流式細(xì)胞術(shù)的新應(yīng)用

1、流式細(xì)胞術(shù)的新應(yīng)用楊麗娜 學(xué)號201011560摘要：流式細(xì)胞術(shù)是目前生物學(xué)領(lǐng)域重要的檢測技術(shù)，它是一項集多種高科技技術(shù)于一體的新型分析檢測方法。近年來在其基礎(chǔ)上建立起來的新型流式細(xì)胞儀系統(tǒng)，在生物研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。本文綜述了近五年流式細(xì)胞術(shù)在新領(lǐng)域的應(yīng)用和進(jìn)展。關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞術(shù)；進(jìn)展；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)是上個世紀(jì)六七十年代發(fā)展起來的一門高新技術(shù)，它集成了計算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫等多項技術(shù)和方法，兼具有分析和分選等功能。流式細(xì)胞術(shù)通過檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度或其他光學(xué)特性可分辨多種細(xì)胞特性，如細(xì)胞表面標(biāo)志物、蛋白表達(dá)、DNA含量、細(xì)胞內(nèi)離子濃度、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)、細(xì)胞

2、功能如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和磷酸化狀態(tài)等1，其在臨床診斷、疫苗研發(fā)、基因組、蛋白組、蛋白工程、新藥發(fā)現(xiàn)、生殖生物學(xué)、植物和海洋生物學(xué)、毒理學(xué)、單分子檢測等多方面發(fā)揮著舉足輕重的作用2。至今流式細(xì)胞儀經(jīng)過40多年發(fā)展，在檢測技術(shù)、高通量分析、數(shù)據(jù)收集與分析等方面都取得了很多突破，如成像流式細(xì)胞儀，將流式細(xì)胞檢測與熒光顯微鏡成像結(jié)合，不僅獲得細(xì)胞群的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，同時可得到單個細(xì)胞的圖像，從而提供細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞信號分布、細(xì)胞相互作用、胞內(nèi)分子轉(zhuǎn)運、基因表達(dá)分析等信息；生物分選流式儀，可以對各種生物微粒和生物大分子進(jìn)行分選和測定；高通量流式分析儀可以進(jìn)行多重蛋白或可溶性化合物的高通量篩選和分析

3、；功能性流式細(xì)胞儀，則可以進(jìn)行細(xì)胞功能的分析和研究，如細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期分析等。近年來隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新和方法的改進(jìn)，流式細(xì)胞術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大。本文結(jié)合近年來的研究，就其在生物領(lǐng)域的新應(yīng)用做一概述。流式細(xì)胞術(shù)的基本原理是根據(jù)每一個微粒（細(xì)胞）的熒光強(qiáng)度和光散射情況等屬性的不同進(jìn)行檢測，從而將細(xì)胞或微粒按大小、形態(tài)或其他特性的不同進(jìn)行分辨，近年來流式細(xì)胞術(shù)在以下幾方面的生物研究中的取得了一定的突破和進(jìn)展。1.單細(xì)胞分析流式細(xì)胞術(shù)最初用于分析細(xì)胞的熒光強(qiáng)度及分選帶有特定熒光標(biāo)記的細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮于液流中單排通過多激光光束，從而使激光探測器將細(xì)胞發(fā)出的熒光信號轉(zhuǎn)換為電信號，通常細(xì)胞被

4、細(xì)胞膜蛋白的熒光抗體所標(biāo)記。根據(jù)不同波長下光信號的強(qiáng)度，將細(xì)胞以大小，粒度和膜蛋白的表達(dá)量的不同而逐個進(jìn)行區(qū)分。流式細(xì)胞儀和細(xì)胞分選器可每小時分析上千個單細(xì)胞，并且可同時分析多達(dá)18個蛋白標(biāo)記3。此外流式細(xì)胞術(shù)還可用于純化亞細(xì)胞群3。在過去幾年中，流式細(xì)胞術(shù)逐漸發(fā)展，現(xiàn)已可用于鑒定和純化各種各樣的細(xì)胞群，包括組織和腫瘤中的干細(xì)胞4。近來的進(jìn)展包括利用磷酸化特異性抗體檢測多種蛋白的磷酸化狀態(tài)，從而監(jiān)控成千個單細(xì)胞的信號通路3。而將流式細(xì)胞術(shù)和質(zhì)譜分析法結(jié)合后，用特異性的多原子標(biāo)簽替代熒光標(biāo)簽來標(biāo)記抗體，可克服不同熒光標(biāo)簽產(chǎn)生的光疊加問題，從而增加標(biāo)記物的檢測數(shù)量，實現(xiàn)多參數(shù)檢測3。2 基因組測序

