細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課

1、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課目目 錄錄1. 掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作。除菌法的操作。2. 了解化學(xué)消毒法的使用方法。了解化學(xué)消毒法的使用方法。3. 了解傳代細(xì)胞的傳代方法及操作過程，了解傳代細(xì)胞的傳代方法及操作過程，學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況及細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)測(cè)定的方法。狀況及細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)測(cè)定的方法。顯微鏡下的培養(yǎng)細(xì)胞顯微鏡下的培養(yǎng)細(xì)胞1、玻璃器材的清洗處理方法、玻璃器材的清洗處理方法2、塑料器材的清洗處理方法、塑料器材的清洗處理方法3、橡皮器材的清洗處理方法、橡皮器材的清洗處理方法4、金屬器材的清洗處理方法、金

2、屬器材的清洗處理方法5、細(xì)胞的消化傳代方法、細(xì)胞的消化傳代方法方法方法1、玻璃器材的清洗處理方法、玻璃器材的清洗處理方法清潔液浸泡或用清潔液浸泡或用2%磷酸三鈉或潔消精浸泡過夜磷酸三鈉或潔消精浸泡過夜自來水沖自來水沖10次次培養(yǎng)瓶再用三蒸水浸泡過夜培養(yǎng)瓶再用三蒸水浸泡過夜晾干晾干包裝包裝滅菌滅菌單蒸水洗單蒸水洗2次次晾干備用晾干備用備用備用刷洗刷洗浸泡浸泡2、塑料器材的清洗處理方法、塑料器材的清洗處理方法用用3%HCl或或2%NaOH溶液浸泡過夜溶液浸泡過夜（單用或交叉處理）（單用或交叉處理）水洗水洗10次次單蒸水單蒸水2次次紫外線或輻射滅菌備用紫外線或輻射滅菌備用三蒸水浸泡過夜三蒸水浸泡過夜

3、晾干晾干刷洗刷洗浸泡浸泡3、橡皮器材的清洗處理方法、橡皮器材的清洗處理方法5%NaOH煮煮10 20水洗水洗4%鹽酸煮鹽酸煮10 20單蒸水洗三次、二蒸水洗一次晾干備用單蒸水洗三次、二蒸水洗一次晾干備用水洗水洗810次次刷洗刷洗浸泡浸泡金屬器材的清洗處理方法金屬器材的清洗處理方法紙擦去表面的油脂紙擦去表面的油脂洗衣粉煮沸或用洗衣粉煮沸或用1%碳酸氫鈉煮沸碳酸氫鈉煮沸15分鐘分鐘水洗水洗95%酒精紗布擦干酒精紗布擦干包裝滅菌包裝滅菌4、金屬器材的清洗處理方法、金屬器材的清洗處理方法吸除或倒掉舊培養(yǎng)液吸除或倒掉舊培養(yǎng)液加入加入2mL，無鈣、鎂，無鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉，漂洗一次后倒掉加入加入

4、1mL消化液（消化液（0.25%胰蛋白酶或胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液）或混合液）肉眼可觀察到肉眼可觀察到“薄膜薄膜”現(xiàn)象時(shí)，倒掉消化液現(xiàn)象時(shí)，倒掉消化液繼續(xù)作用繼續(xù)作用23分鐘分鐘顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大，此時(shí)應(yīng)立即終止顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大，此時(shí)應(yīng)立即終止消化消化5、細(xì)胞的消化傳代方法、細(xì)胞的消化傳代方法加入完全培養(yǎng)基加入完全培養(yǎng)基5mL，用吸管反復(fù)吹打，用吸管反復(fù)吹打計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分瓶培養(yǎng)分瓶培養(yǎng)細(xì)胞的消化傳代方法細(xì)胞的消化傳代方法生長(zhǎng)細(xì)胞形態(tài)生長(zhǎng)細(xì)胞形態(tài)1簡(jiǎn)述細(xì)胞傳代培養(yǎng)的操作程序及注意事項(xiàng)。簡(jiǎn)述細(xì)胞傳代培養(yǎng)的操作程序及注意事項(xiàng)。2細(xì)胞培

