QPCR原理及應(yīng)用參考模板

1、QPCR原理及應(yīng)用由于Real-time qPCR的眾多優(yōu)點，現(xiàn)在已經(jīng)是生命科學(xué)領(lǐng)域的一項常規(guī)技術(shù)。越來越多的研究文章中涉及RT-PCR的實驗，也基本上被real-time qPCR所代替。由于real-time aPCR 輸出的數(shù)據(jù)不同于常規(guī)的PCR 電泳檢測，很多沒有做過real-time qPCR的研究者常常感到高深莫測，不知從何入手；甚至一些做過次實驗的研究者也會對數(shù)據(jù)處理分析感到迷惑，不知所措。本文就從real-time qPCR的發(fā)展史說起，包括real-time qPCR的原理，實驗設(shè)計，實際操作，數(shù)據(jù)分析，常見問題解答五個方面，手把手教你從各個方面了解real-time qPC

2、R，徹底的從菜鳥到高手！一、Real-time qPCR發(fā)展史Real-time qPCR就是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實時檢測。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時期，模板的Ct 值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。由于常規(guī)的PCR的缺點，real-time qPCR由于其操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點發(fā)展非常迅速?，F(xiàn)在已經(jīng)涉及到生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，比如基因的差異表達(dá)分析，SNP檢測，等位基因的檢測，藥物開發(fā)，臨床診斷，轉(zhuǎn)基因研究等。在Real-time qPCR技術(shù)的發(fā)展過程中，定量PCR儀的發(fā)展起了至關(guān)重要的作用。1995年，美國PE公司（已經(jīng)并入

3、Invitrogen公司）成功研制了Taqman技術(shù)，1996年推出了首臺熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，通過檢測每個循環(huán)的熒光強(qiáng)度，通過Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。從而熒光定量PCR獲得廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)在的定量PCR儀有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISMStepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5、MyiQ、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler系列；Eppendorf Masercycler；Corb

4、ett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler和BIOER的LineGene系列。隨國內(nèi)生命科學(xué)的快速發(fā)展，科研水平不斷提高，發(fā)高水平文章已不再是新鮮事。與其同時，國內(nèi)公司經(jīng)過長期不懈的努力，也有自主研發(fā)的real-time PCR儀器生產(chǎn)比如西安天隆科技公司的TL系列儀器。2 / 24二、Real-time qPCR概述1. Real-time qPCR原理實時PCR就是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實時檢測。一般來講，定量PCR儀包括：實時熒光定量PCR儀主要由樣品載臺、基因擴(kuò)增熱循環(huán)組件、微量熒光檢測光學(xué)系統(tǒng)、微電路控制系統(tǒng)、計算機(jī)及應(yīng)用軟件

5、組成。其中基因擴(kuò)增熱循環(huán)組件工作原理與傳統(tǒng)基因擴(kuò)增儀大致相同，不同廠家不同型號的產(chǎn)品分別采用空氣加熱、壓縮機(jī)制冷、半導(dǎo)體加熱制冷等工作方式。獨特是這個微量熒光檢測系統(tǒng)。有由熒光激發(fā)光學(xué)部件、微量熒光檢測部件、光路、控制系統(tǒng)組成。常用的熒光激發(fā)方式有兩種：鹵鎢燈和LED；熒光檢測元件常用兩種方式：光電倍增管和冷光CCD攝像機(jī)，光單色元件有濾光片和光柵。在實時PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號被收集，轉(zhuǎn)化為成為擴(kuò)增和熔解曲線。具體數(shù)據(jù)就是基線，熒光閾值和Ct值。2. Real-time qPCR的數(shù)學(xué)原理首先來看一個real-time qPCR中的重要參數(shù)Ct值（Ct value），閾值（threshol

6、d），和基線（baseline）。一般來講，第3-15個循環(huán)的熒光值就是基線，是由于測量的偶然誤差引起的。閾值一般是基線的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。在實際操作中也可以手動調(diào)節(jié)，位于指數(shù)期就可以。Ct值就是熒光值達(dá)到閾值時候的PCR循環(huán)次數(shù)。所以是一個沒有單位的參數(shù)。那么為什么說Ct值跟初始模板的量成反比呢？我們來看PCR的擴(kuò)增方程：   從線性方程上看，斜率（slope）為-1/lg(1+E)，所以E=10-1/slope-1。如果從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到斜率（-3.3），就可以算出擴(kuò)增效率（0.99）。一般來講PCR擴(kuò)增效率在90%-110%都是可以用于數(shù)據(jù)分析的。效率低于10

