實驗六薄層層析與柱層析

1、實驗六 薄層層析與柱層析實驗?zāi)康?. 了解偶氮苯的光學(xué)異構(gòu)反應(yīng)，加深對光化學(xué)反應(yīng)的理解。2. 掌握薄層層析的基本操作,薄層層析分離順、反式偶氮苯。3. 了解柱層析分離有機化合物的原理，初步掌握層析柱裝填和洗脫的操作方法4. 采用柱層析分離反式偶氮苯與靛紅的混合物實驗原理偶氮苯是最簡單的芳香偶氮化合物，眾多偶氮染料的母體結(jié)構(gòu)。含有兩個苯基分別與偶氮基N=N兩端相連的結(jié)構(gòu)。偶氮苯有毒，易燃。偶氮苯有順（Z）-反（E）-異構(gòu)體。反式為橙紅色棱形晶體，蒸氣為深紅色，溶于乙醇、乙醚、醋酸和水。反式的熱力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。當(dāng)溶于乙醇的偶氮苯用一定強度的紫外光照射時，順式的比例逐漸增大，直至達到平衡，形成順反異構(gòu)

2、體的混合物。偶氮苯的光致異構(gòu)是很多偶氮類功能材料光響應(yīng)的基礎(chǔ)。順式為橙紅色片狀晶體，不穩(wěn)定，在加熱或可見光照射下能夠變成反式。色譜方法是通過在固定相和流動相間分配的不同而將物質(zhì)分離開。待分離混合物各組分在固定相上的吸附強度不同，與流動相一起移動的速度也不同，因此被分離開。薄層色譜屬于固-液吸附色譜。薄層色譜板中的固定相中的微孔結(jié)構(gòu)使得溶劑在毛細管作用下能夠沿著色譜板向上移動。由于混合物中各組分對吸附劑（固定相）的吸附能力不同，當(dāng)展開劑（流動相）流經(jīng)吸附劑時發(fā)生無數(shù)次吸附解附過程，吸附力弱的組分隨流動相迅速向前移動，吸附力強的組分滯留在后，由于各組分具有不同的移動速度，最終在固定相薄層析上分離。

3、TLC除了用于分離外，還可以通過與已知結(jié)構(gòu)的的化合物比對，鑒定少量有機混合物的組成，它也是柱色譜尋求最佳展開劑的手段。上圖中紅色化合物的Rf等于豎直紅線的長度除以豎直藍線的長度。 柱層析也屬于固-液吸附色譜。在一根玻璃“分離柱”中進行。管中裝上適當(dāng)?shù)姆勰┳鳛閲ㄏ?。待分離或純化物質(zhì)的溶液（流動相）在重力作用下流經(jīng)吸附劑時，不同物質(zhì)對溶劑和吸附劑的親和力不同，因而被吸附的程度不同，從而以不同速度流動，使化合物得以分離。靛紅與偶氮苯在極性上具有較大差異，從而可以使用極性適中的展開劑，通過柱層析將二者分離。儀器與試劑分析天平，TLC，錐形瓶，毛細管，層析柱，棉花，量筒，硅膠，蒸發(fā)皿，展缸；EtOAc

4、, CH2Cl2, 石油醚，靛紅；請自帶尺子（用于計算Rf值）顏老師在實驗開始之前已經(jīng)準備好的試劑：a. 偶氮苯的溶液（15 mg in 1mL EtOH）；b.靛紅的溶液（15 mg in 1mL CH2Cl2）；c. 靛紅與偶氮苯的均勻混合物（靛紅1.4 g + 偶氮苯3.5 g）。實驗內(nèi)容a) 光照異構(gòu)化取0.1 g反式偶氮苯溶于5 mL無水乙醇中，將此溶液放于試管中，密封，置于可見光下二星期，以便與光照前的溶液進行對比。b) 薄層層析取管口平整的毛細管吸取光照后的偶氮苯溶液，在離薄層板邊沿約0.5 cm的起點線上點樣。再用另一毛細管吸取未經(jīng)光照的反式偶氮苯溶液點樣。待乙醇揮發(fā)后，將點好

5、樣品的薄層板放入內(nèi)襯濾紙的展缸中。展缸內(nèi)已放置展開劑（乙酸乙酯/石油醚=1/40）。薄層板的點樣端在下方，浸入展開劑，展開劑不要沒過起點線，也不要碰到樣品點。待展開劑前沿上升到離板的上端約1 cm處時，取出薄層板，立即用鉛筆在展開劑上升的前沿處劃一記號，置于空氣中晾干。可觀察到薄層板上經(jīng)光照后的偶氮苯溶液點樣處上端有兩個黃色斑點（哪一個斑點是順式的？哪一個斑點是反式的？）。計算異構(gòu)體的值。用上述相同的方法，采用Ethyl Acetate : Petroleum Ether = 1:1為展開劑，對靛紅與偶氮苯的混合物進行TLC，為下面的柱層析選擇展開劑。c) 柱層析1 將層析柱固定在鐵架臺上，一

