鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

1、鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)針對(duì)病原體本身的生長繁殖、生理生化特性的檢測(cè)：鼠疫菌的染色檢查；鼠疫菌的培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)；鼠疫菌的生化檢查、營養(yǎng)需求、毒素檢測(cè)、毒力測(cè)定等。針對(duì)病原體特異性抗原結(jié)構(gòu)的檢測(cè)：鼠疫F1抗原抗體檢測(cè)；鼠疫菌外膜蛋白的檢測(cè)。針對(duì)病原體遺傳基因的檢測(cè)：鼠疫菌的質(zhì)粒檢測(cè)；鼠疫菌特異性核酸片斷的檢測(cè)；鼠疫菌全基因組測(cè)定；插入序列的檢測(cè)。一、鼠疫菌菌體形態(tài)檢查典型的鼠疫菌呈短而粗，菌體長典型的鼠疫菌呈短而粗，菌體長12m，寬，寬0.50.7m,中段膨大，兩端鈍圓，且兩極濃染中段膨大，兩端鈍圓，且兩極濃染的卵圓形小桿菌，有莢膜，無鞭毛，無芽胞。

2、的卵圓形小桿菌，有莢膜，無鞭毛，無芽胞。革蘭氏染色陰性。革蘭氏染色陰性。染疫動(dòng)物或患者及其尸體的新鮮臟器制備的壓染疫動(dòng)物或患者及其尸體的新鮮臟器制備的壓印片，可見到兩端鈍圓、兩極濃染的典型鼠疫印片，可見到兩端鈍圓、兩極濃染的典型鼠疫菌。壓印標(biāo)本中可在吞噬細(xì)胞內(nèi)外見到鼠疫菌，菌。壓印標(biāo)本中可在吞噬細(xì)胞內(nèi)外見到鼠疫菌，對(duì)于鑒別雜菌污染材料極有價(jià)值。對(duì)于鑒別雜菌污染材料極有價(jià)值。鼠疫菌染色方法有革蘭氏染色（菌體染成紅鼠疫菌染色方法有革蘭氏染色（菌體染成紅色）、美蘭染色（菌體染成蘭色，兩極濃染明色）、美蘭染色（菌體染成蘭色，兩極濃染明顯）、姬姆薩染色（菌體染成色，莢膜染成色）顯）、姬姆薩染色（菌體染成

3、色，莢膜染成色）鼠疫菌染色檢查(臟器壓印片)美蘭染色革蘭氏染色鼠疫菌染色鼠疫菌涂片的革蘭氏染色鼠疫菌染色檢查Wayson stain(魏申氏染色)呈現(xiàn)的兩極濃染特征莢膜染色墨汁負(fù)染色二、鼠疫菌的培養(yǎng)特性u(píng)鼠疫菌是典型的異養(yǎng)菌。鼠疫菌是典型的異養(yǎng)菌。u鼠疫菌為需氧菌，亦為兼性厭氧菌。鼠疫菌為需氧菌，亦為兼性厭氧菌。u鼠疫菌在普通培基上生長良好，培養(yǎng)的最適溫度為鼠疫菌在普通培基上生長良好，培養(yǎng)的最適溫度為28，最適，最適pH為為6.9-7.1，發(fā)育初期的最適氧化還原電位（，發(fā)育初期的最適氧化還原電位（Eh）約為）約為100150mV，接種后至少，接種后至少20h以上才能形成肉眼可見的菌落，以上才能

4、形成肉眼可見的菌落，一般一般2448h形成肉眼可見的小菌落。形成肉眼可見的小菌落。u強(qiáng)毒鼠疫菌對(duì)鈣離子有半依賴性，缺乏時(shí)生長不良。強(qiáng)毒鼠疫菌對(duì)鈣離子有半依賴性，缺乏時(shí)生長不良。37缺鈣缺鈣條件下強(qiáng)毒鼠疫菌生長受限并釋放大量條件下強(qiáng)毒鼠疫菌生長受限并釋放大量Yops,表現(xiàn)很強(qiáng)的表達(dá)和表現(xiàn)很強(qiáng)的表達(dá)和分泌毒力蛋白分泌毒力蛋白V抗原（抗原（LcrV）。此現(xiàn)象稱為低鈣反應(yīng)，受）。此現(xiàn)象稱為低鈣反應(yīng)，受70kb(45MD)質(zhì)粒上的遺傳基因控制。質(zhì)粒上的遺傳基因控制。u典型鼠疫菌培養(yǎng)典型鼠疫菌培養(yǎng)18-20h光鏡下呈透明的碎玻璃片狀。培養(yǎng)光鏡下呈透明的碎玻璃片狀。培養(yǎng)24h以上菌落在透過光線下呈灰白色略帶