7、0%，是由于PCR反應(yīng)中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特異性擴(kuò)增或者是引物二聚體造成。3. Real-time qPCR的種類根據(jù)real-time qPCR的化學(xué)發(fā)光原理可以分為2大類：一類為探針類，包括TaqMan探針和分子信標(biāo)，利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；一類為非探針類，其中包括如SYBRGreen I或者特殊設(shè)計的引物(如LUXPrimers) 通過熒光染料來指示產(chǎn)物的增加。3.1 Taqman探針法Taqman探針是最早用于定量的方法。就在PCR擴(kuò)增時加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸：5端標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)，3端標(biāo)記一

8、個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，也就是FRET反應(yīng)；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術(shù)平臺。3.2 分子信標(biāo)法分子信標(biāo)：一種在靶DNA不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，位于分子一端的熒光基團(tuán)與分子另一端的淬滅基團(tuán)

9、緊緊靠近。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30個核苷酸長，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)；莖一般5-7個核苷酸長，并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。分子信標(biāo)必須非常仔細(xì)的設(shè)計，以致于在復(fù)性溫度下，模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，模板存在時則與模板配對。與模板配對后，分子信標(biāo)的構(gòu)象改變使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時，它發(fā)出自身波長的光子。3.3 SYBRGreen 法SYBRGreen I是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測非常理想。SYBRGreen I 的最大吸收波長約為497nm，發(fā)

10、射波長最大約為520nm。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBRGreen 熒光染料，SYBRGreen 熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBRGreen 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。3.4 LUXPrimers法LUX (light upon extention) 引物是利用熒光標(biāo)記的引物實現(xiàn)定量的一項新技術(shù)。目標(biāo)特異的引物對中的一個引物3端用熒光報告基團(tuán)標(biāo)記。在沒有單鏈模板的情況下，該引物自身配對，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使熒光淬滅。在有目標(biāo)片斷的時候，引物與模板配對，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，產(chǎn)生特異的熒光信號。 4.

11、 Real-time qPCR和常規(guī)PCR的區(qū)別 實時檢測（在對數(shù)擴(kuò)增時期）而不是終點檢測 敏感性高 需要樣品少 特異性高 精確定量三、Real-time qPCR實驗設(shè)計實驗設(shè)計其實比實驗本身更重要！好的實驗設(shè)計可以事半功倍，節(jié)省時間！尤其做生物實驗，一定要查詢盡可能完全的相關(guān)資料，整理好思路，設(shè)計好實驗路線。當(dāng)然實驗過程中出現(xiàn)各種各樣的變化，但有足夠多的背景知識，就可以分析原因，才有可能創(chuàng)新。對于一個real-time qPCR而言，首先就是實驗材料的處理和準(zhǔn)備；然后引物設(shè)計，這步至關(guān)重要，好的引物是實驗本身成功的50%；進(jìn)行實驗和數(shù)據(jù)分析（這一部分單獨說明）。1. 實驗材料的處理和準(zhǔn)備以

12、最基本的基因表達(dá)差異分析為例。實驗材料分為對照組（CON）和處理組（TRT）。組內(nèi)要有生物重復(fù)，可以數(shù)據(jù)分析此處理是否有統(tǒng)計意義。在材料收集過程中，盡量避免RNA的降解（尤其對于絕對定量的樣品）。一般傳統(tǒng)的收集材料的方法是樣品采集立刻液氮速凍，然后迅速轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱保存，但這種方法攜帶不方便，由于對于異地取材?，F(xiàn)在新技術(shù)的發(fā)展，也有一些非液氮類的樣品儲存液 ，比如百泰克的RNAfixer 。2. 引物設(shè)計一般real-time PCR引物的設(shè)計遵循下面一些原則： 擴(kuò)增產(chǎn)物長度在80-150bp。 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。 產(chǎn)物長度一般在15-30堿基

13、之間。 G+C含量在40%-60%之間。 堿基要隨機(jī)分布。 引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。 引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。 引物5端可以修飾。 引物3端不可修飾。 引物3端要避開密碼子的第3位。Taqman探針的設(shè)計稍有不同，一般有公司設(shè)計合成。遵循下面以下原則： 盡量靠在上游引物； 長度30-45bp，Tm比引物高至少5； 5端不要是G，G會有淬滅作用，影響定量四、Real-time qPCR操作過程1. RNA提取和反轉(zhuǎn)錄在抽提RNA過程中任一環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導(dǎo)致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很難完全抑制，預(yù)防其污染是十分必要的。在實際的操作中應(yīng)遵循下面一些原則：1. 全

