蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定（課堂PPT）

1、1第三章第三章蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的測定2 n蛋白質(zhì)氨基酸順序的蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究測定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。的基礎(chǔ)。n自從自從1953年年F.Sanger測定了胰島素的一級結(jié)測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級千種不同蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)被測定。結(jié)構(gòu)被測定。 3蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的測定是一項非常復(fù)雜的工作蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的測定是一項非常復(fù)雜的工作4A. 樣品必需純（樣品必需純（97%以上）；以上）；B. 知道蛋白質(zhì)的分子量；知道蛋白質(zhì)的分子量；C. 知道蛋白質(zhì)由幾個亞基組成；知道蛋白質(zhì)由幾個亞基組成；D. 測定蛋白質(zhì)

2、的氨基酸組成；并根據(jù)分子量測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計算每種氨基酸的個數(shù)。計算每種氨基酸的個數(shù)。E. 測定水解液中的氨量，計算酰胺的含量。測定水解液中的氨量，計算酰胺的含量。（1）測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的要求）測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)的要求5（2 2）蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)測定方法）蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)測定方法氨基酸組成分析氨基酸組成分析氨基酸末端分析氨基酸末端分析蛋白質(zhì)中肽鏈的拆離蛋白質(zhì)中肽鏈的拆離肽鏈的部分降解及肽片斷的分離肽鏈的部分降解及肽片斷的分離肽段氨基酸順序測定及肽段重疊肽段氨基酸順序測定及肽段重疊二硫鍵與酰胺基的定位二硫鍵與酰胺基的定位 6測定蛋白質(zhì)氨基酸殘基組成測定蛋白質(zhì)氨基

3、酸殘基組成n 根據(jù)蛋白質(zhì)分子量，計算出構(gòu)成蛋白質(zhì)的各種氨根據(jù)蛋白質(zhì)分子量，計算出構(gòu)成蛋白質(zhì)的各種氨基酸的數(shù)量；基酸的數(shù)量；n 采用經(jīng)典的陽離子交采用經(jīng)典的陽離子交換色譜分離、茚三酮換色譜分離、茚三酮柱后衍生法，對蛋白柱后衍生法，對蛋白質(zhì)水解液及各種游離質(zhì)水解液及各種游離氨基酸的組分含量進(jìn)氨基酸的組分含量進(jìn)行分析。行分析。7測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目 通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。 8n由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分單獨分由多條

4、多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分單獨分離出來；離出來；n幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一 起?？稍谄稹？稍?mol/L尿素或尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的鹽酸胍存在下，用過量的 -巰基乙醇處理，使二硫鍵巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基；還原為巰基；n用過氧酸氧化或巰基化合物還原二硫鍵斷裂，用烷基化試用過氧酸氧化或巰基化合物還原二硫鍵斷裂，用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，防止其重新被氧化；劑保護(hù)生成的巰基，防止其重新被氧化； n如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或尿素或6mol/L鹽酸胍處理

5、，即可分開多肽鏈鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基亞基)。 二硫健的斷裂及多肽鏈的拆分二硫健的斷裂及多肽鏈的拆分9巰基的保護(hù)巰基的保護(hù)-OOCCHCH2SHNH3+ICH2CNH2OCH2OCClOCH2Cl-OOCCHCH2SNH3+OCCH2OCH2-OOCCHCH2SNH3+CH2CNH2O-OOCCHCH2SNH3+用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化10n用酶溴化氫選擇性降解多肽鏈產(chǎn)生的肽段用酸水解、堿用酶溴化氫選擇性降解多肽鏈產(chǎn)生的肽段用酸水解、堿水解（針對色氨酸分析）或酶水解后，用氨基酸自動分析水解（針對色氨酸分析）或酶水解后

6、，用氨基酸自動分析儀測定；儀測定；n測定并計算出蛋白質(zhì)的氨基酸種類和數(shù)量；用測定并計算出蛋白質(zhì)的氨基酸種類和數(shù)量；用Edman反反應(yīng)分析各肽段氨基酸順序；應(yīng)分析各肽段氨基酸順序；多肽鏈的選擇性降解及肽段的多肽鏈的選擇性降解及肽段的氨基酸組成和順氨基酸組成和順序的測定序的測定11p獲得的各肽段的氨基酸順序彼此間的交替重獲得的各肽段的氨基酸順序彼此間的交替重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序；疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序；確定多肽鏈中二硫鍵的位置。確定多肽鏈中二硫鍵的位置。利用酶利用酶選擇性降解和溴化氰選擇性降解選擇性降解和溴化氰選擇性降解122、多肽鏈氨基酸順序分析、多肽鏈氨基酸順序分析 多肽

7、鏈降解必須滿足兩個條件：多肽鏈降解必須滿足兩個條件：n 選擇性強(qiáng)、反應(yīng)產(chǎn)率高選擇性強(qiáng)、反應(yīng)產(chǎn)率高n 主要方法包括酶解法和化學(xué)法主要方法包括酶解法和化學(xué)法13n某些蛋白水解酶能夠選擇性的水解多肽鏈中的某些蛋白水解酶能夠選擇性的水解多肽鏈中的某一類肽鍵；某一類肽鍵；n主要有胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱主要有胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶；菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶；n糜蛋白酶（糜蛋白酶（chymotrypsin):苯丙氨酸、色氨酸、酪氨苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、組氨酸；酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、組氨酸；n胃蛋白酶（胃蛋白酶（pepsin

