體外循環(huán)致先天性心臟病手術(shù)患者血液細(xì)胞因子水平的變化

1、體外循環(huán)致先天性心臟病手術(shù)患者血液細(xì)胞因子水平的變化【摘要】目的探討體外循環(huán)對(duì)先天性心臟病手術(shù)患者外周血細(xì)胞因子水平的影響。方法以先天性心臟病手術(shù)患者為研究對(duì)象，不需體外循環(huán)的心血管手術(shù)患者作為對(duì)照，酶聯(lián)免疫吸附法和生物活性法測(cè)定手術(shù)前、中、后多時(shí)間點(diǎn)外周血中細(xì)胞因子水平。結(jié)果二組患者術(shù)中和或術(shù)后白細(xì)胞介素-2明顯降低(P0.05)；可溶性白細(xì)胞介素-2受體、白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-和白細(xì)胞介素-10明顯升高(P0.05)。結(jié)論手術(shù)應(yīng)激和體外循環(huán)均是引起先天性心臟病患者術(shù)中和或術(shù)后細(xì)胞因子水平改變的主要因素?！娟P(guān)鍵詞】先天性心臟病體外循環(huán)細(xì)胞因子The Changes of Cytoki

2、nes Levels Related to Cardiopulmonary Bypass in Patients Undergoing Surgery for Congenital Heart Defects【Abstract】ObjectiveTo examine the effect of cardiopulmonary bypass(CPB) on cytokines levels of peripheral blood in patients undergoing surgery for congenital heart defects.MethodsThe possible diff

3、erences between patients undergoing surgery for congenital heart defects(CPB group, n=10) and those receiving closure of patent ductus arteriosus or pericardiectomy(no-CPB group, n=9) were evaluated. Venous blood levels of interleukin-2(IL-2),soluble interleukin-2 receptor(sIL-2R),interleukin-6(IL-6

4、),tumor necrosis factor-(TNF-), and interleukin-10(IL-10) were measured by means of biological activity assay or enzyme-linked immunosorbent assays at multiple time points before, during, and after operation.ResultsAs compaired with pre-operative values, IL-2 levels decreased significantly in both g

5、roups (P0.05), and the levels of sIL-2R, IL-6, TNF-, IL-10 increased significantly in both groups at multiple time points after operation(P0.01). Although there were no pre-operative differences in these cytokines between the two groups(P0.05), the post-operative changes of cytokines in CPB group wa

6、s more obvious than that in no-CPB group(P0.01). There also was a preceding IL-10 peak value, as compared with the peak values of IL-6 and TNF- in CPB group.ConclusionThe results suggest that besides surgical stress mediated cytokines respones, CPB itself also results in obvious changes of cytokines

7、 metabolism.【Key words】Congenital heart defectsCardiopulmonary bypassCytokines體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass, CPB)心臟手術(shù)所致的全身炎癥反應(yīng)(systemic inflammatory response)和術(shù)后并發(fā)癥的關(guān)系是值得關(guān)注的問(wèn)題。全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展與多種細(xì)胞因子有關(guān)。為探討CPB對(duì)先天性心臟病手術(shù)患者外周血細(xì)胞因子水平的影響，我們測(cè)定了CPB手術(shù)和非CPB心血管手術(shù)患者術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后外周血細(xì)胞因子(cytokines)水平。1臨床資料與方法患者臨床資料(表1)。麻醉誘導(dǎo)

8、后氣管插管、機(jī)械通氣、靜脈復(fù)合麻醉。 表1二組患者臨床資料組別例數(shù)年齡(歲)心功能(NYHA)手術(shù)男女ASD修補(bǔ)VSD修補(bǔ)PDA結(jié)扎心包剝離CPB組3716.4 7.61973非CPB組4519.617.02763注：ASD：房間隔缺損；VSD：室間隔缺損；PDA：動(dòng)脈導(dǎo)管未閉CPB組患者常規(guī)晶體液預(yù)沖，經(jīng)升主動(dòng)脈和右心房插管，鼓泡式氧合器及轉(zhuǎn)動(dòng)泵進(jìn)行CPB；非CPB組患者經(jīng)左胸或胸骨正中切口施行手術(shù)。無(wú)菌條件下抽取外周靜脈血5ml，其中肝素抗凝血3ml、非抗凝血2ml。測(cè)定指標(biāo)為：白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、可溶性白細(xì)胞介素-2受體(soluble interle

