MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中藥物濃度篩選詳解

1、（一）試驗(yàn)前應(yīng)明確的問題 1. 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般狀況下，96孔培育板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長滿時約有105個細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培育時間，以保證培育終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀看不到差異。 2. 藥物濃度的設(shè)定?？隙ㄒ嗫次墨I(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初篩。依據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的

2、有效濃度和時間。 3.  時間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時間點(diǎn)的測定OD值，輸入excel表，最終得到不同時間點(diǎn)的抑制率變化狀況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點(diǎn)應(yīng)當(dāng)就是最好的時間點(diǎn)（由于這個時候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。 4. 培育時間。200ul的培育液對于10的45次方的增殖期細(xì)胞來說，很難維持68h，假如養(yǎng)分不夠的話，細(xì)胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換液的。 5. MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞確定數(shù)。做MTT時，盡量無菌操作，由于細(xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的上升。&

3、#160;6. 理論未必都是對的。要依據(jù)自己的實(shí)際狀況調(diào)整。 7. 試驗(yàn)時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對比孔，加藥孔。調(diào)零孔加培育基、MTT、二甲基亞砜。對比孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培育液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對比孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。 8. 避開血清干擾。用含15胎牛血清培育液培育細(xì)胞時，高的血清物質(zhì)會影響試驗(yàn)孔的光吸取值。由于試驗(yàn)本底增加，會試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10胎牛血清的培育液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培育孔內(nèi)殘余培育液。 （二）試驗(yàn)步驟 貼壁細(xì)胞： 1. 收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪

4、板使待測細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。 2. 5%CO2，37孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個復(fù)孔.建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實(shí)狀況.3. 5%CO2，37孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀看。 4. 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），連續(xù)培育4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培育液，當(dāng)心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培育液。

5、0;5. 終止培育，當(dāng)心吸去孔內(nèi)培育液。 6. 每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。 7. 同時設(shè)置調(diào)零孔（培育基、MTT、二甲基亞砜），對比孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培育液、MTT、二甲基亞砜） 懸浮細(xì)胞： 1）收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)⒀a(bǔ)足的1640（無血清）培育基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培育液稀釋 l?g/ml，需預(yù)試查找最佳稀釋度，1:10-1

6、:20)；需檢測物10ul；細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對比（加100?(儲存液100 1640）。 2）置37，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀看。 3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），連續(xù)培育4 h。（懸浮細(xì)胞推舉使用WST-1，培育4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值） 4）離心（1000轉(zhuǎn)x10min），當(dāng)心吸掉上

7、清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。 5）同時設(shè)置調(diào)零孔（培育基、MTT、二甲基亞砜），對比孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培育液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。 （三）MTT的配制 MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避開反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培育板中加，沒必要一

8、下子配那么多,尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就確定不能再用了。 MTT有致癌性，用的時候當(dāng)心,有條件最好帶那種透亮的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，到底時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉。 配制MTT時用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60水浴助溶。 PBS配方:Nacl 8g，Kcl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，調(diào)ph 7.4，定容1L。 （四）關(guān)于細(xì)胞的接種(鋪板) 細(xì)胞過了30代以后就不要

9、用了,由于狀態(tài)不好了;培育板要用好的（最好進(jìn)口板），不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)試驗(yàn)。 接種時最好依據(jù)預(yù)試驗(yàn)摸索出的密度接種, 由于細(xì)胞密度在10000/ml左右時，所測得的OD值的區(qū)間即細(xì)胞抑制率（或者增值率）的所呈現(xiàn)的線性關(guān)系最好，結(jié)果最可信。假如鋪的太稀細(xì)胞的殺傷不會很明顯，太密細(xì)胞可能都會凋亡，由于細(xì)胞長的太快養(yǎng)分會不夠，最終導(dǎo)致死亡。且而細(xì)胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關(guān)系不佳。故而MTT細(xì)胞密度多接受10000/ml，100ul/孔。 細(xì)胞密度要依據(jù)不同細(xì)胞的特點(diǎn)來定.假如你做的藥品對細(xì)胞具有刺激作用那么取小點(diǎn)的細(xì)胞濃度，假如你做