8、)：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、以及其他疏水性強(qiáng)氨酸、以及其他疏水性強(qiáng)酶解法酶解法14 特點：專一性較強(qiáng)，水解速度快特點：專一性較強(qiáng)，水解速度快 斷裂位點：賴氨酸或精氨酸殘基的羧基參與形成的肽鍵斷裂位點：賴氨酸或精氨酸殘基的羧基參與形成的肽鍵 R1=Lys（賴、（賴、K）和）和Arg（精、（精、R） R2=Pro（抑制）（抑制）NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1肽鏈肽鏈水解位點水解位點胰蛋白酶（胰蛋白酶（trypsin）15 特點：專一性稍弱，特點：專一性稍弱，Leu、Met和和His稍慢稍慢 斷裂位點：斷裂位點

9、：Phe（苯丙）、（苯丙）、Trp（色）、（色）、Tyr（酪）等疏水氨基（酪）等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵酸殘基的羧基端肽鍵 R1=Phe（F）、）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性）等疏水性AA R2=Pro（抑制）（抑制） NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1肽鏈肽鏈水解位點水解位點糜蛋白酶糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度與相鄰水解速度與相鄰AA性質(zhì)有關(guān)性質(zhì)有關(guān): 酸性：酸性：-/堿性：堿性：+16特點專一性與糜蛋白酶相似，較弱；特點專一性與糜蛋白酶相似，較弱；斷裂位點：兩側(cè)的殘基都是疏水性氨基酸斷裂位點

10、：兩側(cè)的殘基都是疏水性氨基酸R1和和/或或R2Phe（F）、）、Trp（W）、）、Tyr（Y）、）、 Leu（L）及其它疏水性）及其它疏水性AA水解速度較快水解速度較快 R1=Pro（抑制）（抑制）pH2.0NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽鏈肽鏈水解位點水解位點胃蛋白酶胃蛋白酶 Pepsin17 特點：專一性較差特點：專一性較差 斷裂位點：斷裂位點：Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr、Met等疏等疏水性強(qiáng)氨基酸殘基的羧水性強(qiáng)氨基酸殘基的羧 基端肽鍵基端肽鍵 R2=Phe（F）、）、 Trp（W）、）、 Tyr（Y）、）、Leu（L）、）、Ile（I

11、）、）、Met（M）、）、Val（V）及其它疏水性強(qiáng)的）及其它疏水性強(qiáng)的AA水解速度較快水解速度較快嗜熱菌蛋白酶（嗜熱菌蛋白酶（thermolysin)18木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶： 專一性差專一性差 斷裂位點：對斷裂位點：對Arg和和Lys殘基的羧基端肽鍵敏感殘基的羧基端肽鍵敏感葡萄球菌蛋白酶葡萄球菌蛋白酶： 高專一性高專一性 斷裂位點：斷裂位點：Glu和和Asp殘基的羧基端肽鍵殘基的羧基端肽鍵 磷酸緩沖液磷酸緩沖液 Glu殘基的羧基端肽鍵殘基的羧基端肽鍵 碳酸氫銨、醋酸銨緩沖液）碳酸氫銨、醋酸銨緩沖液）梭菌蛋白酶梭菌蛋白酶： 高專一性高專一性 斷裂位點：斷裂位點：Arg殘基的羧基端肽鍵殘基的羧

12、基端肽鍵19n溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。的羧基所形成的肽鍵。化學(xué)法化學(xué)法20-選擇性地切割由選擇性地切割由Met羧基形成的肽鍵羧基形成的肽鍵CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHCNHCHCOORCNCH3SCN CH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高絲氨酸內(nèi)酯溴化氰水解法溴化氰水解法(Cyanogen bromide)21N末端的測定末端的測定二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（DNFB法）；二甲氨基萘磺酰氯法法）

13、；二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-CL 法）；異硫氰酸苯脂法（法）；異硫氰酸苯脂法（PITC 法）；法）；C末端的測定末端的測定羧肽酶法；硼氫化鋰法；肼解法羧肽酶法；硼氫化鋰法；肼解法（2）多肽鏈的末端氨基酸測定）多肽鏈的末端氨基酸測定22nN末端測定方法比較末端測定方法比較C末端更加成熟、可靠和準(zhǔn)確，主要的末端更加成熟、可靠和準(zhǔn)確，主要的方法有：方法有：二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（DNFB法）法） 肽鏈肽鏈N末端氨基與末端氨基與2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）反應(yīng)，生成二）反應(yīng)，生成二硝基苯的衍生物（硝基苯的衍生物（DNP-肽），其經(jīng)酸水解后生成的肽），其經(jīng)酸水解后生成的DNP-氨氨基