9、uk-2 receptor, sIL-2R)、 白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-(tumor necrosis factor-，TNF-)和白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)。抗凝血常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞，用Hanks液洗滌2次，無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌1次，用5%小牛血清-RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)制成2106ml細(xì)胞懸液，取1ml于康氏管中加入植物血凝素(PHA，200gml)、37、5%CO2條件下培養(yǎng)48小時(shí)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，IL-2依賴(lài)性生長(zhǎng)的TLL細(xì)胞株用5%小牛血清-RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)制成1105ml細(xì)胞

10、懸液，在96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中加入CTLL細(xì)胞株懸液100l孔，培養(yǎng)上清液100l孔，每份樣品作三復(fù)孔，同時(shí)作不同稀釋度的重組人白細(xì)胞介素-2(rHIL-2)標(biāo)準(zhǔn)品和培養(yǎng)液對(duì)照，37、5%CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)。終止培養(yǎng)前6小時(shí)離心，去上清110l孔，加入噻唑籃(MTT)10l孔，37、3小時(shí)測(cè)OD570nm和OD630nm值，每孔OD值OD570nmOD630nm。 包被緩沖液稀釋單抗至5gml，加入酶標(biāo)板，每孔100l過(guò)夜；封閉液200l孔，37、2小時(shí)、洗滌2次；加樣品稀釋液100l孔、依次加入空白對(duì)照，用樣品稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品(白求恩醫(yī)科大學(xué)免疫室)成1600uml，800uml，40

11、0uml，100uml及待測(cè)樣品50l，每份作復(fù)孔、混勻、37、2小時(shí)、棄之、洗滌3次；各孔加入100l兔抗IL-2R-多克隆抗體血清(140)、37、2小時(shí)、洗滌3次，每次5分鐘；各孔加入100l酶標(biāo)驢抗兔抗體(114)、37、2小時(shí)、洗滌3次，每次5分鐘；各孔加入100l鄰苯二胺(OPD)底物溶液，室溫避光反應(yīng)10分鐘，加入50l終止液(2M H2SO4)，即刻用酶標(biāo)儀(華東電子管廠)測(cè)OD值490nm值；以sIL-2R單位為橫座標(biāo)，不同稀釋度OD值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；用樣品與空白對(duì)照的OD差值在曲線上查找sIL-2R含量。收集非抗凝血血清，20保存。將標(biāo)本從冰箱中取出，平衡至室溫，將板

12、條(已用抗-IL-6、IL-10、TNF-單抗預(yù)包被)取出，加入標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Genzyme公司)稀釋液100l，加入樣品和不同稀釋度(IL-6和IL-10：2000pgml、1000pgml、500pgml、250pgml、125pgml、60.5pgml、30.25pgml、0pgml；TNF-：1200pgml、600pgml、300pgml、150pgml、75pgml、37.5pgml、0 pgml)標(biāo)準(zhǔn)品各100l至相應(yīng)孔中，37、60分鐘；加入生物素標(biāo)記的二抗100l孔，37、60分鐘；加入酶聯(lián)物100l孔，37、20分鐘；加入底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)100l，避光37、15分鐘

13、，加入終止液(2N H2SO4)1滴，在450nm處讀數(shù)。標(biāo)本采集時(shí)間為：(1)術(shù)前1天；(2)CPB轉(zhuǎn)流前；(3)CPB停機(jī)后；(4)術(shù)后1天；(5)術(shù)后3天；(6)術(shù)后7天。非CPB組患者無(wú)第(2)時(shí)間點(diǎn)標(biāo)本采集，而第(3)時(shí)間點(diǎn)標(biāo)本在關(guān)胸后采集。資料使用“中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書(shū)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)”軟件包(第2版)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以s表示，采用析因試驗(yàn)的方差分析，被認(rèn)為差異具有顯著性意義(P0.05)。2結(jié)果二組患者細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。2.1IL-2表2二組患者細(xì)胞因子水平的變化檢測(cè)時(shí)間IL-2(IUml)sIL-2R(Uml)IL-6(pgml)TNF-(pgml)IL-10(pgml)ABA

