11-16細胞工程復習

1、胞增梭 種形起氨量相定量的第十一章動物細胞培養(yǎng)與表達制備藥用蛋白名詞解釋： 動物細胞培養(yǎng)：是模擬動物體內(nèi)的生理環(huán)境使細胞在體外分裂增殖的一種技術。 原代培養(yǎng)：是指將機體取出的細胞或組織進行培養(yǎng)，在首次傳代前的培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)：是指將原代培養(yǎng)的細胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的過程。天然培養(yǎng)基 : 直接采用取自動物體液或從組織中提取的成分作培養(yǎng)液。 中空纖維：是一種細微的管狀結(jié)構(gòu)，表面在許多海綿狀的多孔結(jié)構(gòu)，類似動物的毛細血 管，內(nèi)腔灌流培養(yǎng)液，外面接種細胞。 細胞株：是指從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由細 殖形成的細胞群，稱細胞株。問答題1 試述動物細胞培養(yǎng)的特點。答：動物細胞比

2、微生物細胞大，無細胞壁。%1 動物細胞倍增時間長，生長緩慢。%1 培養(yǎng)過程需氧量少，對機械攪拌或剪切力敏感。%1 動物細胞間主要以聚集體形式存在。%1 原代細胞一般繁殖 50 代左右即退化死亡。%1 動物細胞對于營養(yǎng)要求更加苛刻，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，一般還 需要血清。%1對于培養(yǎng)環(huán)境極其敏感，包括pH、溶解氧、溫度、剪切力等。%1 細菌、真菌、病毒、支原體均可導致動物細胞培養(yǎng)物的污染。%1 絕大多數(shù)哺乳動物細胞只有貼附在固體或半固體的表面才能生長。2 貼壁培養(yǎng)的動物細胞按形態(tài)可分為幾種類型？答：大致分為四種類型： 成纖維型細胞：與體內(nèi)成纖維細胞形狀相似，細胞大致呈梭形或不

3、規(guī)則形，細胞貼壁后呈長 形，胞質(zhì)外伸出 2-3 個長短不同的突起。起源于中胚層的細胞在體外培養(yǎng)時一般表現(xiàn)為這 式。上皮型細胞：類似上皮細胞的細胞，扁平狀，較為規(guī)則，呈三角形及不規(guī)則扁平的多角形。 源于內(nèi)胚層與外胚層的細胞在體外培養(yǎng)時都可能呈現(xiàn)上皮型。游走型細胞：細胞質(zhì)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，貼附于支持物上分散生 長，一般不連接成片。單核細胞、巨噬細胞及某些腫瘤細胞在體外培養(yǎng)常呈現(xiàn)此種形態(tài)。 多形型細胞：形態(tài)上不規(guī)則，一般分胞體和胞突兩部分，最常見的是指神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細 胞。3 試述動物培養(yǎng)基的種類和各自和特點。 答：天然培養(yǎng)基：有血清、血漿、組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）和

4、水解乳蛋白。 合成培養(yǎng)基：根據(jù)細胞生存所需的物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的，主要成分是 基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)，有利于標準化生產(chǎn)，組分和含 對固定，成本低。但缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要，因此需要補充一無血清培養(yǎng)基：由基礎培養(yǎng)基和添加成分（細胞外基質(zhì)、生長因了、結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)運蛋白、酶抑制劑等）組成，保證了實驗結(jié)果的準確性、可重復性和穩(wěn)定性。減少了細胞污染，簡化了提純和鑒定各種細胞產(chǎn)物的程序，但是無血清培養(yǎng)液中能促進細胞系生長的補加物都是獨特的。不同細胞株，所需補加物也不同。4 培養(yǎng)動物細胞所用滅菌方法有些？各適用于哪些用品“答：物理滅菌法： 紫

5、外線消毒：用于消毒空氣、操作臺面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養(yǎng)器皿，如塑料培 養(yǎng) 皿、培養(yǎng)板等。一般要照射30min 以上，這是常使用的消毒方法之一濕熱滅菌：此方法也稱為高壓蒸汽滅菌，是適用面廣、最有效的一種滅菌方法。主要應用范圍是布類、橡膠制品（如膠塞）、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加熱后不發(fā)生沉淀的無機溶液（如 Hanks 液、 PBS 等）。滅菌條件是 121°C, 30min 過濾除菌：包括兩方面一是用超凈臺對操作空間的空氣除菌；二是用濾膜對培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液（如抗生素、激素、酶液、血清的滅菌。以0. 22 U m 濾膜除菌最 為常用?；鹧鏈缇河糜诓?/p>