5、養(yǎng)獲得成功的關(guān)鍵要素是什么細(xì)胞培養(yǎng)獲得成功的關(guān)鍵要素是什么?3簡(jiǎn)述體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征及其生長(zhǎng)階段。簡(jiǎn)述體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征及其生長(zhǎng)階段。4繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。5繪制細(xì)胞分裂指數(shù)圖。繪制細(xì)胞分裂指數(shù)圖。 通過細(xì)胞融合技術(shù)，初步了解染色體通過細(xì)胞融合技術(shù)，初步了解染色體提前凝集標(biāo)本制備原理、方法及間期細(xì)胞提前凝集標(biāo)本制備原理、方法及間期細(xì)胞三種時(shí)相的提前凝集染色體特點(diǎn)。三種時(shí)相的提前凝集染色體特點(diǎn)。 1、細(xì)胞融合方法、細(xì)胞融合方法 2、PCC誘導(dǎo)和觀察誘導(dǎo)和觀察 收集收集1瓶瓶M期細(xì)胞、消化一瓶貼壁細(xì)胞混合離心期細(xì)胞、消化一瓶貼壁細(xì)胞混合離心用用Hanks液洗液洗1次次離

6、心棄上清（吸干）輕彈使細(xì)胞分散離心棄上清（吸干）輕彈使細(xì)胞分散90s后后1、細(xì)胞融合方法、細(xì)胞融合方法 377滴加滴加5050PEG0.5mlPEG0.5ml（1212滴）滴）加入加入2ml 1640（含（含10血清）血清）加一滴秋水仙素（加一滴秋水仙素（10gml ）分別在分別在5min、15min、20min觀察細(xì)胞融合觀察細(xì)胞融合加入加入5ml1640洗一次（不要吹打）離心洗一次（不要吹打）離心細(xì)胞融合細(xì)胞融合90分鐘后離心棄上清分鐘后離心棄上清加入加入0.075mol/lKCl8ml混勻混勻372525分鐘分鐘加入加入1ml固定液混勻離心棄上清固定液混勻離心棄上清2、PCC誘導(dǎo)和觀察誘

7、導(dǎo)和觀察 加加7ml固定液固定固定液固定20min離心棄上清加離心棄上清加0.5ml固定液固定液滴片（冰、高、烤）滴片（冰、高、烤）Giemsa染色染色12min水沖、晾干、鏡檢水沖、晾干、鏡檢1. 根據(jù)根據(jù)PCC圖像的觀察，試說明對(duì)于理圖像的觀察，試說明對(duì)于理解細(xì)胞周期和解細(xì)胞周期和DNA復(fù)制有什么啟示復(fù)制有什么啟示?2. 簡(jiǎn)述細(xì)胞融合的原理。簡(jiǎn)述細(xì)胞融合的原理。3. PCC實(shí)驗(yàn)的主要意義是什么？實(shí)驗(yàn)的主要意義是什么？1.1.掌握常用飼養(yǎng)層的制備原理和方法。掌握常用飼養(yǎng)層的制備原理和方法。2.2.鞏固細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的的技術(shù)。鞏固細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的的技術(shù)。 將原代培養(yǎng)的將原代培養(yǎng)的MEF細(xì)胞進(jìn)行傳代

8、，多為細(xì)胞進(jìn)行傳代，多為36代，這樣不僅可以使得代，這樣不僅可以使得MEF細(xì)胞的純度較高，細(xì)胞的純度較高，而且生長(zhǎng)狀態(tài)也很好。在制備飼養(yǎng)層前將而且生長(zhǎng)狀態(tài)也很好。在制備飼養(yǎng)層前將MEF細(xì)胞用絲裂霉素細(xì)胞用絲裂霉素C或射線照射預(yù)處理，或射線照射預(yù)處理，抑制抑制DNA的復(fù)制使其在保持分泌功能的基礎(chǔ)的復(fù)制使其在保持分泌功能的基礎(chǔ)上失去增值能力，以免與上失去增值能力，以免與ES的生長(zhǎng)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)。的生長(zhǎng)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)。 在具體實(shí)驗(yàn)中，在具體實(shí)驗(yàn)中，MEF細(xì)胞的原代分離時(shí)胎齡的選擇，作為飼細(xì)胞的原代分離時(shí)胎齡的選擇，作為飼養(yǎng)層使用時(shí)細(xì)胞代數(shù)的選擇，絲裂霉素處理的濃度都會(huì)影響?zhàn)B層使用時(shí)細(xì)胞代數(shù)的選擇，絲裂霉素處理的

