PCR技術(shù)的種類及其應(yīng)用

1、PCR技術(shù)的種類及其應(yīng)用1 PCR 技術(shù)的基本原理PCR技術(shù)是在模板DNA引物和四種dNTP等存在的條件下,依賴于DNA聚合酶(T aq 酶) 的酶促合成反應(yīng)。其具體反應(yīng)分三步 ：變性、退火、聚合。以上三步為一個(gè) 循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物DNA又可以作為下一個(gè)循環(huán)模板，數(shù)小時(shí)后，介于兩個(gè)引 物之間的目的DNA得到了大量的復(fù)制，經(jīng)2530次循環(huán)DN數(shù)量可達(dá)2X1067拷貝數(shù)。2 PCR技術(shù)的種類2.1 反向 PCR( Inverse PCR, IPCR技術(shù)原理：反向PC是克隆已知序列旁側(cè)序列的一種方法.主要原理是用一種在已知序列 中無切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶消化基因組I) NA后酶切片段自身環(huán)化以環(huán)化的

2、DNA 作為模板，用一對(duì)與已知序列兩端特異性結(jié)合的引物，擴(kuò)增夾在中間的未知序列。 該擴(kuò)增產(chǎn)物是線性的DNA片段，大小取決于上述限制性內(nèi)切酶在已知基閑側(cè)翼 DNA 序列內(nèi)部的酶切位點(diǎn)分布情況。用不同的限制性內(nèi)切酶消化，可以得到大小不同的 模板DNA再通過反向PCR獲得未知片段。該方法的不足是：需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA。大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。2.2 錨定 P

3、CR( Anchored PCR, APCR)技術(shù)用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄cDNA3 '末端加上一段已知序列，然后以此序列為引物 結(jié)合位點(diǎn)對(duì)該cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，稱為APCR。應(yīng)用：它可用于擴(kuò)增未知或全知序列，如未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫的構(gòu) 建。2.3 不對(duì)稱 PCR(asymmetric PCR)技術(shù)兩種引物濃度比例相差較大的PCR技術(shù)稱不對(duì)稱PCR在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同的引物 濃度，常用50100T比例。在最初的1015個(gè)循環(huán)中主要產(chǎn)物還是雙鏈DNA,但 當(dāng)?shù)蜐舛纫锉幌谋M后,高濃度引物介導(dǎo)的PCR反應(yīng)就會(huì)產(chǎn)生大量單鏈DNA 應(yīng)用：可制備單鏈 DNA 片段用于序列分析或

4、核酸雜交的探針2.4 反轉(zhuǎn)錄 PCR( reverse transcription, RT- PCF)技術(shù)當(dāng)擴(kuò)增模板為RNA時(shí)，需先通過反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進(jìn)行擴(kuò)增。RT - PC應(yīng)用非常廣泛，無論是分子生物學(xué)還是臨床檢驗(yàn)等都經(jīng)常采用。2.5修飾引物PCR技術(shù)為達(dá)到某些特殊應(yīng)用目的 , 如定向克隆、定點(diǎn)突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析等 , 可在 引物的 5'-端加上酶切位點(diǎn)、突變序列、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子及序列分析結(jié)合位點(diǎn)等。2.6 巢式 PCR(NEST PCR)技術(shù)先用一對(duì)靶序列的外引物擴(kuò)增以提高模板量 , 然后再用一對(duì)內(nèi)引物擴(kuò)增以得到特異 的PCR帶,此為巢式PCR。若用一條外引物作

5、內(nèi)引物則稱之為半巢式 PCR。為減少 巢式PCR的操作步驟可將外引物設(shè)計(jì)得比內(nèi)引物長(zhǎng)些，且用量較少，同時(shí)在第一次 PCR時(shí)采用較高的退火溫度而第二次采用較低的退火溫度，這樣在第一次PCR時(shí)， 由于較高退火溫度下內(nèi)引物不能與模板結(jié)合 , 故只有外引物擴(kuò)增產(chǎn)物 , 經(jīng)過若干次 循環(huán)，待外引物基本消耗盡，無需取出第一次PCR產(chǎn)物，只需降低退火即可直接進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。這不僅減少操作步驟，同時(shí)也降低了交叉污染的機(jī)會(huì)。這種 PCR稱中 途進(jìn)退式PCR( drop-in, drop-out PCR)。上述三種方法主要用于極少量 DNA模板的擴(kuò) 增。2.7 等位基因特異性 PCR( Allele- spec