6、璃吸管、培養(yǎng)瓶口的滅菌。化學消毒法：70%（或 75%）酒精（衛(wèi)生級）：最常用的化學表面消毒劑, 用于手和一些金屬器械或工作臺面或物體表面的消毒。0. 5%過氧乙酸：是強效消毒劑 ，10 min 即可將芽抱菌殺死。用于各種物品的表面消毒， 用噴撒 和擦拭方式進行。5 試述動物細胞原代培養(yǎng)的方法。答：（一）組織塊原代培養(yǎng)1、處死動物，取材分離2、組織剪碎（ 1mm3）3、沖洗、離心4、接種、培養(yǎng)5、常規(guī)檢查（細胞形態(tài)活力、營養(yǎng)、pH 及污染）（二）細胞原代培養(yǎng)1、取材分離，組織剪碎2、消化液（常用胰酶）消化3、過濾離心分離、計數(shù)4、接種、培養(yǎng)5、常規(guī)檢查6 試述動物細胞傳代培養(yǎng)的方法答：懸浮生長

7、細胞傳代離心法傳代：離心 轉(zhuǎn)/ 分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除 1/2-2/3, 然后用吸管直接吹 打形成細 胞懸液再傳代。半懸浮生長細胞傳代 （Hela 細胞） 此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進 行 傳代。貼壁生長細胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液為 0.25%的胰蛋白酶液。7 培養(yǎng)動物細胞的微載體應具備哪些特點？答：良好的生物相容性，無毒無害；%1 有好的黏附性，一般帶正電荷；%1 大的比表面積，顆粒均勻，孔徑均一；%1 良好的傳質(zhì)性能；%1 強的機械性能；%1 好的熱穩(wěn)定性

8、。8 試微載體培養(yǎng)細胞的步驟。答：選擇合適的微載體類型：比較幾種不同的微載體的細胞貼壁率、細胞容納量、微載體用量、攪動速度等，選擇合適的微載體。%1 浸泡水化及消毒；%1 接種：根據(jù)細胞類型決定接種濃度；%1 培養(yǎng)觀察與細胞記數(shù)；%1 消化與細胞回收：傳代培養(yǎng)或收獲細胞均需使細胞脫離微載體，通常采用酶消化法。%1 細胞收獲：采用分組離心沉降收獲細胞；%1 傳代培養(yǎng)：如果做放大培養(yǎng)，可在細胞脫離微載體后，加入一些新的微載體以增大培養(yǎng)面 積。9多孔微載體具備哪些優(yōu)點？答：易固定化；%1 大的比表面積保證細胞充分的生長空間；%1 細胞免受機械損傷，同時又可以提高攪拌強度和通氣量，強化傳質(zhì)；%1 不僅

9、能培養(yǎng)貼壁細胞，也適合于懸浮細胞的培養(yǎng)；%1 內(nèi)部具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的小孔，因此能使細胞在其內(nèi)部生長，可降低血清用量。10 動物細胞培養(yǎng)的生物反應器應具備哪些特點？答：混合系統(tǒng)設計應能提供均勻、溫和的混合狀態(tài)，剪切力小，保證良好的傳質(zhì)效果；%1 反應器內(nèi)空間利用率高，選用合適的載體系統(tǒng)和材料；%1 能嚴格保證無菌環(huán)境；%1 能精確地控制溫度，酸堿度、溶解氧和二氧化碳濃度等條件；%1 能夠方便、快捷地實現(xiàn)培養(yǎng)液的連續(xù)添加、樣品的采樣和觀察。11 目前動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)主要存在哪些問題？ 答：氨離子：來源一培養(yǎng)基與細胞代謝影響一抑制細胞生長 措施一防止培養(yǎng)基中的 Glu 的自然分解并盡量除 去培養(yǎng)基中的