14、程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來源。培養(yǎng)良好的微生物實驗操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。2. 使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動吸管抽提RNA，避免使用公共儀器所導(dǎo)致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探針的實驗室可能用RNA酶A或T1來降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品（如自動吸管）可能富含RNA酶。3. 在提取裂解液中，RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對樣品的后續(xù)操作會要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時。塑料器皿可以在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅

15、菌備用。當(dāng)然，這些也不是絕對的要求。如果是操作熟練。完全可以用初次開封的離心管和槍頭，新過濾的超純水，進(jìn)行RNA的提取。2.Mix配制一般來講，進(jìn)行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在后面的數(shù)據(jù)分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無法進(jìn)行統(tǒng)計分析。通常來講，反應(yīng)體系的引物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據(jù)目的基因的表達(dá)豐度進(jìn)行調(diào)整。當(dāng)然這些都是經(jīng)驗

16、值，在操作過程中，還需要根據(jù)所用MasterMix，模板和引物的不同進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到一個最佳反應(yīng)體系。在反應(yīng)體系配置過程中，有下面幾點需要注意：1. MasterMix不要反復(fù)凍融，如果經(jīng)常使用，最好溶解后放在4度。2. 更多的配制Mix進(jìn)行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。3. 每管或每孔都要換新槍頭！不要連續(xù)用同一個槍頭加樣！4. 所有成分加完后，離心去除氣泡。5. 每個樣品至少3個平行孔。參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（現(xiàn)在已經(jīng)是ABI的注冊商標(biāo)了?。┗蛘咂渌玖?，只要不影響檢測PCR產(chǎn)物的熒光值就可以。參比染料的作用是標(biāo)準(zhǔn)化熒光定

17、量反應(yīng)中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩(wěn)定的基線?，F(xiàn)在很多公司已經(jīng)把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反應(yīng)曲線良好或已經(jīng)優(yōu)化好反應(yīng)體系，也可以不加ROXTM染料校正。通常來講，real-time qPCR的反應(yīng)程序不需要像常規(guī)的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產(chǎn)物長度在80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBRGreen等染料法，最好在PCR擴(kuò)增程序結(jié)束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產(chǎn)物的特異性擴(kuò)增。而溶解程序，儀器都有默認(rèn)設(shè)置，或稍有不同，但都是一個在產(chǎn)物進(jìn)行溶解時候，進(jìn)行熒光信號的收

18、集。3. 儀器設(shè)置所有儀器的操作都基本一致。設(shè)置的時候包括反應(yīng)板設(shè)置（plate setup）和程序設(shè)置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細(xì)看一下反應(yīng)設(shè)置：A. 首先是實驗?zāi)康倪x擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進(jìn)行“定量”實驗。B. 實驗方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進(jìn)行。C. 目的基因的設(shè)置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。D. 樣品的設(shè)置：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負(fù)對照的設(shè)置和生物重復(fù)的設(shè)置。E. 對照組和內(nèi)參基因的設(shè)置：這個是為后面的定量做準(zhǔn)備F. 反應(yīng)程序的設(shè)置：

19、PCR反應(yīng)程序的設(shè)置要根據(jù)不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95 2分鐘就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環(huán)反應(yīng)是9515秒，6015秒的40個循環(huán)。溶解曲線程序采用儀器默認(rèn)設(shè)置就可以?；蛘呤莾x器說明書上建議的程序。G. 反應(yīng)體系的設(shè)置：A-G這五個步驟簡單設(shè)置好，可以保存，修改反應(yīng)程序或者立刻進(jìn)行反應(yīng)。需要注意一點ABI儀器需要加ROX參比染料，默認(rèn)的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是單獨分開。要根據(jù)不同公司的MasterMix進(jìn)行這一個步驟的選擇。BioTeke的MasterMix里沒有參比染料，所以選擇“none

20、”。設(shè)置好之后，就可以把配置好的PCR管放進(jìn)儀器，點擊RUN！五、Real-time qPCR數(shù)據(jù)分析1. Real-time qPCR常見參數(shù) 基線（baseline）通常是3-15個循環(huán)的熒光信號同一次反應(yīng)中針對不同的基因需單獨設(shè)置基線 閾值（threshold）自動設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動設(shè)置：置于指數(shù)擴(kuò)增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強(qiáng)。同一次反應(yīng)中針對不同的基因可單獨設(shè)置閾值，但對于同一個基因擴(kuò)增一定要用同一個閾值。 Ct值:與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系。分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。 Rn（Normalized