5、與基因表達(dá)的檢測流式細(xì)胞術(shù)可分離單個細(xì)菌從而進(jìn)行全基因組擴(kuò)增和測序5，最近發(fā)現(xiàn)可從腫瘤細(xì)胞中分離單個流式分選的核，接著進(jìn)行全基因組擴(kuò)增和單細(xì)胞基因的測序，從而研究腫瘤發(fā)展6。而另一個課題組發(fā)現(xiàn)通過FISH并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)可對染色體上的重復(fù)基因組進(jìn)行分析7。流式細(xì)胞術(shù)與FISH的結(jié)合也可用于端粒平均長度的檢測8。在基因的甲基化分析中，流式細(xì)胞儀可用于尋找癌癥的生物標(biāo)志物，通過定量臨床血漿和糞便樣品中DNA甲基化狀態(tài)可尋找生物標(biāo)志物9。流式細(xì)胞儀目前不僅僅用于基因組研究，還可通過標(biāo)記DNA進(jìn)行染色體倍性分析、細(xì)胞周期分析、分揀染色體。最新研究發(fā)現(xiàn)它還可用于篩選精確分期的線蟲胚胎，從而分析其RNA表

6、達(dá)10，而通過反復(fù)交配和單缺失株的富集可創(chuàng)建出帶有多個精確缺失的釀酒酵母11。3.高通量篩選流式細(xì)胞術(shù)因其多參數(shù)、高速分析和高分選能力，加之新型流式細(xì)胞儀整合了96孔板上樣技術(shù)和數(shù)字化電子系統(tǒng)，使得樣品采集速度高達(dá)15000個/秒，尤其適用于高通量篩選。近來流式細(xì)胞術(shù)用于從可溶性化合物文庫中篩選藥物，并且在藥物研發(fā)的其他階段發(fā)揮著重要的應(yīng)用，如化合物定性，通路分析，毒理學(xué)等1。目前已成功通過流式細(xì)胞術(shù)高通量篩選單鏈抗體12，也可用于篩選新藥13如抗凋亡Bcl-2蛋白家族的抑制劑的高通量篩選14，G蛋白信號調(diào)節(jié)蛋白RGS4D抑制劑的鑒定15，轉(zhuǎn)運蛋白ABCB1，ABCC1和ABCG2的特異性抑制

7、劑的檢測16。利用高通量流式細(xì)胞術(shù)還可篩選和分析蛋白酶活性17。4.臨床應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)每秒成千個樣品的檢測能力，為生物醫(yī)學(xué)與臨床檢驗提供了全新視角和強(qiáng)有力手段，尤其是在診斷機(jī)體免疫狀態(tài)或腫瘤形成時，在基礎(chǔ)研究中可通過分析磷酸化蛋白從而評估信號通路，在應(yīng)用中可檢測藥物處理后動物或病人體內(nèi)細(xì)胞功能的改變，因此流式細(xì)胞術(shù)在臨床和預(yù)臨床研究中也很受歡迎1。流式細(xì)胞術(shù)可進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析，將不同的淋巴細(xì)胞亞群區(qū)分開，并可計算它們相互間的比例。通過對患者淋巴細(xì)胞各亞群數(shù)量的測定了解淋巴細(xì)胞的分化功能，鑒別新的淋巴細(xì)胞亞群，并且通過研究大多數(shù)疾病的特異性淋巴細(xì)胞亞群或某些細(xì)胞表面標(biāo)志的存在、缺乏、過度表達(dá)

8、等，對一些疾病，如免疫學(xué)疾病、感染性疾病、腫瘤等診斷、治療、免疫功能重建和器官移植監(jiān)測等有重要的意義。如HIV主要侵襲CD4陽性細(xì)胞，而導(dǎo)致CD4陽性T細(xì)胞減少，為艾滋病的診斷和治療提供依據(jù)。流式細(xì)胞術(shù)在臨床上也可用于白細(xì)胞亞型分析，還可用于利用靶向特異性抗原的抗體可鑒定血細(xì)胞的亞群，從而得出病人的免疫表型特性 1。在臨床診斷中，由于可用探針及儀器設(shè)備的限制，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)未能普及，但隨著多激光流式細(xì)胞儀和新型探針（半導(dǎo)體納米晶體，量子點）的研發(fā)，流式細(xì)胞術(shù)可分析17種熒光散射光18, 19，但由于進(jìn)樣、程序設(shè)置及數(shù)據(jù)分析等的復(fù)雜程度依然限制了流式細(xì)胞術(shù)在監(jiān)控臨床試驗中的作用，但優(yōu)化檢測流程

