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文檔簡介

1、引物設(shè)計的原理和程序一、設(shè)計原理1、選擇合適的靶序列：設(shè)計引物之前，必須分析待測靶序列的性質(zhì)，選擇高度保守、堿基分布均勻的區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計。2、長度：一般來說，寡核苷酸引物長度為15-25bp。3、Tm值：引物的Tm值一般控制在55-65，盡可能保證上下游引物的Tm值一致。若G+C含量相對偏低，則可以使引物長度稍長，而保證一定的退貨溫度。4、G+C含量：有效引物中的G+C含量一般為40%-60%。5、堿基的隨機分布：引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C。6、引物末端：只有引物的3端與模板結(jié)合，PCR才能進(jìn)行，所以3端最好是G或C。7、

2、引物自身：引物自身不存在連續(xù)4個堿基以上的互補序列，否則會影響到引物與模板之間的結(jié)合，尤其避免3端的互補。8、引物之間：上下游引物之間盡量少的存在互補序列，否則上下游引物退火結(jié)合，將影響到PCR的擴增效率。二、序列查找根據(jù)所需檢測的待檢定基因，在網(wǎng)址查詢有關(guān)序列。三、引物設(shè)計與篩選 以Beacon Designer 5.1軟件為例，進(jìn)行引物設(shè)計和篩選。1、打開軟件，調(diào)入序列2、選擇序列文件名，加入右框3、序列顯示如圖，4、選擇引物設(shè)計方式5、點擊“Primer Search（圖標(biāo)）”，按照引物設(shè)計的原理，設(shè)定引物的各種參數(shù)，點擊“Search”進(jìn)行引物搜尋6、等待引物搜尋，顯示結(jié)束后，點擊“OK”，進(jìn)入下一頁，7、按照搜尋結(jié)果顯示，逐條分析， 點擊“All Structures”，檢查該引物對的二級結(jié)構(gòu)，依次篩選四、引物比對比對設(shè)計的引物是否滿足需要和引物的特異性，在網(wǎng)址進(jìn)行比對 1、輸入所需比對的序列，選擇數(shù)據(jù)庫“nr

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