6、定要保持柱子豎直。2 將層析柱洗凈后在柱底部放入一小團脫脂棉花。3 在錐形瓶中稱重7g 硅膠（SiO2），并用Ethyl Acetate : Petroleum Ether (1:40)調(diào)勻。在層析柱的下方放置一個錐形瓶，以收集流下的液體。加入少量洗脫劑于層析柱中，以潤濕棉花，使其貼在柱子下端。4 打開層析柱活塞，控制溶劑下流，將硅膠懸濁液沿柱子側(cè)壁加入，并用少量的溶劑洗去殘余的硅膠，并加入柱中。用裝有橡皮管或塞子由下向上輕輕敲擊柱子外壁，將氣泡趕出，使硅膠填裝均勻。并加壓使硅膠緊密，以獲得較好的分離效果。輕輕敲擊，使硅膠最上層成均勻平面，然后用藥匙沿柱子側(cè)壁，輕輕地、慢慢地在硅膠表面覆蓋一層

7、海砂（注意：不要破壞硅膠的上平面）。關(guān)閉活塞，備用。5 打開活塞，當(dāng)溶劑液面降至海砂表面時，關(guān)閉活塞。用滴管沿柱子側(cè)壁加入靛紅與偶氮苯混合物的溶液（稱取40 mg，置于1.5mL的塑料樣品管，加入1 mL二氯甲烷（CH2Cl2），超聲振蕩使其溶解）。打開活塞，使溶劑液面降至海砂表面，關(guān)閉活塞。再用少量的展開劑洗塑料樣品管，加入層析譜中，并注意洗去粘附在柱壁上的液滴，打開活塞，流到液面，關(guān)閉活塞。重復(fù)上述操作，直到將所有化合物沖到硅膠里面。6 沿側(cè)壁加入大量的洗脫劑Ethyl Acetate : Petroleum Ether (1:40)，打開活塞，加壓保持一定的流速，觀察色帶的形成和分離。7

8、 當(dāng)?shù)谝粋€有色帶到達柱底時，并且沒有流出之前，關(guān)閉活塞，倒空錐形瓶，打開活塞，收集全部色帶。然后，改用Ethyl Acetate : Petroleum Ether (1:1)作為洗脫劑。關(guān)閉活塞，換一個空的且干凈的錐形瓶，打開活塞。當(dāng)?shù)诙€有色帶到達柱底時，并且沒有流出之前，關(guān)閉活塞，倒空錐形瓶，打開活塞，收集全部色帶。柱層析分離結(jié)束。8 柱層析分離結(jié)束后，采用TLC對上述分離的兩個溶液進行分析，總結(jié)分離效果。同時，打開層析柱活塞，在加壓下讓展開劑流干，然后將硅膠倒入指定的固體廢物桶中。切勿倒入水槽或普通垃圾桶。預(yù)習(xí)時的問題1.在薄層層析實驗中，為什么點樣的樣品斑點不可浸入展開劑的溶液中？為

9、什么進行薄層層析時展缸要蓋上蓋？2.當(dāng)用混合物進行薄層層析時，如何判斷各組分的在薄層板上的位置？靛紅與偶氮苯，哪一個的極性較強？為什么？3.柱層析時柱中若留有空氣或者是填裝不均勻，對分離效果有何影響？如何避免？4.偶氮苯和靛紅物理化學(xué)性質(zhì)？毒性？有什么應(yīng)用？偶氮苯光照異構(gòu)化的機理？why is trans-azobenzene more stable than cis-azobenzene?其它閱讀材料1.光化學(xué)由光的作用引起的化學(xué)反應(yīng)近年來日益受到人們的重視，光合作用就是最重要的光化學(xué)反應(yīng)。研究激發(fā)態(tài)分子化學(xué)行為的光化學(xué)反應(yīng)已經(jīng)成為有機化學(xué)的一個重要分支。光不僅可以引起多種多樣的化學(xué)反應(yīng)，合

