石蠟切片、HE、免疫組化步驟

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上石蠟切片、HE、免疫組化實(shí)驗(yàn)一：取材及石蠟切片的制作（本次取材為小腸、膀胱、子宮、宮頸）取材：小鼠脫頸處死后，應(yīng)立即找到自己所需的組織器官，用一張濾紙將所需器官放在其上（可以加一些生理鹽水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的組織，根據(jù)不同器官切成合適大小的形狀（如小腸應(yīng)切成1cm長度的長柱形）。將切好的組織裝于凍存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保護(hù)蛋白，防止蛋白降解）固定過夜（固定時(shí)間不能超過24h，如果24h后不能完成脫水工作，可以先50%、70%酒精脫水后，置于4冰箱保存。）脫水（目的是為了使組織從水相置換到有機(jī)相）（根據(jù)不同的組織，脫水時(shí)間不

2、同）：將PFA中的組織取出，放入組織盒（組織盒子應(yīng)盡量選擇小格子，防止組織脫水過程中掉出來），一個(gè)組織盒可以放48個(gè)組織小塊，切一張與格子大小合適的紙條一并裝入，做好標(biāo)簽，防止后期辨認(rèn)不出具體組織（只能用鉛筆寫，中性筆會(huì)被酒精脫去）。使用自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行脫水，設(shè)定程序?yàn)椋壕凭?0%、70%、80%、90%（各20min）、無水乙醇（30min/次，兩次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（兩次）、二甲苯石蠟混合物（1：1）30min、石蠟1h；脫水結(jié)束后，取出組織盒，置于石蠟中1h（石蠟應(yīng)提前融化，且不能凝固，放在70烘箱中）。包埋：用4X6cm的小紙條根據(jù)小木塊形狀，疊成

3、盒子（盒子最好四邊疊平，不要左右不平，便于放融化的蠟進(jìn)去后能得到比較好的形狀，最好不要漏），取一個(gè)盒子，將融化的石蠟倒入，在其快要凝固的時(shí)候，將組織按照所需的形狀，擺正（如小腸切成的小柱子應(yīng)立起來，便于后面切片的時(shí)候，可以切到所需的形狀），再用做好標(biāo)記的長紙條貼著盒子壁固定（為了包埋后識(shí)別組織，且不能將紙條放在蠟塊中央，后期不好取出，會(huì)損壞刀片），倒蠟之前，可以將盒子放在鐵皮或小鐵塊上（能夠讓石蠟更快凝固。），每次用鑷子拿組織或擺正組織之前，先燒一下（能夠更好擺正組織塊，可以隨時(shí)調(diào)整組織位置）。包埋過夜。切片：將包埋好的蠟塊取出，置于小木塊上，用刀修成梯形（包埋時(shí)組織所在的底面現(xiàn)在變成正面，主

4、要修這一面，蠟塊厚的一面用燒過的刀塊燙平，貼在小木塊上，貼緊底面后，用刀片燙一下四邊，使蠟塊完全固定在小木塊上，防止切片時(shí)掉落）（組織蠟塊的梯形上下邊一定要平行，梯形不用太大，也不能太小，保證組織在梯形中央，此時(shí)應(yīng)有三個(gè)平面，木塊平面、石蠟平面、組織梯形平面）（切的時(shí)候，切出的薄片應(yīng)垂直向下走，如果是扇形或很亂的話，說明梯形上下邊與刀片這三邊不平行，可以調(diào)一下固定蠟塊的地方，使三邊平行。）切成5-7um厚的切片，左手輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)小毛筆將切出的組織條帶置于紙上，用鋒利的刀切四五個(gè)梯形置于聚水玻片上，（用針輕輕挑上去）（切時(shí)，快、準(zhǔn)、狠，不要多次切來切去，一刀切）（聚水玻片置于烘烤機(jī)上，先滴幾滴水，等