5、淡青色，反射光線下菌落以上菌落在透過光線下呈灰白色略帶淡青色，反射光線下菌落圓形隆起呈淡灰白色，鏡下見菌落中心發(fā)暗，有黃褐色粗糙顆圓形隆起呈淡灰白色，鏡下見菌落中心發(fā)暗，有黃褐色粗糙顆粒，周邊圍繞一圈寬窄不等，邊緣不整呈鋸齒狀、薄而透明的粒，周邊圍繞一圈寬窄不等，邊緣不整呈鋸齒狀、薄而透明的花邊?；ㄟ?。鼠疫噬菌體試驗(yàn)在培基上密集平行劃線培養(yǎng)鼠疫菌，鼠疫噬菌體滴于上端劃線中部，直立平板，使噬菌體液垂直劃線自然流下，置20培養(yǎng)24h,有明顯的噬菌帶。在1822鼠疫噬菌體只能裂解鼠疫菌而不裂解假結(jié)核菌，具有較強(qiáng)的專一性(噬菌作用具有種的特異性)，是鼠疫細(xì)菌學(xué)診斷中特異的鑒定方法之一。鼠疫噬菌體試驗(yàn)可

6、快速診斷鼠疫菌。對(duì)被檢材料作細(xì)菌分離培養(yǎng)的同時(shí)作噬菌體裂解試驗(yàn)，20h左右即可獲得結(jié)果。分離到鼠疫噬菌體，可以間接判定檢材中存在鼠疫菌。鼠疫菌培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)典型鼠疫菌菌落形態(tài)噬菌帶鼠疫菌培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)鼠疫菌培養(yǎng)特征鼠疫噬菌體試驗(yàn)三、鼠疫F1抗原、抗體檢測(cè)鼠疫F1抗原檢測(cè)1.反向血球凝集試驗(yàn)(RIHA)2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)3.膠體金免疫層析法(GICA)4.免疫熒光技術(shù)(IFT)鼠疫F1抗體檢測(cè)1.間接血球凝集試驗(yàn)(IHA)2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)3.膠體金免疫層析法(GICA)間接紅血球凝集試驗(yàn)(IHA)鼠疫菌特異性F1抗原致敏經(jīng)單寧酸鞣化處理的醛化綿羊紅血

7、球，制備成F1抗原致敏血球，檢查鼠疫特異性F1抗體。試驗(yàn)方法和結(jié)果判定均為常規(guī)操作。IHA微量法結(jié)果：反向血球凝集試驗(yàn)(RIHA)用F1抗體致敏血球，檢查鼠疫特異性F1抗原。試驗(yàn)方法和結(jié)果判定與IHA相同。RIHA微量法結(jié)果：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)抗體測(cè)抗體.雙抗原夾心法：雙抗原夾心法：F1抗原包被反應(yīng)板，抗原包被反應(yīng)板，加入待測(cè)標(biāo)本加入待測(cè)標(biāo)本28反應(yīng)反應(yīng)1.5h洗板，洗板，加入加入HRP-F1抗原抗原28反應(yīng)反應(yīng)1h洗板，洗板，加入底物加入底物OPD蔽光反應(yīng)蔽光反應(yīng)30min后加后加終止液終止液(2mol/L硫酸硫酸)。間接法：間接法： 已知已知F1抗原包被反應(yīng)板，抗原包被反應(yīng)板

8、，加標(biāo)本加標(biāo)本37反應(yīng)反應(yīng)1h洗板，加入酶標(biāo)洗板，加入酶標(biāo)二抗二抗37反應(yīng)反應(yīng)1h洗板，加入底物洗板，加入底物(如如OPD或或TMB)蔽光反應(yīng)蔽光反應(yīng)30min顯顯色后加終止液。色后加終止液。用肉眼觀察結(jié)果并用酶標(biāo)儀檢測(cè)每用肉眼觀察結(jié)果并用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度值孔的吸光度值(A)測(cè)抗原雙單抗夾心法：雙單抗夾心法： F1-McAb包被反應(yīng)包被反應(yīng)板，加入標(biāo)本板，加入標(biāo)本28反應(yīng)反應(yīng)1.5h洗板，加洗板，加入入HRP-F1McAb 28反應(yīng)反應(yīng)1h洗板，洗板，加入底物加入底物OPD蔽光反應(yīng)蔽光反應(yīng)30min后加終后加終止液。止液。雙抗體夾心法雙抗體夾心法(改良法改良法-美國美國CDC鼠疫鼠疫診斷