6、ificPCR, ASPCR)技術(shù)ASPCR依賴于引物3'端的一個(gè)堿基錯(cuò)配，不僅減少多聚酶的延伸效率，而且降低引 物-模板復(fù)合物的熱穩(wěn)定性。這樣有點(diǎn)突變的模板進(jìn)行PC擴(kuò)增后檢測(cè)不到擴(kuò)增產(chǎn)物， 可用于檢測(cè)基因點(diǎn)突變。2.8 單鏈構(gòu)型多態(tài)性 PCR(single- strandconformational polymorphism PCR, SSCPPCR) 技術(shù)SSCP- PCF是根據(jù)形成不同構(gòu)象的等長(zhǎng)DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷 移率變化來檢測(cè)基因變異。在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中，單鏈DN遷移率除與DN長(zhǎng)度有關(guān)外，更主要取決于DN單鏈所形成的空間構(gòu)象，相同長(zhǎng)度的單鏈

7、 DNA因其順序不同或單個(gè)堿基差異所形成的構(gòu)象就會(huì)不同，PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后進(jìn)行單鏈DN礙膠電泳時(shí)，每條單鏈處于一定的位置，靶DN沖若發(fā)生堿基缺失、插入或單 個(gè)堿基置換時(shí) , 就會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)變位 ,從而提示該片段有基因變異存在。2. 9 低嚴(yán)格單鏈特異性引物 PCR (Lowstringencysingle specific primer PCR, LSSP- PCR)技術(shù)LSSP - PCR是建立在PCR基礎(chǔ)上的又一種新型基因突變檢測(cè)技術(shù)。要求是“二高 一低”, 高濃度的單鏈引物 ( 5'- 端/ 3'- 端引物均可 ), 約4. 8Lmol ,高濃度的 Taq 酶 (16Lmo

8、l/ 100ml),低退火溫度(30C),所用的模板必須是純化的DNA片段。在這 種低嚴(yán)格條件下 , 引物與模板間發(fā)生不同程度的錯(cuò)配 , 形成多種大小不同的擴(kuò)增產(chǎn) 物, 經(jīng)電泳分離后形成不同的帶型。 對(duì)同一目的基因而言 , 所形成的帶型是固定的 , 因而稱之為“基因標(biāo)簽”。這是一種檢測(cè)基因突變或進(jìn)行遺傳鑒定的快速敏感方法。2.10 復(fù)合 PCR( multiplex PCR)技術(shù) 在同一反應(yīng)中用多組引物同時(shí)擴(kuò)增幾種基因片段 , 如果基因的某一區(qū)段有缺失 , 則相 應(yīng)的電泳譜上這一區(qū)帶就會(huì)消失。復(fù)合 PCR主要用于同一病原體的分型及同時(shí)檢測(cè) 多種病原體、多個(gè)點(diǎn)突變的分子病的診斷。2.11 重組P

9、CR技術(shù)重組PCR技術(shù)是在兩個(gè)PCR擴(kuò)增體系中，兩對(duì)引物分別由其中之一在其5'-端和3' 端引物上帶上一段互補(bǔ)的序列，混合兩種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)變性和復(fù)性，兩組PCR產(chǎn) 物互補(bǔ)序列發(fā)生粘連，其中一條重組雜合鏈能在PCR條件下發(fā)生聚合延伸反應(yīng)，產(chǎn)生 一個(gè)包含兩個(gè)不同基因的雜合基因。2.12 隨機(jī)引物擴(kuò)增技術(shù) (arbitrary primedPCR, AP- PCR)AP-PCR技術(shù)通過隨意設(shè)計(jì)或選擇一個(gè)非特異性引物,在PCR反應(yīng)體系中，首先在不 嚴(yán)格條件下使引物與模板中許多序列通過錯(cuò)配而復(fù)性。如果在兩條單鏈上相距一定 距離有反向復(fù)性引物存在，則可經(jīng)Taq酶的作用使引物延伸而發(fā)生

10、DNA片段的擴(kuò)增， 經(jīng)一至數(shù)輪不嚴(yán)格條件下的PCR循環(huán)后,再于嚴(yán)格條件下進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng) DNA測(cè)序凝膠電泳分離后，經(jīng)放射性自顯影或熒光顯示即可得到 DNA指紋圖。AP-PCR用于腫瘤的抑制基因、癌基因的分離；菌種、菌株及不同物種的鑒定；遺 傳作圖；不同分化程度或某些不同狀態(tài)下的組織的基因表達(dá)差異等方面的研究。2.13 差示 PCR ( differential PCR, d -PCR)技術(shù)d-PCR可以定量檢測(cè)標(biāo)本靶基因的拷貝數(shù)。它是將目的基因和一個(gè)單拷貝的參照基 因置于一個(gè)試管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳分離后呈兩條區(qū)帶，比較兩條區(qū)帶的豐度，或 在引物 5'- 端標(biāo)記上放射性核素后