5、組織完全展開后，從側(cè)邊輕輕倒掉水，不要把組織倒掉了，然后用濾紙彎曲一下，以貼膜的手法，輕輕吸去多余的水分）顯微鏡檢查切片狀況，符合要求的，40烘烤過夜（14-18h之后便可保持了）二：HE染色將做好的切片置于55烤片臺(tái)烘烤1h（烤片臺(tái)溫度升到55時(shí)才計(jì)時(shí)，片子用一個(gè)蓋子蓋住，防止散熱，不要碰到組織就行，沒有烤片臺(tái)時(shí)，恒溫加熱的地方都行，）（這一步主要是將蠟融化，便于后面將組織內(nèi)有機(jī)相置換成水相）（提前將二甲苯拿到烤片臺(tái)旁邊，防止石蠟又凝固了）切片置于二甲苯（10min/次，兩次）（放置切片的時(shí)候，一般將有組織的一面朝向玻璃罐內(nèi)側(cè)，防止組織被劃掉）；100%、90%、80%、70%、50%酒精（

6、5min/次，一次）；去離子水（5min/次）（純凈水也可以）。（置于水中這段時(shí)間可以延長，便于準(zhǔn)備后面步驟所需試劑），將切片組織周圍部位用濾紙擦干，用PAP蠟筆沿著組織畫一個(gè)框，滴加蘇木精染色30s（蘇木精染細(xì)胞核的，回收蘇木精，節(jié)約試劑），染完后立刻置于純凈水中，洗去蘇木精（大概沒有藍(lán)色浮出就行），置于氨水中返藍(lán)1min（30ml純凈水中滴加8滴氨水），鹽酸分色3s（30ml純凈水中滴加3滴HCl），氨水再反藍(lán)35min，純凈水5min（顯微鏡下觀察蘇木精是否染上了，如果藍(lán)色太淺，從新染一次）（不同組織蘇木精染色時(shí)間有所差異，應(yīng)根據(jù)組織自行調(diào)整時(shí)長）。50%、70%、80%、90%，各一次

7、；100%酒精兩次（1min/次）（將組織中水相置換成有機(jī)相）（這里不能用一開始那一批酒精了，因?yàn)橹澳切├锩婧邢?，用新的酒精）（酒精脫水后，將玻片置于純凈水中，?zhǔn)備后面所需器材）伊紅染色10s，將玻片置于100%酒精1min（時(shí)間不定，具體看蘇木精顏色有沒有變淺，顯微鏡下觀察有沒有染上伊紅以及是否染得太過，如果染得太紅，再次置于酒精中，可以多次操作），待染色比較滿意后，置于二甲苯（3min/次，兩次）（一般這種兩次的，都是將試劑分裝，不能同一個(gè)玻璃罐放6min當(dāng)成兩次）中性樹膠封片（中性樹膠可以用二甲苯稀釋一下，稀一點(diǎn)容易封片）（封片時(shí)，將蓋玻片用絲巾擦干凈，置于濾紙上，取玻片，倒扣在蓋玻

8、片上，注意輕輕貼，不要產(chǎn)生氣泡，有氣泡需要排出去），封片后，平臺(tái)放置幾分鐘，保存。三：免疫組化使用的試劑這些，一般都是現(xiàn)配現(xiàn)用?？贵w配置后，晃勻。（1）第一天將做好的切片置于55烘烤1h。切片置于二甲苯（10min/次，兩次）；100%、90%、80%、70%、50%酒精（5min/次，一次）；去離子水（5min/次）（注意事項(xiàng)與HE一樣）（這之后的所有步驟，都不能讓切片干了！一旦干片，后面的抗原抗體結(jié)合不充分，也會(huì)影響后面顯色）（將切片置于塑料的切片架中，置于裝有檸檬酸鈉的燒杯里，動(dòng)作快，不要讓切片干了，不能用鐵架子，因?yàn)橐盼⒉t中修復(fù)）檸檬酸鈉微波修復(fù)10min（檸檬酸鈉修復(fù)液：無水檸檬

