的常用染料有：石蠟切片或冰凍切片 0.1%焦油紫染液375-10min 烝餾水洗 70%Alc 3min 95%Alc 3min 100%Alc 1min3次 二甲苯5min 2次 封片。結果:尼氏小體紫色，本底無色。焦油紫染色法:DLGDRGCresyl violet staining Thionine stainingCresyl violet

3、 staining高爾基技術高爾基技術(Golgi technique) The Golgi (and related) methods work by staining tissue with silver nitrate which is then reduced to silver. This produces uniform dark coloring of the whole neuron . The morphology of dendrites and axon can be studied in detail.Cerebellum cortex neuron 利用軸漿運輸現(xiàn)象追

4、蹤神經(jīng)元之間聯(lián)系的一種方法。 示蹤劑：HRP（horse radish peroxidase，辣根過氧化物酶），快藍（fast blue），熒光金（fluorogold），核黃（nuclear yellow），神經(jīng)生物素（neurobiotin），生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran amine,BDA）神經(jīng)束路示蹤神經(jīng)束路示蹤 1，HRP的引入：壓力注射法，電泳法，緩釋法 2，Survial time：（束路長度 毫米/350毫米）+1日 3，F(xiàn)ixation and Section 4，Incubation Procedure: a,wash sections bri

5、efly in three changes of PB b,move the sections to the incubating medium (0.2%DAB,1%H2O2) kept at room temperature for 30-40min. c,wash three times in PB for stop the reaction. d,mounting and observation.HRP Tracing ExperimentHRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat 10 40HRP labelling neur

6、ons in dLGN40Double-labelling of HRP and Glutamate in rat lateral geniculate nucleus 熒光染料示蹤法熒光染料示蹤法1，熒光染料的配制：，熒光染料的配制：2，熒光染料的注射：，熒光染料的注射：3，動物存活期：一般存活，動物存活期：一般存活2-4天。天。4，灌注固定、取材、冰凍切片。，灌注固定、取材、冰凍切片。5，貼片后熒光顯微鏡觀察：熒光容，貼片后熒光顯微鏡觀察：熒光容易褪易褪 色，貼片后應立即觀察。色，貼片后應立即觀察。 Fast blue labelling neuronsDRGSpinal cord2020

7、Fast BlueLadellingGanglion Cells of Retina 20 NO(nitric oxide)的生物合成： 催化NO生物合成的酶稱一氧化氮合酶（NO synthase, NOS), NOS以L-精氨酸（L-arg)和分子氧為底物，消耗1.5mol NADPH和2mol分子氧生成NO和L-瓜氨酸。 NADPH:nicotinamide adenin dinucleotide phosphate Diaphorase:黃遞酶 在神經(jīng)系統(tǒng)大部分區(qū)域NADPH-d組織化學染色和NOS免疫組織化學染色一致。NADPH-diaphorase組織化學染色法 Nos活性：a.協(xié)同

8、因子有Ca2+、CaM、NADPH阻斷任何一個協(xié)同因子結合位點都可抑制Nos b.底物:L-Arg NADPH-d活性:a:不需CaM、Ca2+作為協(xié)同因子，只需NADPH b；底物：NBT(亞硝基四唑氮藍）NOS與與 NADPH-d活性的比較活性的比較NOS活性NADPH-d活性,使用NOS抑制劑后不能用NADPH-d組化染色來分析NOS活性。NADPH-d組化染色陽性細胞中可含有NOS,但不能說明有NOS 活性，NADPH-d組化染色陰性細胞中一般不含NOS. a:冰凍切片b:0.05M Tris緩沖液漂洗c:于含0.2%Tritonox-100的Tris緩沖液中室溫下預孵育510min.

