一體化層狀梯度修復(fù)體用于骨軟骨組織工程的實(shí)驗(yàn)研究

1、一體化層狀梯度修復(fù)體用于骨軟骨組織工程的實(shí)驗(yàn)研究         08-06-27 16:55:00     編輯：studa20               作者：白雪東，胡蘊(yùn)玉，嚴(yán)樂(lè)平，任力，吳剛，李丹，孫效棠，白建萍【摘要】  目的探索膠原/殼聚糖/納米磷酸三鈣一體化層狀梯度修復(fù)體在組織工程中用作骨軟骨缺損修復(fù)的可行性。方

2、法以型膠原、殼聚糖、納米磷酸三鈣（TCP）為基本原料，采用無(wú)毒交聯(lián)并通過(guò)冷凍干燥法成型；掃描電鏡觀察，測(cè)定支架材料的孔徑、孔隙率以及交通孔情況；分離擴(kuò)增兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC），將BMSC接種于材料上，掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料上的黏附狀態(tài)，MTT法測(cè)定細(xì)胞在材料上的生長(zhǎng)曲線；以軟骨誘導(dǎo)液體外誘導(dǎo)細(xì)胞支架復(fù)合物向軟骨分化，2周后植入自體股部肌袋，6周取材，HE、甲苯胺藍(lán)染色、型膠原免疫組化鑒定誘導(dǎo)分化效果。結(jié)果材料疏松多孔，孔徑大于100m，孔隙率大于95。細(xì)胞在材料上黏附狀態(tài)良好，并且增殖迅速。BMSC材料復(fù)合體經(jīng)體外三維誘導(dǎo)后可在自體異位向軟骨分化。 結(jié)論型膠原/殼聚糖/納米TCP一體化

3、層狀梯度修復(fù)體具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)和生物相容性，有望成為一種新型的組織工程支架材料用于骨軟骨缺損修復(fù)。 【關(guān)鍵詞】  組織工程； 骨軟骨； 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 膠原； 納米磷酸三鈣    Abstract：ObjectiveTo explore the potential of a novel collagen I / chitosan /Nanotricalcium phosphate(TCP)bilayered scaffold for being used in tissue engineering(TE)of osteochondral repai

4、r.MethodBilayered scaffolds were produced with collagen ,chitosan andTCP,using a special crosslinking and freeze drying method.The pore size,porosity and interpores of the scaffold were observed by scanning electron microscopy(SEM).Rabbit bone mesenchymal stem cells （BMSC）were isolated and amplified

5、,then inoculated onto the scaffold.By SEM scanning,the condition of the cells adhering onto the scaffold was observed.The proliferation of the cells on the scaffolds was examined using MTT method,and the growth curve was drawn.The cellscaffold composite were then induced to differentiate towards car

6、tilage by 3D culturing,and then implanted into muscle pouches 2 weeks later.The result was observed 6 weeks later by HE staining,toluidine blue staining and type collagen immunohistochemistry.ResultThe scaffold possessed high porosity and proper pore size,the porosity was above 95%.BMSC could adhere

7、 onto the scaffold well,and the proliferation rate of the cells on the scaffolds was perfectly good.After in vitro induction,BMSCscaffold composite can differentiate toward cartilage ectopicly.ConclusionThe novel collagen I / chitosan /TCP bilayered scaffold possesses good pore structure and biocomp

8、atibility,and will possibly become a new biomaterial of TE used for osteochondral repair.    Key words：tissue engineering(TE);  osteochondral;  bone mesenchymal stem cells(BMSC);  collagen;  Nanotricalcium    組織工程學(xué)的發(fā)展為軟骨損傷修復(fù)提供了新的方法，可有效地解決移植物來(lái)源以及供區(qū)損傷問(wèn)

9、題，并且移植物可以在體外任意塑形，以適應(yīng)損傷部位的需要1。軟骨缺損的修復(fù)包含2個(gè)主要方面：（1）以功能性修復(fù)組織填充缺損；（2）修復(fù)組織與周圍宿主軟骨和骨的整合2。目前軟骨組織工程中存在的一個(gè)突出問(wèn)題是移植物與宿主組織間缺乏穩(wěn)固的錨定，單純依賴軟骨軟骨界面微弱的連接往往難于達(dá)到滿意的修復(fù)效果3。    為有效解決移植物與宿主組織的整合問(wèn)題，作者研制了一種新型組織工程骨軟骨一體化材料膠原/殼聚糖/TCP一體化層狀梯度修復(fù)體。該材料在結(jié)構(gòu)上分為上層的軟骨部分和下層的軟骨下骨部分，但整個(gè)材料一體化交聯(lián)，避免了軟骨與骨部分在修復(fù)過(guò)程中分離。憑借骨組織之間快速而牢固的整合，

