產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素及其疫苗研究進(jìn)展.docx

1、產(chǎn)氣莢膜梭毒素及其疫苗研究進(jìn)展王光華】，黃生蓮2,周繼章1,邱昌慶（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部草食動(dòng)物疫病重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室甘肅蘭州730046,2.青海省大通縣朔北獸醫(yī)站，青海大通810100）摘要：產(chǎn)氣莢膜梭菌病是由產(chǎn)氣英膜梭菌引起的一種重要的人善共患傳染病，可導(dǎo)致山羊、綿羊等動(dòng)物的腸毒血癥或壞死性腸炎，并且可引起動(dòng)物腦、心、肺和腎組織的水腫。B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)生的e毒素是引起動(dòng)物上述病理變化和死亡的重要因素之一。雖然甲醛滅活的毒素疫苗能對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生保護(hù)性抗體，但是，滅活苗潛在的安全性原因使其在應(yīng)用上受到限制。因此，基于E毒素基因的重組疫苗和弱

2、毒疫苗就成為人們研究的目標(biāo)。關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌；&毒素；疫苗中圖分類(lèi)號(hào)：S852.616.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào):1007-5038（2009）05-0073-03產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridiumperfringens）,也稱(chēng)魏氏梭菌（Clostridiumzvelchii）,是一種廣泛分布于自然界和動(dòng)物腸道中的條件性致病菌。根據(jù)細(xì)菌產(chǎn)生外毒素（主要為a、B、c）的種類(lèi)差別，可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分成A、B、C、D、E5型。毒素的編碼基因etx位于質(zhì)粒上，etx基因編碼的蛋白&毒素前體在分泌初期是無(wú)毒性的，通過(guò)蛋白酶去除毒素前體N端的13個(gè)氨基酸和C端22個(gè)氨基酸后成為有活性的成熟肽，成熟肽

3、分子質(zhì)量為32ku0e毒素為B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生，是D型菌的主要致病因子，可導(dǎo)致山羊、綿羊等動(dòng)物的致死性腸道疾病,對(duì)畜牧業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。由于B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌不是從人類(lèi)分離的病原體，因此作毒素對(duì)人類(lèi)或靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的危害還不是很清楚，當(dāng)前的疫苗研究只能以反芻動(dòng)物和嚙齒類(lèi)動(dòng)物為研究對(duì)象。1 毒素引起的臨床癥狀Uzal和Finnie已將產(chǎn)氣莢膜梭菌e毒素對(duì)綿羊和山羊產(chǎn)生的臨床和神經(jīng)學(xué)上的癥狀做了詳細(xì)的闡述。一般而言，綿羊感染D型產(chǎn)氣莢膜梭菌后會(huì)發(fā)生突然死亡，有時(shí)并不表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀家和胃腸炎并發(fā)癥，而山羊感染后會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的小腸結(jié)腸炎或慢性消耗性癥狀，往往預(yù)后不良。嚙齒類(lèi)動(dòng)物現(xiàn)已作為用于e

4、毒素產(chǎn)生神經(jīng)病理性損害的研究模型。用&毒素注射小鼠后，臨床上表現(xiàn)為癲癇、過(guò)度興奮或抑郁并伴有輕微的腸氣，剖檢可發(fā)現(xiàn)腦水腫，組織學(xué)上出現(xiàn)多病灶性的急性腎小管壞死以及肺水腫。該毒素是致死性毒素，給小鼠靜脈注射納克級(jí)的e毒素，在30min內(nèi)即可引起小鼠死亡，并且其毒力僅次于肉毒素和破傷風(fēng)毒素。將毒素用生理鹽水稀釋后注入小鼠的胃和結(jié)扎的腸段中，比較后發(fā)現(xiàn)，除胃部以外小腸和大腸都能吸收該毒素，并且發(fā)現(xiàn)從結(jié)腸吸收毒素后的致死率高于從小腸吸收后的致死率，可見(jiàn)&毒素能在小鼠的任意腸段吸收。動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)任毒素發(fā)揮作用時(shí)首先可以使大腦、腎臟和小腸中的血管通透性增高，多種組織器官發(fā)生充血和水腫，死于腸毒血癥的羔羊也