9、濃度都會(huì)影響飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的質(zhì)量。飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的質(zhì)量。 胎齡過大，則成纖維細(xì)胞的成分降低，分離效率低下，且胎齡過大，則成纖維細(xì)胞的成分降低，分離效率低下，且易混雜其他細(xì)胞，難以去處。若胎齡過小，胚胎形態(tài)小，易混雜其他細(xì)胞，難以去處。若胎齡過小，胚胎形態(tài)小，軀干部分不易分辯，操作困難。軀干部分不易分辯，操作困難。 細(xì)胞代數(shù)過多，則出現(xiàn)衰老征象；細(xì)胞代數(shù)過少，不容易純化。細(xì)胞代數(shù)過多，則出現(xiàn)衰老征象；細(xì)胞代數(shù)過少，不容易純化。 絲裂霉素的濃度處理和處理時(shí)間直接影響細(xì)胞的狀態(tài)。絲裂霉素的濃度處理和處理時(shí)間直接影響細(xì)胞的狀態(tài)。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞顯小鼠胚胎成纖維細(xì)胞顯微圖微圖體外培養(yǎng)的小鼠胚胎成纖維體

10、外培養(yǎng)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞細(xì)胞 無菌操作無菌操作 吹打細(xì)胞時(shí)要小心，用力均勻吹打細(xì)胞時(shí)要小心，用力均勻 用酶消化時(shí)注意時(shí)間，不可過渡用酶消化時(shí)注意時(shí)間，不可過渡1.1.細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制MEFMEF細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，連續(xù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，連續(xù)7 7天，至少天，至少5 5天。分三個(gè)處理天。分三個(gè)處理20mg/L20mg/L和和10 mg/L10 mg/L以及空白組以及空白組2.2.做好原代培養(yǎng)工作，并在做好原代培養(yǎng)工作，并在4848小時(shí)換液時(shí)和小時(shí)換液時(shí)和4-54-5天傳天傳代時(shí)，仔細(xì)觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)并記錄結(jié)果，代時(shí)，仔細(xì)觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)并記錄結(jié)果，分析產(chǎn)生結(jié)果的原因。分析產(chǎn)生結(jié)果

11、的原因。3.3.設(shè)計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)室的理想布局，并且將儀器配備入內(nèi)。設(shè)計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)室的理想布局，并且將儀器配備入內(nèi)。4.4.掌握細(xì)胞培養(yǎng)過程中的常用方法。掌握細(xì)胞培養(yǎng)過程中的常用方法。5. 如何盡可能的做到無菌操作如何盡可能的做到無菌操作 通過掌握通過掌握MS培養(yǎng)基母液配制及常用培養(yǎng)基母液配制及常用培養(yǎng)基的制備和滅菌方法，為植物組織培養(yǎng)基的制備和滅菌方法，為植物組織培養(yǎng)準(zhǔn)備合適的營(yíng)養(yǎng)條件；掌握植物外培養(yǎng)準(zhǔn)備合適的營(yíng)養(yǎng)條件；掌握植物外植體的消毒技術(shù)、離體培養(yǎng)的無菌操作植體的消毒技術(shù)、離體培養(yǎng)的無菌操作和愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)。和愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)。 植物材料培養(yǎng)要獲得成功，并正常植物材料培養(yǎng)要獲得成功，并正常生

