基因工程制藥9,10,11,12,13節(jié)

1、基因工程制藥基因工程制藥9,10,11,12,139,10,11,12,13節(jié)節(jié)一、概一、概 述述 高密度發(fā)酵：培養(yǎng)液中工程菌的菌體濃度在高密度發(fā)酵：培養(yǎng)液中工程菌的菌體濃度在50g DCW/L（細胞干重（細胞干重/L）以上，最高）以上，最高200g DCW/L 外源基因表達產(chǎn)量與單位體積產(chǎn)量正相關(guān)；外源基因表達產(chǎn)量與單位體積產(chǎn)量正相關(guān)； 單位體積產(chǎn)量與細胞濃度和單個細胞平均表達產(chǎn)量正相單位體積產(chǎn)量與細胞濃度和單個細胞平均表達產(chǎn)量正相關(guān)。關(guān)。 高密度發(fā)酵是在單個細胞平均表達產(chǎn)量不變的前提下，高密度發(fā)酵是在單個細胞平均表達產(chǎn)量不變的前提下，通過單位體積的菌體數(shù)量的倍增，實現(xiàn)總表達量的提高。通過單

2、位體積的菌體數(shù)量的倍增，實現(xiàn)總表達量的提高。高密度發(fā)酵特點高密度發(fā)酵特點 菌體高密度，總表達量高菌體高密度，總表達量高 生物反應(yīng)器體積小生物反應(yīng)器體積小 單位體積生產(chǎn)能力高單位體積生產(chǎn)能力高 生產(chǎn)周期短，分離成本小生產(chǎn)周期短，分離成本小一、影響高密度發(fā)酵的因素一、影響高密度發(fā)酵的因素 1.培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：C源、源、N源種類和含量；源種類和含量；C:N含量比值；微量元素；含量比值；微量元素；無機鹽（磷影響表達質(zhì)粒的復制速率）無機鹽（磷影響表達質(zhì)粒的復制速率） 2.溶氧濃度：溶氧濃度：空氣分離系統(tǒng)提高氧分壓；透明顫菌血紅蛋白基空氣分離系統(tǒng)提高氧分壓；透明顫菌血紅蛋白基因克隆到菌體中，提高氧傳質(zhì)能力

3、；菌體與小球藻混合培養(yǎng)，藻因克隆到菌體中，提高氧傳質(zhì)能力；菌體與小球藻混合培養(yǎng)，藻細胞光合作用產(chǎn)氧供菌體呼吸。細胞光合作用產(chǎn)氧供菌體呼吸。 值：值：大腸桿菌產(chǎn)酸、大腸桿菌產(chǎn)酸、CO2必須加堿調(diào)節(jié)必須加堿調(diào)節(jié)pH值值 4.溫度：溫度：控制菌體生長，溫控誘導表達（誘導時機和持續(xù)時間，控制菌體生長，溫控誘導表達（誘導時機和持續(xù)時間，對數(shù)生長期，對數(shù)生長期，2min） 5.代謝副產(chǎn)物：代謝副產(chǎn)物： C源物質(zhì)供應(yīng)超過三羧酸循環(huán)或電子傳遞鏈能源物質(zhì)供應(yīng)超過三羧酸循環(huán)或電子傳遞鏈能力，產(chǎn)生乙酸，抑制菌體生長和蛋白表達。采取流加補料法，或力，產(chǎn)生乙酸，抑制菌體生長和蛋白表達。采取流加補料法，或加入甘氨酸、甲硫

4、氨酸抑制乙酸生成。加入甘氨酸、甲硫氨酸抑制乙酸生成。二、實現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法二、實現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法 1.發(fā)酵條件的改進發(fā)酵條件的改進 （1）培養(yǎng)基的選擇：）培養(yǎng)基的選擇：6g/L的甘油作碳源（縮短工程菌的利用的甘油作碳源（縮短工程菌的利用時間），各組分濃度較普通提高時間），各組分濃度較普通提高23倍。倍。 （2）建立流加式培養(yǎng)方式：）建立流加式培養(yǎng)方式：營養(yǎng)液（補料）分批維持菌體營養(yǎng)液（補料）分批維持菌體高生長速率時添加。補料分批發(fā)酵包括：反饋補料（恒速補料、高生長速率時添加。補料分批發(fā)酵包括：反饋補料（恒速補料、變速補料、指數(shù)補料）；非反饋補料（恒溶氧法、變速補料、指數(shù)補料）；非反饋補料（