10、的藥品對細(xì)胞具有抑制作用那么取大點(diǎn)的細(xì)胞濃度，這樣與對比的區(qū)分更明顯，數(shù)據(jù)更好。懸浮細(xì)胞每孔的細(xì)胞數(shù)可達(dá)到105,貼壁細(xì)胞可為103-104.（五）加入MTT 個人認(rèn)為MTT最關(guān)鍵的是你的細(xì)胞數(shù)目和你加入真正起作用的的MTT的適當(dāng)比例，具體細(xì)胞數(shù)目和真正起作用的的MTT之間的關(guān)系的確不好確定，我認(rèn)為MTT多加一些比少加好一些 MTT的量各家報道不同，一般是過量的，所以10ul即夠了。假如不使用96孔板，培育基超過100ul，MTT依據(jù)10%的比例加入.加入MTT以后振蕩一下讓MTT與培育基混勻，不過這個應(yīng)當(dāng)關(guān)系不大。 如加入MTT后都有個別孔馬上變?yōu)樗{(lán)黑色，則污染

11、的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細(xì)胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在鏡下觀看，看看是否有孔染菌，染菌的孔經(jīng)常是接近的。由于血清中白蛋白對大部分的藥物都有結(jié)合效應(yīng)，所以可以單獨(dú)將藥物和MTT加在一起，看會不會起反應(yīng)。假如不起反應(yīng)，就不用去除含藥物的培液，直接加MTT即可。首先說說我的一點(diǎn)閱歷： 1. 吹打時懸液總量不能太多，達(dá)到吸管吸液量的3到4倍，可能比較簡潔混勻。10ml的離心管里面最好裝34ml的懸液：懸液太少簡潔吹起很多氣泡，懸液太多又不簡潔吹成單細(xì)胞懸液。 2. 吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量過多的話，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，

12、這樣吹打簡潔起泡，吸液量過少，吹打的力度就不夠，吹打就會不均勻。假如是吸液量1ml多的吸管，總液量在5ml左右為益 3. 吸的時候要在懸液底部，然后提起來一點(diǎn)，但是吹下去的時候不要離開液面，否則簡潔吹打出氣泡。 4. 吹打次數(shù)100左右，就可以吹打均勻了（有人認(rèn)為加細(xì)胞前吹打3050次基本就差不多均勻了。加細(xì)胞的時候每接種2孔反復(fù)吹打3次，每吹打3次后槍頭垂懸與細(xì)胞懸液中5秒鐘，然后再以肯定的速度吸取懸液。） 5. 向每孔中用槍頭加入細(xì)胞時不要太快，否則你會發(fā)覺細(xì)胞在加入的瞬間會由于槍頭的沖力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中心，而周邊很少，這種不均勻的分散會產(chǎn)生

13、接觸抑制，影響細(xì)胞的生長。所以速度不能太快也不能太慢。我習(xí)慣每塊板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在來回回復(fù)3下移動，目的是使得細(xì)胞能分散的均勻些。（鋪板技術(shù)是MTT試驗(yàn)的關(guān)鍵，也是基礎(chǔ)，肯定要練好。曾經(jīng)有同學(xué)用漩渦振蕩器混勻細(xì)胞，最終細(xì)胞全死了，建議不要接受這種方法混勻細(xì)胞。 其它的聲音：  1. 首先細(xì)胞的接種密度肯定不能過大，一般每孔1000個左右就夠了，我認(rèn)為寧少勿多。尤其是對于腫瘤細(xì)胞。10000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現(xiàn)不出的，最佳點(diǎn)板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會很大。 2. MTT本身就是比較粗的試驗(yàn)，增殖率10%左右的波動都不算驚異。特殊是新手，20的波動也是常見的，所以很可能是技術(shù)緣由引起的，特殊是種板技術(shù)肯定要過關(guān)。 3. 我做的是腫瘤細(xì)胞的MTT試驗(yàn),這種細(xì)胞長的很快一開頭我是用100000/ML的濃度來接種的,結(jié)果細(xì)胞長的太滿結(jié)果是沒有梯度也沒有線性關(guān)系.后來調(diào)整濃度,用過4000080000/ML的濃度都做過MTT試驗(yàn),結(jié)果發(fā)覺做的結(jié)果比較好點(diǎn)的是6000070000/ML的濃度組的.用40000/M的濃度的組,由于細(xì)胞少,藥物作用的梯度還是有,