5、可發(fā)生腎臟壞死區(qū)。這種毒素可以通過(guò)血腦屏障在大腦中蓄積，從而提高了腦血管通透性并導(dǎo)致外周血管水腫，所以，中毒后發(fā)生腸毒血癥的動(dòng)物末期會(huì)有一些神經(jīng)癥狀，如角弓反張、驚厥、瀕死期掙扎等口。雖然,A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌（不產(chǎn)e毒素）感染人以后能引起胃腸疾病，但是至今還沒(méi)有&毒素對(duì)人和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物致病的報(bào)道。從小動(dòng)物試驗(yàn)中推測(cè)，e毒素靜脈注射人體的致死劑量約為100ng/kgC10氣溶膠或口服方式對(duì)人的致死劑量主要取決于人體呼吸道和胃腸道與毒素的相互作用，而這方面國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)研究報(bào)道。2 e毒素的生物學(xué)特點(diǎn)收稿日期:200902-23基金項(xiàng)目:國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專(zhuān)項(xiàng)（2008FY210200）作者簡(jiǎn)介：

6、王光華（1978），男（蒙古族），青海大通人.博士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病分子免疫學(xué)研完。*通訊作者E毒素前體在分泌初期是無(wú)毒性的，通過(guò)蛋白酶去除毒素前體N端的13個(gè)氨基酸和C端22個(gè)氨基酸后成為有活性的成熟肽，參與活化的蛋白酶包括產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的人蛋白酶和消化性蛋白酶如胰蛋白酶、a胰凝乳蛋白酶。這種通過(guò)切除N、C末端兩段序列且還有菌體自身蛋白參與的活化過(guò)程較為少見(jiàn)。MiyataS等口日證明，去除C末端賽基酸殘基是活化作用的關(guān)鍵，而且不同的酶切產(chǎn)生的毒素的N、C末端及其活性也不相同。其中以胰蛋白酶加胰凝乳蛋白酶活化的毒素毒力最強(qiáng)，而N末端氨基酸殘基去除與否對(duì)毒素活性基本沒(méi)有影響。惟有C末端

7、的切除位點(diǎn)對(duì)毒素活性，包括在神經(jīng)突觸膜上形成七聚體的能力有影響。去除C末端氨基酸殘基后的成熟毒素其毒性是毒素前體的1000倍。目前對(duì)e毒素的作用模型還不十分明確，但基本上認(rèn)定其是一種成孔毒素，對(duì)犬腎細(xì)胞（MDCK）具有致死作用；可以在其細(xì)胞膜上形成一種復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞并導(dǎo)致胞內(nèi)K+外流；與細(xì)胞膜形成的復(fù)合物不會(huì)被SDS解離；晶體結(jié)構(gòu)顯示其主要由p片層構(gòu)成;這些都是成孔毒素的主要結(jié)構(gòu)特點(diǎn)C12-13OPetitL等I試驗(yàn)證明任毒素在與大鼠突觸小體和MDCK膜上的受體結(jié)合后可形成七聚體復(fù)合物，該復(fù)合物并不能被細(xì)胞內(nèi)吞入細(xì)胞中，而是在細(xì)胞膜表面形成一個(gè)大的孔隙，并導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變，使得大量（約90

8、%）的K離子外溢，Na離子和C1離子濃度大幅增高，Ca離子濃度稍微增高，一些有害的物質(zhì)，如碘化丙錠進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。該毒素的靶位是細(xì)胞膜上具有抗去污劑性質(zhì)的結(jié)構(gòu)域（DMRs）,這種結(jié)構(gòu)域與毒素形成七聚體的能力要強(qiáng)于它與其它成分的作用，所以e毒素的受體主要存在于DMRs上，毒素與之結(jié)合后會(huì)誘發(fā)形成毒素七聚體，毒素從與受體結(jié)合到在細(xì)胞膜上成孔的過(guò)程都在同一個(gè)DMRs中完成，而形成七聚體的過(guò)程是毒素發(fā)揮作用的前提C15-163o此外，亞致死量或致死量的a或0毒素與e毒素同時(shí)注射小鼠后的死亡時(shí)間比單獨(dú)注射e毒素的時(shí)間短，表明a和。都具有增強(qiáng)毒素對(duì)腸毒血癥宿主的致死效果成，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