14、BABABAB術(shù)前19.44.419.64.5299.094.2322.090.212.56.411.94.719.08.922.38.567.119.464.820.1轉(zhuǎn)流前14.25.3*-478.067.5*-38.07.5*-29.19.4*-179.145.0*-停機(jī)后術(shù)畢11.22.0*15.73.7*873.084.2*497.839.3*47.011.3*29.45.6*32.08.8*30.37.1545.173.6*129.643.6*術(shù)后1天13.52.2*13.83.2*592.0103.9*584.439.1*77.116.0*34.07.5*44.59.2*34.4

15、6.0*297.547.6*162.03.0*術(shù)后3天15.83.0*15.23.0*478.090.0*497.861.8*39.812.7*18.45.029.78.1*28.27.0170.943.4*115.822.0*術(shù)后7天18.63.317.44.5297.090.1356.763.616.35.19.63.520.57.921.18.757.813.565.818.6注：A為CPB組，B為非CPB組；*與術(shù)前比較P0.05；*與術(shù)前比較P0.01 二組患者術(shù)后IL-2水平均明顯降低(P0.05)，術(shù)后第7天仍低于術(shù)前值，但無(wú)差異(P0.05)；二組患者術(shù)前IL-2水平無(wú)差異(P

16、0.05)，但CPB停機(jī)術(shù)畢，CPB組患者IL-2水平降低更為明顯(P0.01)。2.2sIL-2R二組患者術(shù)后sIL-2R水平均明顯升高(P0.01)，術(shù)后第7天均回復(fù)至術(shù)前水平；二組患者術(shù)前sIL-2R水平無(wú)差異(P0.05)，但CPB停機(jī)術(shù)畢，CPB組患者sIL-2R水平升高更為明顯(P0.01)。2.3IL-6二組患者術(shù)后IL-6水平均明顯升高(P0.01)，術(shù)后第7天CPB組患者IL-6值仍高于術(shù)前，但無(wú)差異(P0.05)；二組患者術(shù)前IL-6水平無(wú)差異(P0.05)，但在CPB停機(jī)術(shù)畢，術(shù)后1天，術(shù)后3天CPB組患者IL-6水平升高更為明顯(P0.01)。2.4TNF-二組患者術(shù)后

17、TNF-水平均明顯升高(P0.05)，但術(shù)后第7天均回復(fù)到術(shù)前水平；二組患者術(shù)前TNF-水平無(wú)差異(P0.05)，但術(shù)后第1天CPB組患者TNF-水平升高更為明顯(P0.01)。2.5IL-10二組患者術(shù)后IL-10水平均明顯升高(P0.01)，術(shù)后第7天回復(fù)到術(shù)前水平；二組患者術(shù)前IL-10水平無(wú)差異(P0.05)，但在CPB停機(jī)術(shù)畢，術(shù)后1天，術(shù)后3天CPB組患者IL-10水平升高更為明顯(P0.01)。3討論近年雖然CPB手術(shù)的安全性已有明顯提高，但如何防止再灌注損傷的問(wèn)題尚未解決1。CPB所致全身炎癥反應(yīng)過(guò)程中釋放的多種細(xì)胞因子可激活內(nèi)皮細(xì)胞，增加粘附分子表達(dá)，促使內(nèi)皮細(xì)胞與活化中性粒

18、細(xì)胞之間粘附和作用，引起CPB心臟手術(shù)后多種并發(fā)癥23。我們的結(jié)果顯示：CPB和非CPB心臟手術(shù)均可引起患者術(shù)后IL-2明顯降低，sIL-2R、IL-6、TNF-和IL-10明顯升高。盡管術(shù)前這些細(xì)胞因子的水平在二組患者之間無(wú)差異，但術(shù)后CPB組患者細(xì)胞因子的變化更為明顯。IL-2是參與機(jī)體免疫防御的重要細(xì)胞因子。IL-2促進(jìn)T細(xì)胞成熟，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞功能，加速免疫球蛋白分泌4。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均報(bào)道CPB心臟手術(shù)可損傷細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，抑制IL-2釋放57。這種損傷可能與患者術(shù)前心功能、CPB時(shí)間和輸血有關(guān)56。Markewitz7提出：CPB對(duì)細(xì)胞免疫的損傷是由于前向免疫調(diào)節(jié)抑制和免疫反應(yīng)下