5、恒溶氧法、pH法、菌體濃法、菌體濃度反饋法）。度反饋法）。 （3）提高供氧能力：）提高供氧能力：加壓、純氧、加壓、純氧、H2O2、提高氧傳質(zhì)能力等。、提高氧傳質(zhì)能力等。 2.構(gòu)建產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌構(gòu)建產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌（1）阻斷乙酸生產(chǎn)的主要途徑：）阻斷乙酸生產(chǎn)的主要途徑：用基因敲除技術(shù)或基因突變技術(shù)使用基因敲除技術(shù)或基因突變技術(shù)使大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（大腸桿菌的磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶（PTA）基因）基因pta1和乙酸激酶和乙酸激酶(ACK)基因基因acka失失活，使丙酮酸到乙酸的合成途徑被中斷。活，使丙酮酸到乙酸的合成途徑被中斷。（2）對碳代謝流進行分流：）對碳代謝流進行分流：丙酮酸

6、脫羧酶和乙醇脫氫酶丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶可將丙酮酸可將丙酮酸轉(zhuǎn)成乙醇，毒性小于乙酸。轉(zhuǎn)成乙醇，毒性小于乙酸。（3）限制進入糖酵解途徑的碳代謝流：）限制進入糖酵解途徑的碳代謝流：用基因敲除技術(shù)將磷酸轉(zhuǎn)移用基因敲除技術(shù)將磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（酶系統(tǒng)（PST）酶）酶的的ptsG基因破壞，降低葡萄糖的攝取速率?；蚱茐?，降低葡萄糖的攝取速率。（4）引入血紅蛋白基因：透明顫菌血紅蛋白基因）引入血紅蛋白基因：透明顫菌血紅蛋白基因vgb導入大腸桿導入大腸桿菌，菌，提高氧傳質(zhì)能力，耐缺氧環(huán)境。提高氧傳質(zhì)能力，耐缺氧環(huán)境。 3.構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 rpoH基因編碼大

7、腸桿菌基因編碼大腸桿菌RNA聚合酶的聚合酶的r32亞基，亞基， r32亞亞基對多種蛋白水解酶的活力正調(diào)控?；鶎Χ喾N蛋白水解酶的活力正調(diào)控。 構(gòu)建構(gòu)建rpoH基因缺陷的突變株，降低蛋白水解酶的活力?；蛉毕莸耐蛔冎辏档偷鞍姿饷傅幕盍?。p 基因工程藥物都是多肽或蛋白質(zhì)，其特點為：基因工程藥物都是多肽或蛋白質(zhì)，其特點為： 表達產(chǎn)物在初始物料中含量較低；表達產(chǎn)物在初始物料中含量較低； 含有大量細胞及代謝產(chǎn)物、殘留培養(yǎng)基、無機鹽；含有大量細胞及代謝產(chǎn)物、殘留培養(yǎng)基、無機鹽； 表達產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活、變性；表達產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活、變性； 表達產(chǎn)物的種類繁多、結(jié)構(gòu)不一、活性各異；表達產(chǎn)物的種類繁多、

8、結(jié)構(gòu)不一、活性各異； 應(yīng)用廣，對其質(zhì)量純度要求高、無菌、無熱源。應(yīng)用廣，對其質(zhì)量純度要求高、無菌、無熱源。一、建立分離純化工藝的根據(jù)（各種因素）一、建立分離純化工藝的根據(jù)（各種因素） 含目的產(chǎn)物的起始物料的特點（上游過程的各種因素對分離、純含目的產(chǎn)物的起始物料的特點（上游過程的各種因素對分離、純化工藝的影響）包括：化工藝的影響）包括： 菌種的類型及其代謝特性、產(chǎn)物、副產(chǎn)物。原材料和培養(yǎng)基菌種的類型及其代謝特性、產(chǎn)物、副產(chǎn)物。原材料和培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量是否穩(wěn)定。生產(chǎn)工藝和條件。的來源及其質(zhì)量是否穩(wěn)定。生產(chǎn)工藝和條件。 初始物料的理初始物料的理化性質(zhì)、生物學性質(zhì)。化性質(zhì)、生物學性質(zhì)。 物料中雜質(zhì)