10、有望使整個(gè)修復(fù)體在早期穩(wěn)固地錨定于缺損區(qū)，為關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)提供良好的穩(wěn)定性和機(jī)械支持。    本實(shí)驗(yàn)對(duì)該組織工程骨軟骨一體化修復(fù)體的一般性能以及體外生物相容性進(jìn)行了研究，并且通過(guò)體外誘導(dǎo)以及自體異位實(shí)驗(yàn)初步探討其用于組織工程骨軟骨損傷修復(fù)的可行性。    1  材料和方法    1.1  膠原/殼聚糖/納米TCP一體化層狀梯度修復(fù)體的研制    支架材料由華南理工大學(xué)生物材料研究所研制提供，以型膠原、殼聚糖為基材,與具有良好生物活性的TCP粉體共混交聯(lián)，經(jīng)

11、冷凍干燥成型。上層為膠原/殼聚糖，下層為膠原/殼聚糖/TCP，無(wú)機(jī)粉體含量由下到上呈梯度變化。    1.2   支架材料的形態(tài)和孔隙率    以排水法測(cè)材料的孔隙率，掃描電鏡觀察材料的孔隙大小以及孔隙貫通情況。    1.3   MTT法測(cè)細(xì)胞在支架材料上的增殖活性    取3個(gè)月齡日本大耳白兔，體重2.1 kg，常規(guī)麻醉消毒后自脛骨平臺(tái)下0.5 cm處以18號(hào)穿刺針穿刺，兩側(cè)各抽取骨髓23 ml，小心加入預(yù)裝有等體積percoll工

12、作液（密度1.073）的離心管，以2 000r/min離心25 min后收集有核細(xì)胞層，重懸于含10新生牛血清（GIBCO）的高糖DMEM培養(yǎng)液中，接種于100 ml培養(yǎng)瓶，于37 、體積分?jǐn)?shù)為5 CO2的孵箱中培養(yǎng)。3 d后首次換液，以后每23 d換液，待原代細(xì)胞80%鋪滿瓶底時(shí)傳代。    取第2代細(xì)胞，胰酶消化后制成3.0×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。在48孔板內(nèi)放置20塊同等型號(hào)的材料，以滴注法將細(xì)胞懸液接種于材料，每塊材料150 l；另將5塊材料以單純培養(yǎng)液滴注用做對(duì)照。培養(yǎng)箱內(nèi)靜置4 h后，每孔加入培養(yǎng)液700 l以充分覆蓋材料，18h待細(xì)胞完

13、全貼壁后，將復(fù)合有細(xì)胞的材料轉(zhuǎn)移至新孔，每孔加培養(yǎng)液1.5 ml，以后每2 d給予換液。分別在轉(zhuǎn)孔后第2、4、6、9和12 d隨機(jī)選取3塊復(fù)合細(xì)胞的材料和1塊對(duì)照材料，每孔加入700 l培養(yǎng)液和70 l 5 mg/ml的MTT溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)4 h后吸棄各孔內(nèi)液體，并在各孔加入700 l DMSO，微量振蕩器上振蕩10 min后，每孔吸取150 l液體加入96孔板用作檢測(cè)。選擇492 nm波長(zhǎng)，以對(duì)照孔調(diào)零，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值。以時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，各時(shí)間點(diǎn)MTT均值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。    1.4   掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料上

14、的黏附狀態(tài)    將細(xì)胞懸液以3.0×105個(gè)/ml的密度接種于支架材料，置24孔板內(nèi)培養(yǎng)12 d后以3%的戊二醛固定，梯度酒精脫水，叔丁醇置換，真空干燥，離子噴射儀噴金，掃描電鏡下觀察細(xì)胞在材料表面及內(nèi)部的黏附形態(tài)。    1.5   MSCs在支架材料上的誘導(dǎo)分化    取3個(gè)月齡日本大耳白兔，體重22.5 kg，依上述方法分離擴(kuò)增兔BMSC。取第2代細(xì)胞，消化后配成2×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液在24孔板內(nèi)接種于支架材料，每塊材料150 l，于培養(yǎng)箱內(nèi)靜置4 h后，加2 ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后將材料轉(zhuǎn)移至新孔，并將培養(yǎng)液更換為以高糖DMEM配制的成軟骨誘導(dǎo)液(含rhTGF1 10g/L，地塞米松1×107 mol/L，VitC 50 g/L，新生牛血清100 ml/L)，以后每2 d換液。持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常規(guī)麻醉消毒，分別切開(kāi)股部皮膚、皮下及筋膜，沿肌纖維走行鈍性制造肌袋。左側(cè)植入空白載體為對(duì)照側(cè)；右側(cè)植入經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞-支架復(fù)合體為實(shí)驗(yàn)側(cè)。術(shù)后6周后取材，制成石蠟切片行HE、甲苯胺藍(lán)染