19、調(diào)；前者表現(xiàn)在CD4T細(xì)胞和IL-2R效應(yīng)T細(xì)胞減少，后者則為抑制性單核細(xì)胞增多和大量前列腺素E2的釋放。我們的研究顯示：CPB和非CPB心臟手術(shù)均可引起sIL-2R釋放明顯增加，僅在CPB停機(jī)術(shù)畢CPB組sIL-2R水平升高較非CPB組明顯。sIL-2R可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IL-2，從而形成一種免疫抑制復(fù)合物4。盡管CPB心臟手術(shù)sIL-2R升高的機(jī)理和臨床意義仍不清楚，但顯然IL-2減少和sIL-2R增加對(duì)患者免疫防御機(jī)能極為不利。近年國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道促炎癥細(xì)胞因子，如IL-6、TNF-對(duì)心臟收縮功能和中性粒細(xì)胞-心肌間粘附有直接影響3，812。IL-6除作為B細(xì)胞和肝細(xì)胞刺激因子外，亦與缺血再灌注損

20、傷所致的心功能損傷有關(guān)。活化中性粒細(xì)胞引起心肌損傷需心肌表面細(xì)胞間粘附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表達(dá)及通過(guò)ICAM-1-CD116CD18的介導(dǎo)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)：低氧應(yīng)激及繼后的再氧合可導(dǎo)致心肌釋放大量IL-6，IL-6可誘導(dǎo)ICAM-1合成89。臨床研究亦發(fā)現(xiàn)：CPB心臟手術(shù)后IL-6水平明顯升高3，1011。該情況在術(shù)前左心功能不全的患者更為明顯，因此這些患者術(shù)后可能需更多的血管活性藥物支持11。TNF-也是一種促炎癥細(xì)胞因子，其可引起低血壓和多器官損害。CPB心臟手術(shù)后TNF-是否升高報(bào)道不一1，1012。我們的研究顯示：

21、CPB和非CPB心臟手術(shù)均引起患者外周血中TNF-水平升高。IL-10是一種抗炎癥細(xì)胞因子。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可抑制IL-1、IL-6、IL-8、TNF-及自身的合成12。我們的結(jié)果顯示：CPB心臟手術(shù)引起患者IL-10釋放明顯高于非CPB心臟手術(shù)患者；此外，IL-10釋放的峰值水平亦超前于IL-6和TNF-升高的峰值水平。盡管這種抗炎癥細(xì)胞因子釋放峰值超前于促炎癥細(xì)胞因子釋放峰值的意義尚不清楚，但可能與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中細(xì)胞因子的相互調(diào)節(jié)有關(guān)。Seghaye12認(rèn)為IL-10通過(guò)下調(diào)促炎癥細(xì)胞因子的生成可能有利于CPB心臟手術(shù)患者。我們的結(jié)果說(shuō)明外科手術(shù)應(yīng)激和CPB均是引起先天性心臟病手術(shù)患者術(shù)后細(xì)

22、胞因子變化的主要因素。這些細(xì)胞因子釋放改變的機(jī)理和臨床意義尚需進(jìn)一步研究。本課題由紐約中華醫(yī)學(xué)基金會(huì)資助(CMB-9318)作者單位： 610041 成都，華西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸心外科(肖錫俊、杜曉東、李勇、王允、袁宏聲)，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室(章崇杰、趙宗蓉、張平)4參考文獻(xiàn)1Sawa Y, Shimazaki Y, Kadoba K, et al. Attenuation of cardiopulmonary bypass-derived inflammatory reaction reduces myocardial reperfusion injury in cardiac ope

23、ration. J Thorac Cardiovasc Surg,1996，111(1)29.2Boyle EM, Pohlman TH, Johnson MC, et al. Endothelial cell injury in cardiovasc surgery: The systemic inflammatory response. Ann Thorac Surg, 1997,63(1)277.3Cremer J, Martin M, Redl H, et al. Systemic inflammatory response syndrome after cardiac operati

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