9、的種類和性質(zhì)。物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。目的產(chǎn)物特性。目的產(chǎn)物特性。產(chǎn)品質(zhì)量的要求產(chǎn)品質(zhì)量的要求二二 、分離純化的基本過程、分離純化的基本過程 發(fā)酵液發(fā)酵液 細胞分離細胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物 胞外產(chǎn)物胞外產(chǎn)物 細胞破碎細胞破碎 固液分離固液分離 濃縮濃縮 初步分離初步分離 高度純化高度純化 制劑制劑 產(chǎn)品產(chǎn)品包含體包含體 細胞碎片分離細胞碎片分離 變性變性 復性復性三三. .細胞破碎細胞破碎1.1.物理破碎法物理破碎法 （1 1）高壓勻漿法）高壓勻漿法 （2 2）高速珠磨法）高速珠磨法 （3 3）超聲破碎法）超聲破碎法 （4 4）高壓擠壓法）高壓擠壓法2.2.化學破碎法化學破碎法 （1 1）滲透

10、沖擊）滲透沖擊 （2 2）增溶法）增溶法 （3 3）脂溶法）脂溶法3.3.生物破碎法：酶溶法生物破碎法：酶溶法四四. .固液分離固液分離1.1.離心沉淀法離心沉淀法2.2.膜過濾法膜過濾法3.3.雙水相萃取雙水相萃取五、重組蛋白的分離純化技術(shù)五、重組蛋白的分離純化技術(shù)技術(shù)條件溫和能保持產(chǎn)物生物活性。技術(shù)條件溫和能保持產(chǎn)物生物活性。選擇性好，能從復雜的混合物中有效的將目的產(chǎn)物分離，選擇性好，能從復雜的混合物中有效的將目的產(chǎn)物分離，達到較高的純化倍數(shù)。達到較高的純化倍數(shù)。收率要高。收率要高。兩個技術(shù)間能直接銜接，不需要對物料加以處理。兩個技術(shù)間能直接銜接，不需要對物料加以處理。純化過程要快，滿足高

11、生產(chǎn)率的要求。純化過程要快，滿足高生產(chǎn)率的要求。 目的產(chǎn)物的分離純化目的產(chǎn)物的分離純化 蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學特性來決定。物學特性來決定。 產(chǎn)產(chǎn) 物物 特特 性性 作作 用用 等電點等電點 決定離子交換種類及條件決定離子交換種類及條件相對分子量相對分子量 選擇不同孔徑的介質(zhì)選擇不同孔徑的介質(zhì)疏水性疏水性 與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度生物特異性生物特異性 決定親和配基決定親和配基溶解性溶解性 決定分離體系及蛋白濃度決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性穩(wěn)定性 決定工藝采用溫度及流程時間決定工藝采用溫度及流

12、程時間 產(chǎn)物的特性在分離純化中的作用產(chǎn)物的特性在分離純化中的作用分離純化的方法：色譜分離方法分離純化的方法：色譜分離方法 離子交換層析離子交換層析（ ion exchange chromatography ，IEC）p 離子交換層析的基本原理是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子離子交換層析的基本原理是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進行交換，從而達到分離的目的。交換劑中可交換的離子進行交換，從而達到分離的目的。p 它具有分辨率高容量大操作容易，該法已成為多肽蛋白它具有分辨率高容量大操作容易，該法已成為多肽蛋白質(zhì)核酸分離純化的重要方法。質(zhì)核酸分離純化的重要方法。 反相色譜（反相色譜（rever

13、sed phase chromatography，RPC）和）和 疏水色譜（疏水色譜（hydrophobic interaction chromatography，HIC）p 反相色譜和疏水色譜是根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異來分離反相色譜和疏水色譜是根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異來分離純化的。純化的。p 反相色譜是利用溶質(zhì)分子中非極性基團與非極性固定相反相色譜是利用溶質(zhì)分子中非極性基團與非極性固定相之間相互作用力的大小以及溶質(zhì)分子中極性基團與流動之間相互作用力的大小以及溶質(zhì)分子中極性基團與流動相中極性分子之間在相反方向作用力的大小差異進行分相中極性分子之間在相反方向作用力的大小差異進行分離的。離的。p 常用