10、成各種前所未有的奇妙反應(yīng)分子，而且與我們的日常生活及生命現(xiàn)象有著密切的聯(lián)系。2. 薄層色譜1. 固定相的選擇氧化鋁和硅膠是薄層層析色譜常用的固定相。氧化鋁多用于分離堿性或中性有機物；而硅膠的吸附性源于表面的Si-OH基，主要用于分離酸性、中性有機物質(zhì)。薄層色譜用的硅膠有薄層色譜用的硅膠有60G、6OGF254、60H、60HF254和60HF254+366等類型，其中G表示含有13硫酸鈣（作為黏合劑）；H表示不含硫酸鈣；F254表示含有2無機熒光物質(zhì)，在254 nm的紫外光照射下發(fā)出綠色熒光。與硅膠相似，氧化鋁也因含有黏合劑或熒光劑而分為氧化鋁H、氧化鋁G、氧化鋁HF254和氧化鋁GF254等

11、類型。黏合劑除硫酸鈣外，還可用淀粉、羧甲基纖維素（CMC)。2. 操作方法點樣在薄層板一端約1cm處，用鉛筆輕輕劃一條作為起點線。樣品用易揮發(fā)性溶劑溶解后，用毛細管吸取樣品溶液，輕輕接觸到起點線的某一位置上。如果溶液太稀，可多點幾次，但要等第一次樣品溶劑揮發(fā)后，再點第二次。點好樣品后，待溶劑揮發(fā)干凈，才可以進行下面的展開過程。展開劑的選擇選擇展開劑，首先應(yīng)考慮對被分離物有一定的溶解度和解吸能力。由于硅膠和氧化鋁都是極性吸附劑，所以展開劑的極性越大，試樣在薄板上移動的距離越遠，值（值是一個化合物在薄層板上上升的高度與展開劑上升的高度的比值）越大。例如，在分離過程中常發(fā)現(xiàn)太小，說明展開劑極性不夠，

12、需要考慮加入一種極性強的展開劑進行調(diào)控。發(fā)現(xiàn)值太小，說明展開劑極性不夠，需要考慮加入一種極性強的展開劑進行調(diào)控。常用展開劑的洗脫力由小到大的順序為：石油醚、環(huán)己烷、四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、乙醚、四氫呋喃、乙酸乙醋、丙酮、正丁醇、乙醇、甲醇、水、冰乙酸、吡啶、有機酸等。此外，在展開過程中，展開缸內(nèi)展開劑的蒸氣須始終處于飽和狀態(tài)。一般可用一塊方型濾紙貼于缸壁上（下端浸于展開劑中），蓋好密封一段時間。取放薄層板應(yīng)迅速。顯色展開后，要等溶劑揮發(fā)完才能顯色。若被分離的是有色組分，展開板上即呈現(xiàn)出有色斑點。若化合物本身無色，則可以在紫外燈觀察有無熒光斑點；或用碘蒸氣熏的方法顯色。顯色后，用鉛筆輕輕畫出斑

13、點位置，計算值。3柱色譜吸附層析柱的分離效果不僅依賴于吸附劑和洗脫溶劑的選擇，而且與制成的層析柱有關(guān)；要求柱中的吸附劑用量為被分離樣品量的30-40倍，若需要可增至100倍。柱高與直徑之比為4:1至10:1，一般為7.5:1。實驗室常用的層析柱,其直徑在0.5-10 cm之間。當(dāng)吸附物的色帶占吸附劑高度的1/101/4時，此層析柱已經(jīng)可作層析分離了。柱層析常用吸附劑有氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣及活性炭等，吸附劑要求顆粒大小均勻，越細分離效果越佳，但此時洗脫阻力會增大，所以要選擇合適大小的吸附劑。氧化鋁分酸性、中性和堿性三種，本實驗應(yīng)用中性氧化鋁。化合物的吸附能力與它的極性成正比，具有較大極性

14、基團的化合物，其在吸附劑上吸附能力較強。氧化鋁對各化合物的吸附性按以下次序遞減：酸>醇，胺，硫醇>酯，醛，酮>烴>鹵化物，醚>烯>飽和烴。強吸附性的化合物要用強極性溶劑來洗脫。作為洗脫劑的溶劑要求其具有一定極性，適合于被分離物的分離，體積盡量要小，此外要求易揮發(fā)，易除去(乙醚等揮發(fā)性太大的溶劑不合適)。洗脫劑的極性按下列次序遞增：己烷或石油醚<環(huán)己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸。裝柱要求吸附劑必須均勻填充于柱內(nèi)，不能有氣泡和裂縫，否則將影響洗脫和分離。在裝柱時，通常把柱子豎直固定好，關(guān)閉下端活塞，底部用少量脫脂棉輕輕塞緊，加入0.5 cm厚的海砂，然后加入溶劑到柱子體積的1/4，用一定量的溶劑與吸附劑在燒杯中調(diào)成糊狀，打開柱下端的活塞，讓溶