10、氨乳酸：由糖代謝產(chǎn)生，抑制細胞生長 降低培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度并平衡葡萄糖和 Gin 的比例二氧化碳：細胞產(chǎn)生 CO2 的速率大于通氣去除的速度，由此對細胞產(chǎn)生影響控制通氣，及時去除 CO2 甲基乙二醛：細胞代謝產(chǎn)物，對細胞有潛在的控制培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度 滲透壓：滲透壓的升高有利于抗體的分泌加入滲透保護劑減小高滲對細胞生長的抑制作用載體：采用多孔載體減小對細胞的損傷細胞凋亡：是培養(yǎng)后期細胞死亡的主要原因解決方法：降低細胞營養(yǎng)成分的消耗和代謝毒物的產(chǎn)生，改善培養(yǎng)工藝，原癌基因 (bcl-2) 的導入，參數(shù)控制完善在線監(jiān)控的技術APH- 氨基糖昔磷酸轉(zhuǎn)移酶 DHFR 二氫葉酸還原酶 HPH- 潮霉

11、素 B 磷酸轉(zhuǎn)移酶 TK- 胸腺口密喘核昔激 酶GPRT-黃瞟吟鳥瞟吟磷酸 核糖轉(zhuǎn)移酶12 動物轉(zhuǎn)染 (轉(zhuǎn)基因 )細胞篩選中常用的選擇性標記基因有哪些 ? 答：遺傳標記編碼產(chǎn)物 篩選藥物 作用機理G418APH 滅活 G418氨甲喋吟DHFR 變體抗氨甲喋吟潮霉素 BHPH 滅活潮霉素B氨基喋吟TK 合成 TMP氨甲喋吟HGPRT 合成 GMP13 試述動物細胞活力測定的方法。 答：臺盼藍法測定活力活細胞不被染色，死細胞染成藍色，用活細胞占細胞中的百分比表不細胞活力 的同時可完成計數(shù)。MTT 法 (四卩坐鹽 (MTT) 商品名為糜卩坐藍 ) 四吐鹽比色法的原理：活細胞中脫氫酶能將四卩坐鹽還原成

12、不溶干水的藍紫色產(chǎn)物(formazan),并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞磯(DMSO)能溶解沉積在 細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的 formazan 量成正比。再用酶標儀測定 OD 值。 測定細胞相對活力。MTT 法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒牲試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。14 如何進行動物細胞的凍存與復蘇？ 答：凍存方法1) 預先配制凍存液：含 10%20%血清的培養(yǎng)基 +10% DMSO 或甘油2) 取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化 (或離心 )后，加入適量凍存液，制成細胞懸液(1X10 6- 5 XIO* 5 細胞 /ml)3) 加入 lml 懸液于凍存

13、管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。4) 冷凍 復蘇方法(1) 從液氮中取岀冷凍管，迅速投入 37-38 C水浴中，使其融化(1分鐘左右)。(2) 5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。(3) 低速 (800-1000rpm) 離心 10 分鐘。(4) 去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞。每日觀察細胞生長情況，若死細胞較多, 次日應換液。第十二章雜交瘤技術與單克隆抗體名詞解釋：雜交瘤技術 : 將骨髓瘤細胞與免疫的動物脾細胞融合得到即能夠分泌抗體又能在體外長期繁殖的雜交瘤細胞，經(jīng)過克隆化培養(yǎng)得到可以分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞，這種技術通稱為雜交瘤技術。單克隆抗體：經(jīng)過免疫的哺乳類動物單

14、一的 B 淋巴細胞可以分泌單一性抗體，這種具有 特異性 的、同質(zhì)性的抗體為單克隆抗體。? HAT培養(yǎng)基：H:次黃口票吟(hypoxa nth in e), A:氨甲蝶吟(ami nopteri n,) T:胸腺口密 喘核昔 (thymidine) 取三者第一個字母稱為 HAT 培養(yǎng)基。問答題1 試述用雜交瘤技術制備單克隆抗體的過程。答：細胞融合將骨髓瘤細胞與脾細胞按 1： 10 或 1： 5 的比例混合在一起，在 37°C 水浴中邊搖邊加 50% PEG, 用不含血清培養(yǎng)液終止融合，離心沉淀細胞。雜交瘤篩選細胞液用 HAT 培養(yǎng)基懸浮，加入到含飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)板，3TC、 5%CO2