14、固定相為硅膠烷基鍵合相。常用固定相為硅膠烷基鍵合相。p 流動相為低離子強度的酸性水溶液，加入能與水互溶的流動相為低離子強度的酸性水溶液，加入能與水互溶的乙腈、甲醇、異丙醇等有機溶劑。乙腈、甲醇、異丙醇等有機溶劑。p 由于固定相骨架疏水性強，吸附的蛋白質(zhì)需用有機溶劑由于固定相骨架疏水性強，吸附的蛋白質(zhì)需用有機溶劑才能洗脫下來。才能洗脫下來。p 疏水層析的原理與反相色譜的原理相似，主要是利用蛋疏水層析的原理與反相色譜的原理相似，主要是利用蛋白質(zhì)分子表面上的疏水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團之間的白質(zhì)分子表面上的疏水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團之間的相互作用，無機鹽的存在能使相互作用力增強。相互作用，無機鹽的存在

15、能使相互作用力增強。p 固定相介質(zhì)表面的疏水性比反相色譜介質(zhì)表面的疏水性固定相介質(zhì)表面的疏水性比反相色譜介質(zhì)表面的疏水性弱。為有機聚合物鍵合相或大孔硅膠鍵合相。弱。為有機聚合物鍵合相或大孔硅膠鍵合相。p 流動相為流動相為pH68鹽水溶液。鹽水溶液。p 高鹽濃度時，蛋白質(zhì)分子中疏水性部分與介質(zhì)的疏水基高鹽濃度時，蛋白質(zhì)分子中疏水性部分與介質(zhì)的疏水基團產(chǎn)生疏水性作用而被吸附；團產(chǎn)生疏水性作用而被吸附；p 鹽濃度降低時，蛋白質(zhì)疏水性作用減弱，目的蛋白質(zhì)被鹽濃度降低時，蛋白質(zhì)疏水性作用減弱，目的蛋白質(zhì)被逐步洗脫下來，蛋白質(zhì)疏水性越強，洗脫時間越長。逐步洗脫下來，蛋白質(zhì)疏水性越強，洗脫時間越長。p 與反

16、相色譜相比，疏水層析回收率較高，蛋白質(zhì)變性可與反相色譜相比，疏水層析回收率較高，蛋白質(zhì)變性可能性小。能性小。親和層析（親和層析（affinity chromatography，AC）p 親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。進行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。p 配基：在親和層析中起可逆性結(jié)合的特異性物質(zhì)。配基：在親和層析中起可逆性結(jié)合的特異性物質(zhì)。p 載體：與配基結(jié)合的支撐物。載體：與配基結(jié)合的支撐物。p 親和層析可分三步：親和層析可分三步：

17、配基固定化配基固定化 吸附目的物吸附目的物 樣品解吸樣品解吸凝膠過濾層析凝膠過濾層析p 凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動，而大分子不能進入孔內(nèi)，快速移能進入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動，而大分子不能進入孔內(nèi)，快速移動，利用這種移動差別可使大分子與小分子分開。動，利用這種移動差別可使大分子與小分子分開。p 根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子量和蛋白質(zhì)分子的動力學體積的大小差異，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子量和蛋白質(zhì)分子的動力學體積的大小差異，可以利用凝膠過濾來分離純化目的蛋白?？梢岳媚z過濾來分離純化目的蛋白。p 主要

18、應(yīng)用兩個方面：主要應(yīng)用兩個方面： 脫鹽和更換緩沖液脫鹽和更換緩沖液 蛋白質(zhì)分子的分級分離。蛋白質(zhì)分子的分級分離。在產(chǎn)品的形成階段前用于除去產(chǎn)物的多聚體及降解產(chǎn)物。在產(chǎn)品的形成階段前用于除去產(chǎn)物的多聚體及降解產(chǎn)物。六、非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的去除六、非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的去除p DNA的去除：的去除：DNA在以上呈陰離子，蛋白質(zhì)的在以上呈陰離子，蛋白質(zhì)的pI在在以上以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強酸性，可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強酸性，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而DNA不吸不吸附。附。p 親和層析和疏水層析也有效。親和層析和疏水層析也有效。