11、 , 通過檢測(cè)兩條區(qū)帶放射性強(qiáng)度即可測(cè)出目的基 因的拷貝數(shù)。2.14 定量 PCR( quantitative PCR, qPCR 技術(shù)qPCR技術(shù)是用合成的RN作為內(nèi)標(biāo)來檢測(cè)PCRT增目的mRNA的量,涉及目的mRNA 和內(nèi)標(biāo)用相同的引物共同擴(kuò)增 , 但擴(kuò)增出不同大小片段的產(chǎn)物 ,可容易地電泳 分離。一種內(nèi)標(biāo)可用于定量多種不同目的 mRNA。qPCR可用于研究基因表達(dá)，能提 供特定DNA基因表達(dá)水平的變化，在癌癥、代謝紊亂及自身免疫性疾病的診斷和分 析中很有價(jià)值。2.15 競(jìng)爭(zhēng)性 PCR(competitive PCR, c-PCR)技術(shù)c-PCR技術(shù)是競(jìng)爭(zhēng)cDNA模板與目的cDNA同時(shí)擴(kuò)增

12、，使用同樣的引物，但一經(jīng)擴(kuò)增后, 能從這些目的cDNAi別開來。通常使用突變性競(jìng)爭(zhēng)cDNA模板，其序列與目的cDNAP 列相同 , 不過模板中僅有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)或缺少內(nèi)切位點(diǎn) , 突變性的 cDNA 模板可用 適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶水解，并用分光計(jì)測(cè)定其濃度。cDNA目的序列和競(jìng)爭(zhēng)模板相對(duì)應(yīng)的含 量, 可用溴化乙錠染色 , 電泳膠直接掃描進(jìn)行測(cè)定 , 或摻入放射性同位素標(biāo)記的方法 測(cè)定。競(jìng)爭(zhēng)模板開始時(shí)的濃度是已知的，則cDN用的序列的最初濃度就能測(cè)定。這種 方法能精確測(cè)定mRN中cDNA巴序列,可用于幾個(gè)到10個(gè)細(xì)胞中mRNA的定量。2.16 半定量 PCR(semiquantitative PCR,s

13、q- PCR 技術(shù)sq-PCR不同于c-PCR的是參照物ERCC-2的 PCR產(chǎn)物與目的DNA的PCR產(chǎn)物相似,并 分別在試管中擴(kuò)增。sq- PCR的流程為樣品和內(nèi)參照RNA分別經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然 后樣品cDNA和一系列不同量參照cDNA分別在不同管進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在瓊脂糖 凝膠上電泳拍照 ,光密度計(jì)掃描 , 作出標(biāo)準(zhǔn)曲線 ,通過回歸公式便可定量表達(dá)的基因 量。雖然管與管之間的擴(kuò)增效率難以控制，但由PC擴(kuò)增的所有樣本和參照物在不同 的實(shí)驗(yàn)中差異很小。這種敏感的技術(shù)可用于其他低表達(dá)的基因定量2.17 原位 PCR( in situ PCR)技術(shù)原位PCR綜合了 PCR和原位雜交(In s

14、itu hybridizati on, ISH)的優(yōu)點(diǎn)，是一種在組織 切片或細(xì)胞涂片上原位對(duì)特定的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增,再用特異性的探針原位雜交 檢測(cè)。原位PCR標(biāo)本一般需先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。 細(xì)胞膜 和核膜有一定的通透性,PCRT增所需的各種成分可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi),在原位對(duì)特 定的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由于分子量較大或互相交織，不易透過細(xì)胞膜 向外彌散，故保留在原位。這樣就很容易應(yīng)用ISH將其檢出，同時(shí)還可對(duì)目的DNA序 列的組織細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。2.18 免疫 PCR(immu no PCR)技術(shù)抗原-抗體反應(yīng)與PCR技術(shù)的結(jié)合產(chǎn)生了免疫PCR，是目前