9、E毒素與宿主細(xì)胞表面的作用機(jī)制還不是很清楚，但是現(xiàn)已證明它可以識(shí)別小鼠腦細(xì)胞和突觸小體膜上的唾液糖蛋白受體。目前只有兩種細(xì)胞系對(duì)e毒素敏感，分別為MDCK和人成平滑肌瘤G402細(xì)胞,據(jù)推測(cè)這與這兩種細(xì)胞表面存在有效結(jié)合毒素的受體有關(guān)。3 毒素的免疫和疫苗目前，家畜用產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活苗的免疫效果不一，如果能掌握D型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生致死毒素的特征以及培養(yǎng)上清中毒素的致死效果，則有可能提高此類(lèi)疫苗的效果。SayeedS等口刃研究了D型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清中的e毒素水平與小鼠致死率的關(guān)系，隨后用&毒素的單克隆抗體證明D型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清中的&毒素就是引起小鼠死亡的主要毒素。對(duì)于類(lèi)毒素疫苗在反芻類(lèi)和

10、嚙齒類(lèi)動(dòng)物上的免疫效果主要用其產(chǎn)生的抗體評(píng)價(jià)。用小鼠單克隆抗體已經(jīng)確定出在&毒素上至少有兩個(gè)中和表位，并且這些抗原表位和抗體的作用機(jī)制已經(jīng)研究的比較清楚。Pitit等證明抗e毒素多克隆抗體或單克隆抗體能夠在體外阻止毒素在MDCK細(xì)胞膜上形成七聚體，表明抗體能阻止毒素對(duì)組織的破壞。滅活疫苗在反芻動(dòng)物上的有效性還有質(zhì)疑，但已經(jīng)廣泛應(yīng)用于綿羊和山羊2。】。用于人類(lèi)和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的e毒素甲醛滅活苗至今還未見(jiàn)報(bào)道，因此，有必要開(kāi)發(fā)一種既能用于人類(lèi)又能用于動(dòng)物的e毒素重組、減毒苗。目前已有很多這方面的報(bào)道，如對(duì)已經(jīng)確定的對(duì)小鼠有致死活性的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行化學(xué)修飾,這些氨基酸殘基包括組氨酸、色氨酸和酪氨酸。

11、根據(jù)這些研究結(jié)果，OystenPC等小對(duì)e毒素毒性起關(guān)鍵作用的組氨酸、色氨酸等氨基酸殘基進(jìn)行定向突變，共得到10個(gè)突變體,其中只有一個(gè)突變體H106P,靜脈注射小鼠后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)毒性。這很可能是由于脯氨酸的替換改變了毒素蛋白的三級(jí)構(gòu)象,從而影響了蛋白的活性位點(diǎn)，因?yàn)樵谙嗤奈稽c(diǎn)用絲氨酸替換后毒素蛋白仍然保持生物學(xué)活性七由此可見(jiàn)，要想獲得更加有效的e毒素位點(diǎn)突變體作為候選疫苗，必須更加全面研究e毒素分子的結(jié)構(gòu)和功能。4結(jié)語(yǔ)針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌e毒素在人類(lèi)和動(dòng)物上潛在的危害，以及世界范圍內(nèi)生物恐怖襲擊的威脅促使科學(xué)家們加快對(duì)該毒素的疫苗研制。科學(xué)的疫苗研制應(yīng)從以下兩個(gè)方面去研究：第一，發(fā)展重組、減毒（或完

12、全無(wú)毒）的疫苗。雖然e毒素的類(lèi)毒素疫苗在動(dòng)物上具有保護(hù)作用，但是出于安全性考慮這種疫苗不太可能適用于人類(lèi)。因此將來(lái)的疫苗研究必須基于對(duì)毒素結(jié)構(gòu)和分子功能的完全理解。第二，必須重視研究毒素與呼吸道和胃腸道表面的相互作用關(guān)系。因?yàn)楫a(chǎn)氣莢膜梭菌e毒素有可能作為恐怖襲擊的生物武器以氣溶膠或食品的方式散布。毒素分子基本上是通過(guò)以上兩種方式引起機(jī)體發(fā)病，而目前對(duì)這兩方面研究的還不是很清楚，這主要表現(xiàn)為:與毒素分子結(jié)合的細(xì)胞表面受體研究；毒素與黏膜表面細(xì)胞的相互作用；黏膜免疫在防止毒素吸收中的作用。相信隨著對(duì)上述兩個(gè)方面的研究，在不久的將來(lái)一定能研制出針對(duì)各種毒素的安全疫苗，從而造福于人類(lèi)和動(dòng)物。參考文獻(xiàn)：

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