19、 熱原質(zhì)的去除：熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素熱原質(zhì)的去除：熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素（脂多糖（脂多糖G菌細胞壁成分）去除困難。分子量小的多菌細胞壁成分）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。層析法。 病毒的去除：層析或過濾可將病毒去除病毒的去除：層析或過濾可將病毒去除,紫外線照射紫外線照射使病毒失活。使病毒失活。 七、選擇分離純化方法的依據(jù)七、選擇分離純化方法的依據(jù) 根據(jù)產(chǎn)物表達形式來選擇根據(jù)產(chǎn)物表達形

20、式來選擇p 分泌型表達產(chǎn)物的發(fā)酵液體積很大但濃度較低，純化前分泌型表達產(chǎn)物的發(fā)酵液體積很大但濃度較低，純化前必須濃縮，可用沉淀和超濾法。必須濃縮，可用沉淀和超濾法。p 可溶性表達產(chǎn)物破菌后的細胞上清，首選親和分離方法，可溶性表達產(chǎn)物破菌后的細胞上清，首選親和分離方法，或離子交換層析?；螂x子交換層析。p 產(chǎn)物在周質(zhì)表達是介于細胞內(nèi)可溶性表達和分泌表達產(chǎn)物在周質(zhì)表達是介于細胞內(nèi)可溶性表達和分泌表達的一種形式的一種形式,它可以避開可溶性表達蛋白和培養(yǎng)基中蛋它可以避開可溶性表達蛋白和培養(yǎng)基中蛋白類雜質(zhì)白類雜質(zhì),在一定程度上有利于在一定程度上有利于分離純化。分離純化。p 為了獲得周質(zhì)蛋白，經(jīng)低濃度溶菌酶

21、處理后為了獲得周質(zhì)蛋白，經(jīng)低濃度溶菌酶處理后, ,可采用滲可采用滲透壓休克的方法來獲得。透壓休克的方法來獲得。 根據(jù)分離單元之間的銜接選擇根據(jù)分離單元之間的銜接選擇p 應(yīng)選擇不同機制的分離單元組成一套分離工藝，盡早采應(yīng)選擇不同機制的分離單元組成一套分離工藝，盡早采用高效的分離手段。用高效的分離手段。p 先將最多的雜質(zhì)去除，將費用最高、最費時的分離單元先將最多的雜質(zhì)去除，將費用最高、最費時的分離單元放在最后階段。放在最后階段。p 即通常先運用非特異、低分辨的操作單元（如沉淀超濾即通常先運用非特異、低分辨的操作單元（如沉淀超濾和吸附等），以盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)物濃度，去和吸附等），以盡快縮小樣

22、品體積，提高產(chǎn)物濃度，去除最主要雜質(zhì)（包括非蛋白類雜質(zhì)）。除最主要雜質(zhì)（包括非蛋白類雜質(zhì)）。p 隨后采用高分辨率的操作單元（離子交換層析和親和層隨后采用高分辨率的操作單元（離子交換層析和親和層析）凝膠過濾放在最后，這樣可以提高分離效果。析）凝膠過濾放在最后，這樣可以提高分離效果。p 層析分離次序的選擇同樣重要，合理的組合能提高分辨層析分離次序的選擇同樣重要，合理的組合能提高分辨效率，并有利于各步驟間的過渡。如離子交換層析、親效率，并有利于各步驟間的過渡。如離子交換層析、親和層析、凝膠過濾色譜。和層析、凝膠過濾色譜。根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇分離純化工藝應(yīng)遵循以下原

23、則：分離純化工藝應(yīng)遵循以下原則： 具有良好的穩(wěn)定性和重復性具有良好的穩(wěn)定性和重復性 盡可能減少組成工藝的步驟盡可能減少組成工藝的步驟 各技術(shù)步驟間要相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)各技術(shù)步驟間要相互適應(yīng)和協(xié)調(diào) 工藝過程中盡可能少用試劑工藝過程中盡可能少用試劑 工藝所用時間要短工藝所用時間要短 工藝和技術(shù)必須收率高、易操作、能耗低工藝和技術(shù)必須收率高、易操作、能耗低 具有較高的安全性具有較高的安全性第十一節(jié)第十一節(jié) 變性蛋白的復性變性蛋白的復性 一、包含體形成的原因：一、包含體形成的原因： 在高水平表達時，新生肽鏈的聚集速率超過蛋白正確折在高水平表達時，新生肽鏈的聚集速率超過蛋白正確折疊的速率就形成包含體；重組蛋