15、為止最為敏感的檢測(cè)方法 理論上可測(cè)到一個(gè)抗原分子的存在。通過用一個(gè)具有對(duì)DNA和抗體雙重結(jié)合活性的 連接分子,使作為標(biāo)記物的DNA分子特異地結(jié)合到Ag- Ab復(fù)合物上，從而形成Ag- Ab- DNA復(fù)合物，附著的DNA標(biāo)記物可用適宜的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。特異性PCR產(chǎn) 物的存在證明DNA標(biāo)記物分子特異地附著于Ag - Ab復(fù)合物上，進(jìn)而證明有Ag存在。 吳自榮等將Ab通過化學(xué)交聯(lián)劑直接連接到分子上構(gòu)建成 Ab-DNA探針，組成免疫 PCR檢測(cè)新模式，具有高度靈敏和特異性。免疫PCR可對(duì)流行性傳染病(如肝炎、 愛滋病等 )進(jìn)行檢測(cè)， 檢測(cè)體液中致癌基因和癌基因表達(dá)的微量蛋白等。2.19 長(zhǎng)片段

16、PCR( long-PCR)技術(shù)長(zhǎng)片段PCR是用高質(zhì)量模板DNA保證其完整性,引物應(yīng)較長(zhǎng)(2134bp),使用高的 退火溫度及錯(cuò)配率更低的酶,將無3'-5'外切酶活性的DNAS合酶和低濃度有3'-5'外 切酶活性的DNA聚合酶組合使用,緩沖體系通過提高Tris的濃度或改用Tricine緩沖 液以增強(qiáng)緩沖能力，并調(diào)高體系的pH。熱循環(huán)參數(shù)總的來說需增加延伸時(shí)間，一般 1kb/ min，同時(shí)采用熱啟動(dòng)。長(zhǎng)片段PCR在限制性片段多態(tài)性及單體型分析、 染色體 基因步移、DNA序列分析及基因突變的鑒定等方面得到應(yīng)用。3 PCR技術(shù)的應(yīng)用3.1 PCR技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用3.

17、1.1 PCR在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用目前，相關(guān)研究人員已經(jīng)利用PCR技術(shù)成功建立了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯、大豆和 玉米的技術(shù)路線，對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆和玉米的檢測(cè)低限分別到達(dá)了1和0.1。3.1.2 PCR在研究植作物生長(zhǎng)發(fā)育方面的作用 植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和衰老都涉及許多基因的時(shí)空順序表達(dá)，因此研究這個(gè)過程中基因表達(dá)的變化是揭示生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理的重要手段。定量RT-PCR是研究植物基因表達(dá)水平變化的一項(xiàng)重要技術(shù)。通過研究不同植物或同意植物不同發(fā)育時(shí)期 的基因表達(dá)水平來揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)理。3.1.3 PCR在作物抗病性基因分析、定位中的應(yīng)用在作物病害研究中，作物抗病性及其機(jī)制研究一直是當(dāng)今作物病理學(xué)和作

18、物抗 病育種中的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)問題。而我們現(xiàn)在已經(jīng)知道作物對(duì)病原物的抗性是由相對(duì)的 基因所控制的，即被廣泛認(rèn)可的基因?qū)蚶碚摗Ｒ虼?，尋找與作物抗病性緊密連 鎖的基因標(biāo)記，即將抗病性基因進(jìn)行定位的研究中具有十分重要的理論意義和實(shí)踐 意義。利用PCR和RAPD技術(shù)能夠找到與抗性緊密連鎖的分子標(biāo)記，并將其進(jìn)行定 位。3.2 PCR技術(shù)在食品科學(xué)中的應(yīng)用PCR技術(shù)在食品科學(xué)中主要用于對(duì)食品中微生物含量的檢測(cè)。應(yīng)用 PCR技術(shù)， 只需數(shù)小時(shí)，就可以用電泳法檢測(cè)出來 O.lmgDNA中僅含數(shù)個(gè)拷貝的模板序列；用 PCR擴(kuò)增細(xì)菌中保守的DNA片段，還可對(duì)那些人工無法培養(yǎng)的微生物進(jìn)行檢測(cè)。3.3 PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用目前，全世界利用PCR技術(shù)診斷感染性疾病每年達(dá)幾千萬人次，可見其巨大的 市場(chǎng)潛力。PCR技術(shù)主要用于腫瘤、遺傳病和感染性疾病的診斷。3.3.1 PCR在腫瘤診斷上的應(yīng)用遺傳學(xué)改變主要是引起癌基因激活和抑癌基因的失活， 使基因發(fā)生突變、 缺失、 增加和易位等而導(dǎo)致了細(xì)胞癌變。PCR不但能有效地檢測(cè)基因的突變、重排、易位 等，而且能準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因表達(dá)量，可據(jù)此進(jìn)行腫瘤早期診斷、鑒別、分型、分期、 治療及預(yù)后