14、酸可用有機(jī)溶劑（如乙酸乙酯）抽提，再與其他氨基酸分基酸可用有機(jī)溶劑（如乙酸乙酯）抽提，再與其他氨基酸分開，鑒定得知開，鑒定得知N末端的氨基酸。末端的氨基酸。N末端的測定末端的測定23二硝基氟苯法二硝基氟苯法(FDNB,DNFB): 1945年年Sanger提出此方法。提出此方法。24n熒光劑二甲氨基萘磺酰氯（熒光劑二甲氨基萘磺酰氯（dansyl-chloride, DNS-Cl）可以）可以作為標(biāo)記試劑專一地與肽鏈作為標(biāo)記試劑專一地與肽鏈N末端氨基反應(yīng)生成末端氨基反應(yīng)生成DNS-肽；肽；n同樣，酸水解后可得同樣，酸水解后可得DNS-氨基酸，用乙酸乙酯抽提，然后氨基酸，用乙酸乙酯抽提，然后用層析法

15、鑒定；用層析法鑒定；nDNS-氨基酸于氨基酸于360nm或或280nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，根據(jù)熒處產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，根據(jù)熒光點的位置，確定光點的位置，確定N末端的氨基酸。此方法反應(yīng)原理同末端的氨基酸。此方法反應(yīng)原理同DNFB法，但其靈敏度比法，但其靈敏度比DNFB法高約法高約100倍，用于層析分析的樣品倍，用于層析分析的樣品只需只需1nmol。二甲氨基萘磺酰氯法（二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）法） 25二甲基氨基萘磺酰氯法二甲基氨基萘磺酰氯法,丹磺酰氨基酸具有強(qiáng)烈的黃色熒丹磺酰氨基酸具有強(qiáng)烈的黃色熒光光,靈敏性是靈敏性是DNFB法的法的100倍倍.26 基本原理：偶聯(lián)基本原理：偶聯(lián)-環(huán)化環(huán)化

16、-轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化n異硫氰酸苯酯能與異硫氰酸苯酯能與N末端氨基偶聯(lián)生成苯氨基硫甲酰衍生物末端氨基偶聯(lián)生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-肽）肽）異硫氰酸苯酯法（異硫氰酸苯酯法（PITC法）法）27n 在酸性溶液中，在酸性溶液中，PTC-肽經(jīng)環(huán)化裂解生成肽經(jīng)環(huán)化裂解生成PTC-氨基酸和氨基酸和N末端少一個氨基酸的剩余多肽，前者可用于末端少一個氨基酸的剩余多肽，前者可用于N末端氨基酸鑒末端氨基酸鑒定，但是該產(chǎn)物不穩(wěn)定，很快進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成定，但是該產(chǎn)物不穩(wěn)定，很快進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成3-苯基苯基-2-乙內(nèi)乙內(nèi)酰硫脲酰硫脲-氨基酸（氨基酸（PTH-氨基酸）。氨基酸）。28n 生成的生成的PTH-氨基酸非常穩(wěn)定，它在氨基酸非

17、常穩(wěn)定，它在268nm處有強(qiáng)吸收峰。處有強(qiáng)吸收峰。剩余多肽鏈的剩余多肽鏈的N末端仍是自由的，可以進(jìn)一步與異硫氰酸末端仍是自由的，可以進(jìn)一步與異硫氰酸苯酯反應(yīng)進(jìn)行第二步降解。這樣就可以從苯酯反應(yīng)進(jìn)行第二步降解。這樣就可以從N末端開始逐次末端開始逐次降解下去，進(jìn)行順序測定。該方法也稱降解下去，進(jìn)行順序測定。該方法也稱Edman順序降解，順序降解，它是制造氨基酸順序分析儀的理論基礎(chǔ)。它是制造氨基酸順序分析儀的理論基礎(chǔ)。29一般說來，一般說來，C末端測定較末端測定較N末端分析的誤差大?？刹捎玫姆椒┒朔治龅恼`差大。可采用的方法有：有：1羧肽酶法羧肽酶法：羧肽酶能特異地水解：羧肽酶能特異地水解C末端氨基

18、酸形成的肽鏈，而用于測定末端氨基酸形成的肽鏈，而用于測定C末端氨基酸。羧肽酶分末端氨基酸。羧肽酶分A、B、C、Y4種，羧肽酶種，羧肽酶A使用最多，但對使用最多，但對C末端末端的的Pro、Arg、Lys及及Hyp不起作用。羧肽酶不起作用。羧肽酶B，只釋放，只釋放C末端的末端的Lys和和Arg，可以和羧肽酶可以和羧肽酶A互補(bǔ)使用。羧肽酶互補(bǔ)使用。羧肽酶C的作用范圍寬。但對的作用范圍寬。但對C末端的末端的Hyp或連或連續(xù)幾個甘氨酸（續(xù)幾個甘氨酸（-Gly-Gly-Gly）無作用。羧肽酶）無作用。羧肽酶Y也具很寬的作用范圍。也具很寬的作用范圍。2硼氫化鋰法（硼氫化鋰法（LiBH4法，也稱法，也稱“還原法還原法”）：硼氫化鋰可以與：硼氫化鋰可以與C末端氨末端氨基反應(yīng)生成相應(yīng)的基反應(yīng)