24、白在大腸桿菌中表達時，疊的速率就形成包含體；重組蛋白在大腸桿菌中表達時，缺乏一些折疊酶和分子伴侶形成包含體。缺乏一些折疊酶和分子伴侶形成包含體。二、包含體的分離和溶解二、包含體的分離和溶解 1.包含體的分離：重組菌破碎、洗滌，蔗糖密度梯度離包含體的分離：重組菌破碎、洗滌，蔗糖密度梯度離心法純化心法純化 2.包含體的溶解：用強變性劑（鹽酸胍、脲）或去垢劑包含體的溶解：用強變性劑（鹽酸胍、脲）或去垢劑（SDS）三、包含體蛋白復性方法三、包含體蛋白復性方法 1.稀釋、透析復性法稀釋、透析復性法 2.含二硫鍵的蛋白的復性含二硫鍵的蛋白的復性 3.封閉蛋白的疏水簇促進復性封閉蛋白的疏水簇促進復性 4.凝

25、膠過濾層析復性凝膠過濾層析復性 5.小分子添加劑促進的復性小分子添加劑促進的復性 6.折疊酶或分子伴侶促進的復性折疊酶或分子伴侶促進的復性 7.人工分子伴侶促進的復性人工分子伴侶促進的復性第十二節(jié)第十二節(jié) 基因工程藥物的質(zhì)量控制基因工程藥物的質(zhì)量控制一、醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量保證的一般要一、醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量保證的一般要點點 1.1.產(chǎn)品安全性評價產(chǎn)品安全性評價 2.2.產(chǎn)品本身的結(jié)構(gòu)產(chǎn)品本身的結(jié)構(gòu) 3.3.嚴格控制條件嚴格控制條件二、二、 原材料的質(zhì)量控制原材料的質(zhì)量控制p 確保編碼藥品的確保編碼藥品的DNA序列的正確性序列的正確性p 重組微生物來自單一克隆重組微生物來自單一克隆p 所用質(zhì)粒

26、純而穩(wěn)定所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定p 保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。 根據(jù)質(zhì)量控制要求應(yīng)了解以下特性：根據(jù)質(zhì)量控制要求應(yīng)了解以下特性：目的基因的來源、克隆經(jīng)過，并以限制性內(nèi)切酶酶切目的基因的來源、克隆經(jīng)過，并以限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和核苷酸序列予以確證；圖譜和核苷酸序列予以確證；表達載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及各組成部分（如表達載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及各組成部分（如復制子、啟動子）的來源與功能，構(gòu)建中所用位點的酶復制子、啟動子）的來源與功能，構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標記物；切圖譜，抗生素抗性標記物； 宿主細胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學特性；宿主

27、細胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學特性； 須闡明載體引入宿主細胞的方法及載體在宿主細胞與載體結(jié)合須闡明載體引入宿主細胞的方法及載體在宿主細胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；后的遺傳穩(wěn)定性； 提供插入基因與表達載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細提供插入基因與表達載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細敘述在生產(chǎn)過程中啟動與控制克隆基因在宿主細胞中表達的方法敘述在生產(chǎn)過程中啟動與控制克隆基因在宿主細胞中表達的方法及水平。及水平。三、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制三、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制p 在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；p 在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)

28、定，始終無突在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；變；p 在重復生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達穩(wěn)定；在重復生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達穩(wěn)定；p 始終能排除外源微生物污染。始終能排除外源微生物污染。p 生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含有致癌因生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含有致癌因子，無細菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立子，無細菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細胞庫。生產(chǎn)用工作細胞庫。p 原始種子批須確證克隆基因原始種子批須確證克隆基因DNADNA序列，詳細敘述種子批來源、方式、序列，詳細敘述種子批來源、方式、保存及預計使

29、用期，保存與復蘇時宿主載體表達系統(tǒng)的穩(wěn)定性。保存及預計使用期，保存與復蘇時宿主載體表達系統(tǒng)的穩(wěn)定性。p 培養(yǎng)周期結(jié)束時，應(yīng)監(jiān)測宿主細胞培養(yǎng)周期結(jié)束時，應(yīng)監(jiān)測宿主細胞- -載體系統(tǒng)的特性，載體系統(tǒng)的特性，例如：質(zhì)?？截悢?shù)、宿主細胞中表達載體存留程度，含例如：質(zhì)?？截悢?shù)、宿主細胞中表達載體存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。插入基因載體的酶切圖譜等。 四、純化工藝過程的質(zhì)量控制四、純化工藝過程的質(zhì)量控制p 產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學試驗數(shù)據(jù)，確證提純物分產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學試驗數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致性；子批間保持一致性；p 外源蛋白質(zhì)、外源蛋白質(zhì)、DNA與熱源物質(zhì)控制在規(guī)定限度以