15、培養(yǎng)，每 3-4d 更 換HAT 培養(yǎng)基。15d 后改用 HT 培養(yǎng)液維持培養(yǎng)三周改用一般培養(yǎng)液8-12d 進彳丁抗體檢測2 試述 HAT 培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞的原理與過程。答：原理： 融合所用的瘤細胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的HGPRT /TK- 細胞株，在 HAT 培養(yǎng)中不能合成DNA?融合所用的脾細胞是 HCPRT+ 和 TK+ 細胞株，能通過補救途徑合成 DNA, 但不能長期生存。 只 有融合細胞具有親代雙方的遺傳性能，可在 HAT 培養(yǎng)基中通過補救途徑合成 DNA ，又 能長期 存活與繁殖。過程：正常途徑：糖、氨基酸 一? 核昔酸 ? DNA, 可以被氨基蝶吟阻斷補救途徑核昔酸前體一亥昔酸

16、一 ? DNA, 需要次黃瞟吟鳥瞟吟磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT ）和 胸腺口密噪 核昔激酶 （TK ）兩種酶的參與。3 試述人源性單克隆抗體的種類及各自的特點。 答：人一鼠雜交瘤單克隆抗體：融合方法基本與鼠一鼠雜交瘤相同。親本骨髓瘤細胞是小鼠 骨 髓瘤細胞，親本 B 細胞則來源于人外周血淋巴細胞、淋巴結(jié)細胞、脾細胞。但是，人一鼠雜交瘤的人單克隆抗體分泌性能很不穩(wěn)定，多數(shù)情況下雜交瘤會很快失去抗體分泌能力。人一人雜交瘤單克隆抗體 : 可通過建立人骨髓瘤或其他人細胞系與人淋巴細胞融合來制備人單克隆抗體。人源性融合親本細胞需具有較高的融合率、產(chǎn)生的雜交瘤核型穩(wěn)定并能產(chǎn)生一定量的具有特異性的抗體等特征

17、。人一人雜交瘤核型穩(wěn)定，然而遺憾的是可供利用的人類骨髓瘤細胞種類非常有限。嚴重免疫缺陷小鼠制備人源化單克隆抗體：將人免疫干細胞移植到 SCID （聯(lián)合免疫缺陷） 小 鼠體內(nèi)， SCID 小鼠實際上獲得了人的免疫系統(tǒng)?；蚬こ虇慰寺】贵w：基因工程抗體是通過分子技術獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當 載 體重組后引入不同表達系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體。可以獲得完全人源化抗體。第十三章體外受精與核移植動物名詞解釋：胚胎工程 : 是指對動物早期胚胎或配子進行的工程技術操作，獲得所需要的成體動物的技術。 體外受精：哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術。胚胎移植：是指將發(fā)育到一定階段的胚胎移

18、植到與供體同時發(fā)情排卵、但未經(jīng)配種的“受 體”母畜輸卵管或了宮的技術。 試管嬰兒：是指卵子與精子在體外受精，培養(yǎng)發(fā)育成早期胚胎，再植回受體子宮內(nèi)發(fā)育出 生的 嬰兒。核移植動物：又稱克隆動物 : 用特定發(fā)育階段的核受體體外構(gòu)建重組胚，通過胚胎移植到受體完成發(fā)育出生的動物。包括胚胎細胞克隆動物和體細胞克隆動物。胚胎融合：又叫胚胎嵌合，是將兩枚或兩枚以上的胚胎（同種或異種動物）的部分或全部細胞融合在一起，使之發(fā)育成一個胚胎，然后移植到受體母畜體內(nèi)讓其繼續(xù)發(fā)育形成一種嵌合體后代的技術。第三代試管嬰兒：通過種植前遺傳學診斷 （PGD） 技術培育出的試管嬰兒將被稱為第三代 試 管嬰兒。問答題1 試述體外受精動物培育的步驟答：精子采集與體外獲能、卵子采集與成熟培養(yǎng)；%1 體外受精；%1 重組胚激活與體外培養(yǎng)；%1 胚胎移植；%1 體內(nèi)發(fā)育、出生。2試述試管嬰兒的培育流程。答：女方超排卵與取卵 精子采集與體外獲能處理 體外受精 受精卵體