12、長(zhǎng)，培養(yǎng)基的成分是一個(gè)決定性因素，生長(zhǎng)，培養(yǎng)基的成分是一個(gè)決定性因素，不同植物要求不同的培養(yǎng)基。不同植物要求不同的培養(yǎng)基。 大多數(shù)植物組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基由無大多數(shù)植物組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基由無機(jī)營(yíng)養(yǎng)物、碳源、維生素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物、碳源、維生素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和有機(jī)附加物等五類物質(zhì)組成。和有機(jī)附加物等五類物質(zhì)組成。 由于細(xì)胞的全能性，在合適的生長(zhǎng)由于細(xì)胞的全能性，在合適的生長(zhǎng)條件下，一定濃度的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)條件下，一定濃度的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素配比可以誘導(dǎo)植物的外植體脫分化產(chǎn)素配比可以誘導(dǎo)植物的外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織，為進(jìn)一步再分化創(chuàng)造條件。生愈傷組織，為進(jìn)一步再分化創(chuàng)造條件。 高壓滅菌

13、鍋、普通及精密天平、高壓滅菌鍋、普通及精密天平、玻璃器皿（燒杯、玻璃器皿（燒杯、10001000、500mL500mL容量容量瓶、移液管、試劑瓶、瓶、移液管、試劑瓶、10001000、500500、100 mL 100 mL 三角瓶）、化學(xué)試劑。三角瓶）、化學(xué)試劑。 1、配制幾種母液、配制幾種母液（1）配制）配制100倍倍1L MS大量元素母液大量元素母液NHNH4 4NONO3 3 165g KHKH3POPO4 4 17gKNOKNO3 3 190g CaCl CaCl2 22H2H2 2OO 44gMgSOMgSO4 47H7H2 2OO 37g （2）配制）配制MS微量元素母液微量元素

14、母液 配制成配制成100倍倍1L母液，母液。依次稱取母液，母液。依次稱取KI KI 0.083g Na Na2MoOMoO42H2H2O O 0.025gH H3BOBO3 0.62g CuSO CuSO45H5H2O O 0.0025gMnSOMnSO4HH2O O 1.69g CoCl CoCl26H6H2O O 0.0025gZnSOZnSO47H7H2OO0.86g （3）配制）配制MS有機(jī)母液有機(jī)母液一般配制成一般配制成100倍倍1L MS有機(jī)母液。依次稱取有機(jī)母液。依次稱取肌醇肌醇 10.0g 鹽酸硫胺素鹽酸硫胺素 0.01g煙酸煙酸 0.05g 甘氨酸甘氨酸 0.20g鹽酸吡哆醇

15、鹽酸吡哆醇 0.05g （4）配制）配制MS鐵鹽母液鐵鹽母液一般配制成一般配制成100倍倍lL MS鐵鹽母液。依次稱取鐵鹽母液。依次稱取EDTAEDTA二鈉二鈉 3.73g FeSO FeSO4 47H7H2O O 2.78g 2植物激素的配制植物激素的配制 0.1mg/mL 的的6-BA溶液：取溶液：取25mg的的6-BA，用，用少量少量1N的鹽酸溶解，再加蒸餾水定容至的鹽酸溶解，再加蒸餾水定容至250mL。0.1mg/mL NAA：?。喝?5mg的的NAA可溶于熱水中或可溶于熱水中或用少量用少量95%乙醇或少量乙醇或少量1N的的NOH溶解后，再加溶解后，再加水定容至水定容至250mL。 3

16、培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制 分別吸取母液各分別吸取母液各10mL及及6-BA 和和NAA 母母液各液各20mL，混合后，再加蔗糖至終濃度，混合后，再加蔗糖至終濃度3%，用用NaOH調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH至至6.0；加入瓊脂；加入瓊脂6g。最后加。最后加蒸餾水定容至于蒸餾水定容至于1L。然后用組織培養(yǎng)用封口膜。然后用組織培養(yǎng)用封口膜封上，扎緊后滅菌封上，扎緊后滅菌 。 4培養(yǎng)基滅菌和分裝培養(yǎng)基滅菌和分裝 將分裝好的培養(yǎng)基放在高壓滅菌鍋中，加熱，待將分裝好的培養(yǎng)基放在高壓滅菌鍋中，加熱，待壓力上升到壓力上升到0.5kg/cm2時(shí)，排凈冷空氣，關(guān)閉放氣時(shí)，排凈冷空氣，關(guān)閉放氣閥繼續(xù)加熱使壓力穩(wěn)定在閥繼續(xù)加熱使壓