30、下。與熱源物質(zhì)控制在規(guī)定限度以下。p 在精制過程中能清除宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病在精制過程中能清除宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學物質(zhì)，并有毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學物質(zhì)，并有檢測方法。檢測方法。五、目標產(chǎn)品的質(zhì)量控制五、目標產(chǎn)品的質(zhì)量控制p 基因工程藥物的質(zhì)量控制主要包括以下幾項要求基因工程藥物的質(zhì)量控制主要包括以下幾項要求: 產(chǎn)品的鑒定、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。產(chǎn)品的鑒定、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。 需要用生物化學、免疫學、微生物學、細胞生物學和分需要用生物化學、免疫學、微生物學、細胞生物學和分子生物學等多學科的理

31、論與技術(shù)建立鑒定方法。子生物學等多學科的理論與技術(shù)建立鑒定方法。1.1.生物學活性測定生物學活性測定p 需通過動物體內(nèi)試驗和體外細胞培養(yǎng)進行效價測定。需通過動物體內(nèi)試驗和體外細胞培養(yǎng)進行效價測定。p 國際單位國際單位p 蛋白質(zhì)的比活性：效價蛋白質(zhì)的比活性：效價/,不僅是含量指標也是純不僅是含量指標也是純度指標。度指標。2. 產(chǎn)品的理化性質(zhì)鑒定產(chǎn)品的理化性質(zhì)鑒定 常用的鑒定方法常用的鑒定方法:電泳方法電泳方法: SDS-PAGE、等電聚焦、免疫電泳、等電聚焦、免疫電泳免疫學方法免疫學方法: 放射免疫放射免疫(RIA)、酶聯(lián)免疫、酶聯(lián)免疫(ELISA) 受體結(jié)合試驗受體結(jié)合試驗高效液相

32、色譜高效液相色譜(HPLC)、肽圖分析法、末端序列分、肽圖分析法、末端序列分 析、析、圓二色譜、核磁共振圓二色譜、核磁共振 （1）非特異性鑒別 （2）特異性鑒別 （3）重組蛋白質(zhì)濃度測定和相對分子量的測定：重組蛋白質(zhì)濃度測定和相對分子量的測定： 蛋白質(zhì)濃度測定方法有蛋白質(zhì)濃度測定方法有: :福林福林- -酚法、雙縮脲法酚法、雙縮脲法 蛋白相對分子量的測定蛋白相對分子量的測定: :凝膠過濾法、凝膠過濾法、SDS-PAGESDS-PAGE法法 （4）等電點測定（5）肽圖分析）肽圖分析p 肽圖分析是用酶法或化學法降解目的蛋白質(zhì)，對生成的肽圖分析是用酶法或化學法降解目的蛋白質(zhì)，對生成的肽段進行分離分析

33、。肽段進行分離分析。p 它是檢測蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)最有效的方法，該技術(shù)靈敏、它是檢測蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)最有效的方法，該技術(shù)靈敏、高效是對基因工程藥物的分子結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性進行評高效是對基因工程藥物的分子結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性進行評價和驗證的首選方法。價和驗證的首選方法。p 常用常用HPLC、毛細管電泳。、毛細管電泳。（6）氨基酸成分分析：）氨基酸成分分析：50個氨基酸較理想個氨基酸較理想（7）部分氨基酸序列分析：）部分氨基酸序列分析：N端端15個氨基酸可作為重組個氨基酸可作為重組蛋白質(zhì)和多肽的重要鑒定指標。蛋白質(zhì)和多肽的重要鑒定指標。（8） 蛋白質(zhì)二硫鍵分析：對氯汞苯甲酸法蛋白質(zhì)二硫鍵分析：對氯汞苯甲酸法(