9、d:在含0.3%Tritonx-100,1mg/mlNADPH,0.5mg/mlNBT的Tris緩沖液中37孵育11.5小時. e:Tris緩沖液漂洗，中止反應。NADPH-d組化染色NADPH-d Staining In Caudate NucleusNADPH-d Staining In Caudate Nucleus40NADPH-d staining nNOS-ir4040NADPH-d stainingnNOS-ir4040 利用特異性抗體對神經(jīng)組織中某種特異成份(抗原)進行抗原-抗體反應,達到檢測組織細胞內(nèi)是否有此特異性物質.其本質就是用標記的抗體追蹤抗原(以確定組織細胞內(nèi)的某種化

10、學物質).免疫組織化學(Immunohistochemistry)應應 用用 與與 評評 價價 應用：a.用已知抗體探測未知抗原：受體、酶、 遞質、肽類、細胞骨架蛋白等。 b.示蹤:示蹤物抗體與示蹤物反應。 c.用已知抗原探測未知抗體。 d.原位雜交的后續(xù)部分。 結果評價:有陽性產(chǎn)物，說明細胞內(nèi)有此物質， 但是否由此細胞產(chǎn)生不能完全肯定。 定量:陽性細胞數(shù)、 灰度值或光密度值。 1.Tissuue preparation:perfusion,section 2.Blocking:封閉，異種蛋白質間會有非特異性結合，常用正常羊血清（NGS）或牛血清白蛋白（BSA）封閉。 3.Incubate i

11、n primary antibody:最佳濃度需摸索，為提高抗體向組織內(nèi)穿透，可在抗體稀釋液中加入0.1%0.3%TritonX-100。需長時間孵育時應加入0.01%0.3%NaN3防腐。 產(chǎn)生一抗的動物一定要知道，以便選擇二抗。Immunohistochemical procedures4,Washing:去掉非特異性結合5, Incubate in second antibody :濃度1/100200,二抗必須針對一抗動物種屬，二抗上結合的物質不同，顯色用不同方法：ABC，PAP，熒光顯色，IGSS。ABC，PAP經(jīng)典、產(chǎn)物穩(wěn)定，熒光法不需三抗，不需脫水透明。但熒光易淬滅。IGSS非常

12、敏感，不用DAB做反應，但背景難以控制。7，ABC復合物（avidin-biotin complex)or PAP復合物（ peroxidase-anti-peroxidase complex)孵育， 濃度1:100（或200）。8，React with DAB: DAB能致癌，在強光下可氧化（應盡量避光），68分鐘出現(xiàn)陽性產(chǎn)物，鏡下控制反應。對照實驗對照實驗 1.陰性對照： a、NGS 或緩沖液代替一抗 b、去二抗 c、吸附實驗：一抗加入后，再加入相應抗原，將抗體與過量的抗原一起孵育一段時間后，此混合液再作免疫組化染色 2.陽性對照： PBS洗片 0.5%3%H2O2 15min(滅活內(nèi)源性

13、過氧化物酶) PBS洗片 5-10%NGS(或510%BSA)+0.2%TritonX-100 孵育12h( 封閉) 一抗4過夜 PBS洗片5min 3次 二抗24h室溫 PBS洗片5min 3次 ABC 12h PBS洗片10min 3次 DAB顯色GAP-43-ir neurons in spinal cordNS groupAnti-BDNF group2020NeuN-ir40 S-100-ir of sciatic nerve20 S-100-ir of Schwann cellsC-FOS-ir2020 Neuronal stem cell spheres10 Nestin-ir1

14、010Map-2 irMap-2-ir4040GFAP-ir40 40404040TH-irChAT-irGAD-irGABAAR-ir NF 200-ir of sciatic nerveBrdu-ir of retia1010GFAP-irP75-ir40X40X原位雜交原位雜交(IN SITU HYBRIDIZATION)(IN SITU HYBRIDIZATION) 原位核酸分子雜交技術（In situ nucleic acid molecular hybridization)簡稱原位雜交技術。是用標記的NDA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內(nèi)待定核酸序列的方法。根據(jù)所用探針和靶核酸

15、的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交。基基 本本 原原 理理 堿基互補配對原則 待測mRNA: 探針(probe): digoxin-AGTCTAGT- + -UCAGAUCA- 一定溫度、時間與條件 -AGTCTAGT- -UCAGAUCA- + digoxin抗體 digoxin 堿性磷酸酶-AGTCTAGT- -UCAGAUCA- 堿性磷酸酶 digoxin digoxin抗體 + NBT 顯色探針的類型 1.cDNA probe：雜交反應有較高的專一性。因其為雙鏈結構，需加熱變性解鏈。解鏈后只有半數(shù)DNA鏈與特定的mRNA雜交，另一半DNA鏈