21、 reporter）是熒光報告基團(tuán)的熒光發(fā)射強(qiáng)度與參比染料的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值。Rn：Rn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果（Rn=Rn-基線）。2.影響Ct值的關(guān)鍵因素 模板濃度模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適范圍內(nèi)，使Ct在15-35之間。 反應(yīng)液成分的影響任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響-比如溶液的pH值和鹽濃度。 PCR反應(yīng)的效率PCR反應(yīng)的效率也會影響Ct值。在PCR擴(kuò)增效率低的條件下進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋擴(kuò)增，與PCR擴(kuò)增效率高的條件下相比，可能會所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR效率取決于實驗、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說來，反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。

22、3. 如何評估實時定量PCR反應(yīng)的效果 PCR擴(kuò)增效率：為了正確地評估PCR擴(kuò)增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，至少做5個數(shù)量級倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。 R2值：另一個評估PCR效率的關(guān)鍵參數(shù)是相關(guān)系數(shù)R2，它是說明兩個數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計學(xué)術(shù)語。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）來準(zhǔn)確預(yù)測X值（量）。如果R2等于0，你就不能通過Y值來預(yù)測X值。R2值大于0.99 時，兩個數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。 精確度:標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，偏差的平方根）是最常用的精確度計量方法。如果許多數(shù)據(jù)點都靠近平均值，那么標(biāo)準(zhǔn)偏差就小；如果許多數(shù)據(jù)點都遠(yuǎn)離平均值，則標(biāo)

23、準(zhǔn)偏差就大。實際上，足夠多重復(fù)次數(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)組會形成大致的正態(tài)分布。這經(jīng)?？赏ㄟ^經(jīng)典的中心極限理論來證明，獨立同分布隨機(jī)變量在無限多時趨向于正態(tài)分布。如果PCR反應(yīng)效率是 100%，那么2倍稀釋點之間的平均Ct間隔應(yīng)該恰為1個Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標(biāo)準(zhǔn)偏差就必須小于等于0.167。標(biāo)準(zhǔn)偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標(biāo)準(zhǔn)偏差必須小于等于 0.250。靈敏度：無論CT絕對值是多少，任何能夠有效擴(kuò)增和檢測起始模板拷貝數(shù)為1的系統(tǒng)都達(dá)到了靈敏度的極限。PCR效率是決定反應(yīng)靈敏度的關(guān)鍵因素。在檢測極低拷貝數(shù)時的另一個重要的考慮因素

24、是，低拷貝時的模板數(shù)量不能按普通情況來預(yù)期。相反，它會遵循泊松分布，即進(jìn)行大量的平行重復(fù)，平均應(yīng)該含有一個拷貝的起始模板，實際上約37%不含有拷貝，僅有約37%含有1個拷貝，約18%實際上含有兩個拷貝。因此，為了更可靠地檢測低拷貝，必須做大量的平行重復(fù)實驗來提供統(tǒng)計顯著性，并克服泊松分布的限制。評價熒光PCR結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn) 因素 建議  指標(biāo) 效率  5個數(shù)量級梯度稀釋  Slope-3.3  R2>0.99 精密度  至少3個重復(fù)  標(biāo)準(zhǔn)差<0.25（0.5或者1個Ct之內(nèi)） 靈敏度&

25、#160; 增加低濃度樣本的重復(fù)數(shù)  統(tǒng)計分析        除了這些因素，還必須評估和驗證合適的實驗對照（如無模板對照，無 反轉(zhuǎn)錄酶對照等）以及模板質(zhì)量。3. Real-time qPCR定量方法可以分絕對定量和相對定量。絕對定量是用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而得到目的基因的量。該標(biāo)準(zhǔn)品可以是純化的質(zhì)粒DNA，體外轉(zhuǎn)錄的RNA，或者是體外合成的ssDNA。相對定量可以分比較Ct法和其他一些相對方法。比較Ct指的是通過與內(nèi)參基因Ct值之間的相差來計算基因表達(dá)差異,也稱之是2-Ct。3.1 絕對定量 3.2 2-Ct定量 3.3 其他定量方法 Marisa L. Wong and Juan F. Medrano: BioTechniques July 2005 六、Real-Time qPCR常見問題分析1.無Ct值出現(xiàn) 檢測熒光信號的步驟有誤: 一般SG法采用72延伸時采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。 引物或探針降解: 可通過PAGE電泳檢測其完整性。 模板量不足: 對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。