34、PMCB)、5，5-二硫基雙二硫基雙-2-硝基苯甲酸法（硝基苯甲酸法（DTNB）等）等3. 3. 蛋白質(zhì)純度分析蛋白質(zhì)純度分析 蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量測定( (純度分析純度分析) ) SDS-PAGE SDS-PAGE、等電聚焦、等電聚焦(IEF)(IEF)、各種、各種HPLCHPLC、毛細管電泳（、毛細管電泳（CECE）4. 4. 蛋白質(zhì)含量測定蛋白質(zhì)含量測定 Folin-Folin-酚試劑法、染色法（酚試劑法、染色法（BradfordBradford法）、雙縮脲法、法）、雙縮脲法、凱氏定氮法、紫外吸收法、凱氏定氮法、紫外吸收法、HPLCHPLC法法5. 雜質(zhì)檢測雜質(zhì)檢測 蛋白類雜質(zhì)：殘留

35、宿主細胞蛋白蛋白類雜質(zhì)：殘留宿主細胞蛋白 采用免疫分析的方法采用免疫分析的方法 非蛋白類雜質(zhì)：病毒、細菌等微生物、熱原、內(nèi)毒素、非蛋白類雜質(zhì)：病毒、細菌等微生物、熱原、內(nèi)毒素、致敏源及致敏源及DNA?；蚬こ坍a(chǎn)物常見雜質(zhì)和污染物及其基因工程產(chǎn)物常見雜質(zhì)和污染物及其檢測方法檢測方法雜質(zhì)和污染物雜質(zhì)和污染物 檢檢 測測 方方 法法內(nèi)毒素內(nèi)毒素 鱟試劑、家兔熱原法鱟試劑、家兔熱原法宿主細胞蛋白宿主細胞蛋白 免疫分析、免疫分析、SDS-PAGESDS-PAGE、CECE其它蛋白雜質(zhì)其它蛋白雜質(zhì) 免疫分析、免疫分析、SDS-PAGESDS-PAGE、HPLCHPLC、CECE殘余殘余DNA DNADNA

36、 DNA雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合蛋白變異蛋白變異 肽譜、肽譜、HPLCHPLC、 IEFIEF、 CECE甲酰蛋氨酸甲酰蛋氨酸 肽譜、肽譜、HPLCHPLC、 IEFIEF、 CECE蛋氨酸氧化蛋氨酸氧化 肽譜、肽譜、HPLCHPLC、 質(zhì)譜、氨基酸分析質(zhì)譜、氨基酸分析產(chǎn)物變性或聚和脫氨基產(chǎn)物變性或聚和脫氨基 SDS-PAGESDS-PAGE、IEFIEF、HPLCHPLC、CECE、質(zhì)譜、凝膠過濾、質(zhì)譜、凝膠過濾雜質(zhì)和污染物雜質(zhì)和污染物 檢檢 測測 方方 法法單克隆抗體單克隆抗體 SDS-PAGESDS-PAGE、免疫分析、免疫分析氨基酸取代氨基酸取代 氨基酸分析、肽

37、譜、質(zhì)氨基酸分析、肽譜、質(zhì) 譜、譜、CECE污染物微生物微生物 微生物學檢查微生物學檢查支原體支原體 微生物學檢查微生物學檢查病毒病毒 微生物學檢查微生物學檢查基因工程產(chǎn)物常見雜質(zhì)和污染物及其檢測方法基因工程產(chǎn)物常見雜質(zhì)和污染物及其檢測方法6.6.穩(wěn)定性考查穩(wěn)定性考查 是藥品貯藏條件和使用期限的主要依據(jù)。是藥品貯藏條件和使用期限的主要依據(jù)。7.7.產(chǎn)品一致性的保證產(chǎn)品一致性的保證六、產(chǎn)品的保存六、產(chǎn)品的保存液態(tài)保存液態(tài)保存低溫保存低溫保存在穩(wěn)定在穩(wěn)定pH條件下保存條件下保存高濃度保存高濃度保存加保護劑保存加保護劑保存固態(tài)保存：冷凍干燥固態(tài)保存：冷凍干燥（預凍、升華、解吸干燥去除吸附水）（預凍、升華、解吸干燥去除吸附水）第十三節(jié)第十三節(jié)基因工程藥物制造實例基因工程藥物制造實例p 干擾素（干擾素（interferoninterferon，IFNIFN）是人體細胞分泌的一種活）是人體細胞