CCK8檢測細(xì)胞增殖毒性的原理及注意事項(xiàng)

1、CCK8檢測細(xì)胞增殖/毒性的原理、方法及留意事項(xiàng)一、CCK8檢測細(xì)胞增殖/毒性的原理Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而精確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。用途：藥物篩選、細(xì)

2、胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗(yàn)CCK8的優(yōu)點(diǎn)：· 使用便利，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑；· CCK-8法能快速檢測；· CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度；· CCK-8法的重復(fù)性優(yōu)于MTT 法；· CCK-8法對(duì)細(xì)胞毒性小；· CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。CCK8的缺點(diǎn)：· 與MTT法相 比，CCK8和XTT的價(jià)格比較貴。· CCK8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培育基顏色接近，不留意的話簡潔產(chǎn)生漏加或多加。與以往的增殖/毒性測定試劑相

3、比較：檢測方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法甲臢產(chǎn)物的水溶性差（需加有機(jī)溶劑溶解）好好好產(chǎn)品性狀粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用即開即用即開即用檢測靈敏度高很高很高高檢測時(shí)間較長較短較短最短檢測波長560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm細(xì)胞毒性高，細(xì)胞形態(tài)完全消逝很低，細(xì)胞形態(tài)不變很低，細(xì)胞形態(tài)不變很低，細(xì)胞形態(tài)不變?cè)噭┓€(wěn)定性一般較差一般很好批量樣品檢測可以格外適合格外適合格外適合便捷程度一般便捷便捷格外便捷二、CCK8檢測細(xì)胞增殖/毒性的方法試驗(yàn)一：細(xì)胞增殖分析1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)2、接種到96孔板中：依據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)

4、，每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做3個(gè)重復(fù)。3、37培育箱中培育：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培育2-4小時(shí)，假如不需要貼壁，這步可以省去。4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕小扣擊培育板以掛念混勻?；蛘咧苯优渲煤?0%CCK8的培育基，以換液的形式加入。5、培育1-4小時(shí):細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。假如顯色不夠的話，可以連續(xù)培育，以確認(rèn)最佳條件。特殊是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。6、測定450nm吸光度：建議接受雙波進(jìn)步行測定，檢測波長450-490n

5、m，參比波長600-650nm。試驗(yàn)二：細(xì)胞毒性分析1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)2、接種到96孔板中：依據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)，每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做3個(gè)重復(fù)。3、37培育箱中培育：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培育2-4小時(shí)，假如不需要貼壁，這步可以省去。4、加入不同濃度的毒性物質(zhì)5、37培育箱中培育：加入毒性物質(zhì)的培育時(shí)間，要看毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性，一般要依據(jù)細(xì)胞周期來打算，起碼要一代以上的時(shí)間。6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕小扣擊培育板以掛念混勻。7、培育1-4小時(shí):細(xì)胞種類不同，形成的Forma

6、zan的量也不一樣。假如顯色不夠的話，可以連續(xù)培育，以確認(rèn)最佳條件。特殊是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。8、測定450nm吸光度：建議接受雙波進(jìn)步行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。注：· 若臨時(shí)不測定OD值，可以向每孔中加入10 L 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培育板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。· 假如待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新穎培育基（除去培育基，并用培育基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培育基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響

7、比較小的狀況下，可以不更換培育基，直接扣除培育基中加入藥物后的空白吸取即可。三、CCK8檢測細(xì)胞增殖/毒性的留意事項(xiàng)· 當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100 l 培育基)。檢測白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推舉接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100 l 培育基)。· 酚紅和血清對(duì)CCK8法的檢測不會(huì)造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。· CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細(xì)胞。在細(xì)胞增殖試驗(yàn)每次測定的過程中需要避開細(xì)菌污染，以免影響結(jié)果。· CCK-8在0-5下能夠保存至少6個(gè)月，在-20下避光可以保存1年。· 當(dāng)在培育箱內(nèi)培育時(shí)，培育板最外一圈的孔最簡潔干燥揮發(fā)，由于體積不精確而增加誤差。一般狀況下，最外一圈的孔只加培育基，不作為測定孔用。· 在培育基中加入CCK8，培育肯定的時(shí)間，測定450 nm的吸光度即為空白對(duì)比。在做加藥試驗(yàn)時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸取，可在加入藥物的培育基中加入CCK8，培育肯定的時(shí)間，測定450 nm的吸光度作為空白對(duì)比。· 金屬對(duì)CCK-