17、力穩(wěn)定在1.2kg/cm2，溫度為，溫度為121的條件下，維持的條件下，維持1520分鐘。滅菌后的培養(yǎng)基分鐘。滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至冷卻至65左右，分裝，每左右，分裝，每100mL三角瓶裝三角瓶裝40mL，共裝共裝25瓶。瓶。 5消毒液的配制消毒液的配制次氯酸納消毒液：取次氯酸納消毒液：取30mL次氯酸納溶液，用蒸次氯酸納溶液，用蒸餾水定容至餾水定容至100mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用。現(xiàn)配現(xiàn)用。75%的酒精：的酒精：75mL的的95%的酒精加水定容至的酒精加水定容至95mL。 6外植體的制備和接種外植體的制備和接種 將發(fā)芽的零余子用次氯酸納消毒液或者將發(fā)芽的零余子用次氯酸納消毒液或者75%的酒精消毒后移入超

18、凈工作臺(tái)的無菌培養(yǎng)皿中，的酒精消毒后移入超凈工作臺(tái)的無菌培養(yǎng)皿中，用解剖刀切取苗芽，然后將其接種在培養(yǎng)基上，用解剖刀切取苗芽，然后將其接種在培養(yǎng)基上，一般每瓶接種一般每瓶接種4-5片苗芽。快速封好瓶口，并寫片苗芽?？焖俜夂闷靠冢懮辖臃N日期。上接種日期。 7愈傷組織的誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo) 接種后的三角瓶置于接種后的三角瓶置于24條件下，黑條件下，黑暗培養(yǎng)一周，然后在同樣溫度下分為光照暗培養(yǎng)一周，然后在同樣溫度下分為光照和黑暗培養(yǎng)直至愈傷組織形成。和黑暗培養(yǎng)直至愈傷組織形成。 配制鐵鹽母液時(shí)，配制鐵鹽母液時(shí)，F(xiàn)eS04和和Na2EDTA應(yīng)分別加熱溶解后混合，應(yīng)分別加熱溶解后混合， 并置于加熱攪拌

19、并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色器上不斷攪拌至溶液呈金黃色(約加熱約加熱20 - 30 min)，調(diào)，調(diào)pH值至值至5.5，防止，防止FeS04結(jié)晶結(jié)晶析出。析出。 因?yàn)楦邷販缇鷷?huì)降低因?yàn)楦邷販缇鷷?huì)降低pH值（約值（約0.2-0.3個(gè)個(gè)pH值），配制時(shí)常提高值），配制時(shí)常提高pH值值0.2-0.3。 接種時(shí)嚴(yán)格注意無菌操作。接種時(shí)嚴(yán)格注意無菌操作。1 1植物培養(yǎng)基為什么要分成母液分開配制。植物培養(yǎng)基為什么要分成母液分開配制。2. 2. 分析實(shí)驗(yàn)中植物愈傷組織生長(zhǎng)所需要的必分析實(shí)驗(yàn)中植物愈傷組織生長(zhǎng)所需要的必要條件。要條件。1.1.學(xué)習(xí)植物細(xì)胞原生質(zhì)體分離和純化的學(xué)習(xí)植物細(xì)胞原生質(zhì)體分離和純化的方法。方法。 2.2.了解原生質(zhì)體活性鑒定的原理。了解原生質(zhì)體活性鑒定的原理。由于原生質(zhì)體內(nèi)由于原生質(zhì)體內(nèi) 部與外界環(huán)境之間僅隔一層薄部與外界環(huán)境之間僅隔一層薄薄的細(xì)胞膜，必須保持在滲透壓平衡的溶液中才薄的細(xì)胞膜，必須保持在滲透壓平衡的溶液中才能保持其完整性。能保持其完整性。 其次其次,還應(yīng)當(dāng)考慮取材、酶的還應(yīng)當(dāng)考慮取材、酶的種類和純度、酶液的滲透壓、酶解時(shí)間及溫度等種類和純度、酶液的滲透壓、酶解時(shí)間及溫度等因素對(duì)分離原生質(zhì)體的影響。因素對(duì)分離原生質(zhì)體的影響。