9、技術(shù)實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)診斷技術(shù)實(shí)驗(yàn)室操作手冊(cè))：鼠疫免疫：鼠疫免疫血清特異性抗體血清特異性抗體( F1Ab)包被反應(yīng)板，包被反應(yīng)板，加標(biāo)本加標(biāo)本37反應(yīng)反應(yīng)1h洗板，加小鼠洗板，加小鼠F1McAb 液液37靜置靜置1h洗板，加洗板，加HRP標(biāo)記的羊抗小鼠標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 37反應(yīng)反應(yīng)1h洗板洗板,加底物加底物OPD蔽光反應(yīng)蔽光反應(yīng)30min顯色，顯色，加終止液。加終止液。肉眼觀察結(jié)果并用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的肉眼觀察結(jié)果并用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度值吸光度值(A) 膠體金免疫層析法(GICA)檢測(cè)鼠疫菌特異性抗原、抗體的金標(biāo)技術(shù)以GICA廣泛用于實(shí)踐?；驹砭鶠閵A心法。雙抗體夾心法測(cè)抗原：固定于NC

10、膜上的單抗(F1McAb)+標(biāo)本中待測(cè)抗原(F1Ag)+金標(biāo)記的另一株單抗(金標(biāo)-F1McAb)顯色。雙抗原夾心法測(cè)抗體：雙抗原夾心法測(cè)抗體：固定于NC膜上的鼠疫F1抗原(F1Ag)+標(biāo)本中待測(cè)抗體(F1Ab)+金標(biāo)記的F1抗原(金標(biāo)-F1Ag)顯色。夾心法測(cè)抗體：固定于膜上的鼠疫固定于膜上的鼠疫F1抗原標(biāo)抗原標(biāo)本中的相應(yīng)抗體金標(biāo)記的本中的相應(yīng)抗體金標(biāo)記的SPA顯色。顯色。GICA雙抗體夾心法測(cè)抗原G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(鼠型F1McAb)C區(qū)：羊抗小鼠IgT區(qū)：特異性單克隆抗體(F1McAb) 吸水紙標(biāo)本標(biāo)本免疫熒光技術(shù)(IFT)標(biāo)記物-熒光素(如異硫氰熒光素FITC)熒光素標(biāo)記抗體檢測(cè)相應(yīng)抗

11、原-直接法：如FITC-FIMcAb為異硫氰為異硫氰酸熒光黃標(biāo)記鼠疫酸熒光黃標(biāo)記鼠疫F1單克隆抗體。單克隆抗體。方法：固定好的玻片標(biāo)本用方法：固定好的玻片標(biāo)本用1%牛牛血清血清PBS浸洗浸洗5分鐘，流水沖洗。分鐘，流水沖洗。用用FITC-FIMcAb適量（適量（0.2ml）熒）熒光染色，室溫作用光染色，室溫作用30分鐘，流水分鐘，流水沖洗。干燥，熒光顯微鏡油鏡觀沖洗。干燥，熒光顯微鏡油鏡觀察，鼠疫菌染上翠綠色熒光察，鼠疫菌染上翠綠色熒光Yersinia pestis 免疫熒光染色Fluorescence antibody positivity is seen as bright, intens

12、e green staining around the bacterial cell 鼠疫菌特異性基因片斷檢測(cè)PCR目標(biāo)基因目標(biāo)基因：鼠疫菌的鼠疫菌的fra和和pla特異性基因片段特異性基因片段引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物的長度引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物的長度目標(biāo)基因目標(biāo)基因 引物序列引物序列 產(chǎn)物長度產(chǎn)物長度 fra 1F 5-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3 249 bp 1R 5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3 pla 2F 5-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3 456 bp 2R 5-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3內(nèi)部對(duì)照：以鼠疫菌