16、則與mRNA競爭，并導致DNA鏈的自我“退火”（既重新形成雙鏈）。 2.mRNA probe（互補的RNA）：為單鏈結構，雜交反應專一性高，雜交鏈穩(wěn)定，制備復雜。 3.Oligonucleotide probe:由DNA合成儀合成，制備簡單，由于鏈不長，又是單鏈，較易穿過組織，操作方便，但雜交鏈因其鏈短而不夠穩(wěn)定。Procedures of In Situ HybridizationProcedures of In Situ Hybridization 1.Preparation of tissue: a.組織取材：盡可能新鮮，由于組織RNA降解較快，新鮮組織和培養(yǎng)細胞最好在本30min內(nèi)固定

17、。取材時應戴手套，防止外源性RNA污染。 b.固定：4%多聚甲醛，灌注固定時固定劑的用量一般為動物體重的2倍，浸泡固定時，組織與固定劑的體積比不低于己于1:10。 C.切片：冰凍切片或石蠟切片。2.prehybridization treatment 增強組織的通透性和探針的穿透性： a.稀酸和酸酐(0.2N HCL,0.25%acetic anhybdride)處理：防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結合。 b.去污劑(0.010.3%TritonX-100)處理：增強組織的通透性，利于探針進入組織細胞。 c.蛋白酶(proteinase K)處理:消化包圍靶核酸的蛋白質，使經(jīng)固定后被遮蔽的

18、靶核酸暴露，以增加探針對靶核酸的可及性。Prehybridization 雜交前用不含探針的雜交緩沖液在雜交溫度下孵育一定時間，以阻斷標本中可能與探針產(chǎn)生非特異性結合的位點，達到降低背景的目的。 為防止外源性RNA酶污染，雜交前處理過程中都需要戴消毒手套，實驗所用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一天置高溫（180）烘烤，雜交前及雜交時所用的溶液均需經(jīng)高溫消毒處理。Hybridization 1.cDNA探針需變性解鏈：95100，510min，探針變性后要馬上進行雜交反應。 2 .雜交液：除含一定量的標記探針外，還含有較高濃度的鹽類（高度Na+可使雜交率增加，減低探針與標本之間的靜電結合）；甲酰胺（

19、可使雜交溫度降低）；硫酸葡聚糖（能與水結合，減少雜交液的有效容積，提高探針有效濃度）；BSA、載體DNA與RNA（變性鯡魚精DNA、酵母轉運RNA）（阻斷探針與組織結構成分之間的非特異性結合，減低背景）。 雜交溫度：雜交溫度： 當雜交液含50%甲酰胺，鹽濃度為0.75mol左右時,cDNA探針雜交溫度約為42,mRNA探針為5055,寡核苷酸探針約為37 雜交時間雜交時間: 一般為1620h,雜交反應時間不要超過24h,反應時間過長,形成的雜交體會自動解鏈,雜交信號反而減弱雜交后處理雜交后處理: 系列不同濃度、不同溫度的鹽溶液的漂洗，除去未參與雜交的過剩的探針，除去探針與組織標本之間的非特異性

20、結合。 雜交體的檢測：雜交體的檢測： 非放射性核酸雜交，可用酶檢測系顯色（同免疫組織化學）原為雜交的對照原為雜交的對照 陽性對照陽性對照 1、已知陽性組織對照 2、Northern或Southern印跡反應 3、免疫組織化學 陰性對照陰性對照 1、已知陰性組織 2、正義RNA(Sense RNA)探針 3、省去探針 4、雜交前用RNA酶或DNA酶處理標本 5、檢測系統(tǒng)的陰性對照GAP-43mRNA positive neuron in spinal cord 10NS groupAnti-BDNF groupThe expression of synapsin 1 mRNA in the spinal cord anterior horn40Synaptoptophysin mRNA positive neurons in hippocampus10 C-ret mRNA positive neurons in spinal cord40 abFig. a The expression of c-ret mRNA in the dentate gyrus of rat hippoca