9、酸0.18g、檸檬酸三鈉二水1.47g、純凈水500ml，現(xiàn)配現(xiàn)用，不能使用兩次）（微波爐中修復(fù)時(shí)，切記不能讓修復(fù)液沸騰，不然組織會(huì)被煮掉了，微微沸騰后，調(diào)到低火修復(fù)，才開始計(jì)時(shí)），（修復(fù)的目的是釋放出之前被4%PFA固定保護(hù)住的蛋白，不然后面抗體找不到反應(yīng)的東西，修復(fù)時(shí)間根據(jù)選擇的抗體而定。）修復(fù)后將燒杯自然冷卻到室溫，然后置于1xPBS中靜置5min。將切片置于3%雙氧水中15min（目的是為了去除內(nèi)源性的過氧化物酶，后面要加外源性的過氧化物酶標(biāo)記物，防止內(nèi)源性過氧化物酶的干擾，消除假陽性。）（雙氧水這些試劑現(xiàn)配現(xiàn)用，30%雙氧水取3ml置于27ml的 85%甲醇中，這里為什么要用甲醇來稀

10、釋不用水？）將玻片置于1xPBS中靜置5min，三次。（期間不用取出玻片，輕輕倒掉PBS，緩緩加入就行，動(dòng)作要快）（目的是洗去雙氧水）將玻片取出，用濾紙擦去組織周圍多余水分，用PAP蠟筆圍著組織畫一個(gè)框，置于濕盒中（盒子里加一點(diǎn)PBS，覆蓋住底部，目的是為了保證濕度，防止干片）（動(dòng)作快，不能讓組織干了），用移液槍滴加幾滴Blocking solution封閉液（不用太多，不能太少，覆蓋住全部組織塊后追加兩滴），置于室溫下封閉1h（不同封閉液封閉溫度不同，根據(jù)一抗的種類選擇封閉液）（封閉液的目的是，遮擋住一抗的非特異性抗原，只暴露一抗特異性抗原和一抗結(jié)合。）（封閉液常用10%的馬血清，封閉溫度3

11、7）封閉之后，滴加幾滴一抗，4孵育過夜（14h左右）（一般來說，一抗的選擇就是根據(jù)組織來定，比如我們選擇的是小鼠，那一抗就是抗小鼠某個(gè)特定蛋白的抗體，無所謂來自什么動(dòng)物，比如我可以將小鼠血清注入馬，就可以得到馬源抗小鼠抗體）（一抗配置時(shí)，一抗：封閉液的比例是1：1000，）（2）第二天用移液槍吸取切片上剩余一抗，用PBS洗滌三次，每次5min。（為了避免干片，所有放在PBS里這一步都可以適當(dāng)延長時(shí)間，準(zhǔn)備下一步的東西）將切片拿出后，用濾紙擦干組織周圍和縫隙內(nèi)多余水分（防止稀釋BSA濃度），移液槍滴加用1xBSA稀釋生物素標(biāo)記的二抗（1%BSA：二抗=1：200），覆蓋住組織，室溫下放置40mi

12、n。（BSA用1xPBS稀釋成1%濃度）（二抗抗一抗來源，比如一抗是馬源抗小鼠抗體，則二抗應(yīng)該為抗馬抗體）將切片置于1xPBS洗滌3次，每次5min。（把沒有結(jié)合的二抗洗去）與步驟相似，用1%BSA稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素（1：200），室溫孵育40min。（相當(dāng)于三抗）（這就是為什么第一天要加雙氧水祛除內(nèi)源性過氧化物酶的原因）將切片置于1xPBS洗滌3次，每次5min。（把沒有結(jié)合的三抗洗去）在洗滌切片期間，配置DAB（用DAB濃縮液與DAB底物按7ul：1ml的比例配制，配完震蕩搖勻，13000r/3min）（DAB目的是與過氧化物酶結(jié)合）配置好后，將切片移到有顯微鏡旁邊，擦干組織周圍水分（注意正反面，不要擦到組織?。?，滴加DAB液體，顯微鏡觀察信號(hào)強(qiáng)弱（一般30s之后便能看到信號(hào)，不能染色超過2min，不然非特異性信號(hào)太強(qiáng)，整張片子都是信號(hào)）（看到信號(hào)之后，將切片放在1xPBS中，洗去DAB液）與HE染色相似，蘇木精30s，洗去蘇木精，氨水返藍(lán)1min，鹽酸分色3s，氨水再返藍(lán)3-5