13、內(nèi)部對(duì)照：以鼠疫菌EV株株DNA為模板，采用上述為模板，采用上述f1引物擴(kuò)引物擴(kuò)增出增出fra基因基因249 bp片段，再以片段，再以16SrRNA基因引物：基因引物： F 5-AGCGGCAGCGGGAAGTAGTT-3 R 5-TCAACCCCTTCCTCCTCGCT-3 擴(kuò)增出擴(kuò)增出16SrRNA基因基因396bp片段加載體重組而成，產(chǎn)物片段加載體重組而成，產(chǎn)物長度長度645 bp ，使用了內(nèi)部對(duì)照，可有效的防止假陰性結(jié)果。，使用了內(nèi)部對(duì)照，可有效的防止假陰性結(jié)果。應(yīng)用多重應(yīng)用多重PCR方法來檢測(cè)鼠疫菌，所選取的擴(kuò)增區(qū)域都為鼠方法來檢測(cè)鼠疫菌，所選取的擴(kuò)增區(qū)域都為鼠疫菌的特異區(qū)域，可有效

14、地將鼠疫菌與其它細(xì)菌相鑒別，具疫菌的特異區(qū)域，可有效地將鼠疫菌與其它細(xì)菌相鑒別，具有較高特異性。有較高特異性。鼠疫PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系(總量總量25l)采用其它總量時(shí)，采用其它總量時(shí)，下列配方按比例改變。下列配方按比例改變。 無菌去離子水無菌去離子水 13.5l10反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 2.5l4dNTP混合物（每種混合物（每種2.5mM） 2l引物（引物（1F、1R、2F、2R） 各各1l 內(nèi)部對(duì)照模板內(nèi)部對(duì)照模板(IC) 1l待測(cè)標(biāo)本待測(cè)標(biāo)本 1lTaq DNA 聚合酶聚合酶 1l鼠疫PCR反應(yīng)條件反應(yīng)條件(擴(kuò)增擴(kuò)增) ：預(yù)變性預(yù)變性95 5min，1個(gè)循個(gè)循環(huán)；然后環(huán)；然

15、后95 1 min，55 1 min，72 1 min，30個(gè)循環(huán)；最后個(gè)循環(huán)；最后72 5 min。共。共1小時(shí)小時(shí)40分。分。電泳：反應(yīng)管中加溴酚藍(lán)指示劑電泳：反應(yīng)管中加溴酚藍(lán)指示劑5l，混均短，混均短暫離心。膠體的每一孔中加入上述處理的反暫離心。膠體的每一孔中加入上述處理的反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)產(chǎn)物8l，在，在80-100V(不超過不超過5V/cm)電壓電壓下下TBE緩沖液中電泳約緩沖液中電泳約1小時(shí)。凝膠成像儀讀小時(shí)。凝膠成像儀讀取結(jié)果并照相。取結(jié)果并照相。多重PCR擴(kuò)增結(jié)果鼠疫PCR 內(nèi)部對(duì)照質(zhì)粒與不同濃度EV菌 PCR擴(kuò)增結(jié)果 鼠疫多重PCR 多重PCR擴(kuò)增結(jié)果鼠疫菌質(zhì)粒檢測(cè)鼠疫菌的三個(gè)尋常質(zhì)

16、粒： pPCP1 6Mda(9.5kb)編碼鼠疫菌素，鼠疫菌素耐受，凝固酶和胞漿素原活化因子； pCD145 Mda(70kb)編碼型分泌系統(tǒng)的質(zhì)粒，即主要編碼低鈣反應(yīng)并表達(dá)LrcV及一系列耶爾森菌特有的Yops； pMT1 65Mda(100kb)編碼F1抗原和鼠毒素。91001全基因組測(cè)序新發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒：pCRY長度21742bp，具有獨(dú)立復(fù)制能力，有一群編碼型分泌系統(tǒng)的基因。質(zhì)粒DNA提取-堿裂解法和熱裂解法質(zhì)粒電泳分析鼠疫菌研究進(jìn)展u傳統(tǒng)的病原體分類傳統(tǒng)的病原體分類(classification)和鑒定和鑒定(identification)方法方法:1.病原體的形態(tài)特征病原體的形態(tài)特征2.生長特征生長特征(培養(yǎng)特性培養(yǎng)特性)3.血清學(xué)反應(yīng)血清學(xué)反應(yīng)4.生化特征生化特征u基因分類基因分類(Genotyping)和鑒定方法和鑒定方法:多是基于多是基于PCR和核酸凝膠電泳技術(shù)，通過電泳條帶模式比和核酸凝膠電泳技術(shù)，通過電泳條帶模式比較分析，揭示基因組成間差異。較分析，揭示基因組成間差異。AFLP擴(kuò)增片段長度多態(tài)性擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 R