9、后可讓使用流式細(xì)胞儀監(jiān)控的多中心臨床試驗的實驗可變性降至最低程度20，從而擴(kuò)大流式細(xì)胞術(shù)在臨床中應(yīng)用范圍。展望流式細(xì)胞術(shù)整合了激光光學(xué)、現(xiàn)代流體力學(xué)、電子物理學(xué)、光電測量技術(shù)、計算機(jī)技術(shù)、熒光化學(xué)技術(shù)及單克隆抗體技術(shù)等多項技術(shù)，是多學(xué)科多領(lǐng)域技術(shù)進(jìn)步的結(jié)晶。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)仍然在快速發(fā)展，并已在檢測技術(shù)、分選技術(shù)及高通量分析等方面得到了廣泛應(yīng)用。隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)、精密機(jī)械加工技術(shù)的發(fā)展，以及新型熒光染料的開發(fā)和細(xì)胞制備方法的改進(jìn)，流式細(xì)胞術(shù)也必將取得更大更快的進(jìn)展，得到更加廣泛的應(yīng)用。參考文獻(xiàn) 1Sklar L A, Carter M B, Edwards B S. Flow c

10、ytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screeningJ. Curr Opin Pharmacol, 2007,7(5):527-534. 2Bergquist P L, Hardiman E M, Ferrari B C, et al. Applications of flow cytometry in environmental microbiology and biotechnologyJ. Extremophiles, 2009,13(3):389-401. 3Kalisky T,

11、 Quake S R. Single-cell genomicsJ. Nat Methods, 2011,8(4):311-314. 4Preffer F, Dombkowski D. Advances in complex multiparameter flow cytometry technology: Applications in stem cell researchJ. Cytometry B Clin Cytom, 2009,76(5):295-314. 5Zhang K, Martiny A C, Reppas N B, et al. Sequencing genomes fro

12、m single cells by polymerase cloningJ. Nat Biotechnol, 2006,24(6):680-686. 6Navin N, Kendall J, Troge J, et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencingJ. Nature, 2011,472(7341):90-94. 7BrindAmour J, Lansdorp P M. Analysis of repetitive DNA in chromosomes by flow cytometryJ. Nat Methods,

13、2011,8(6):484-486. 8Baerlocher G M, Vulto I, de Jong G, et al. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH)J. Nat Protoc, 2006,1(5):2365-2376. 9Li M, Chen W D, Papadopoulos N, et al. Sensitive digital quantification of DNA methylation in clinical samplesJ. Nat Biote

14、chnol, 2009,27(9):858-863.10Stoeckius M, Maaskola J, Colombo T, et al. Large-scale sorting of C. elegans embryos reveals the dynamics of small RNA expressionJ. Nat Methods, 2009,6(10):745-751.11Suzuki Y, St O R, Mani R, et al. Knocking out multigene redundancies via cycles of sexual assortment and f

15、luorescence selectionJ. Nat Methods, 2011,8(2):159-164.12Ayriss J, Valero R, Bradbury A R, et al. Multiplexed flow cytometry: high-throughput screening of single-chain antibodiesJ. Methods Mol Biol, 2009,525:241-260.13Krutzik P O, Nolan G P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-t

16、hroughput drug screening and signaling profilingJ. Nat Methods, 2006,3(5):361-368.14Curpan R F, Simons P C, Zhai D, et al. High-Throughput Screen for the Chemical Inhibitors of Antiapoptotic Bcl-2 Family Proteins by Multiplex Flow CytometryJ. Assay Drug Dev Technol, 2011.15Roman D L, Talbot J N, Roo

17、f R A, et al. Identification of small-molecule inhibitors of RGS4 using a high-throughput flow cytometry protein interaction assayJ. Mol Pharmacol, 2007,71(1):169-175.16Ivnitski-Steele I, Larson R S, Lovato D M, et al. High-throughput flow cytometry to detect selective inhibitors of ABCB1, ABCC1, an

18、d ABCG2 transportersJ. Assay Drug Dev Technol, 2008,6(2):263-276.17Saunders M J, Edwards B S, Zhu J, et al. Microsphere-based flow cytometry protease assays for use in protease activity detection and high-throughput screeningJ. Curr Protoc Cytom, 2010,Chapter 13:12-13.18Perfetto S P, Chattopadhyay P K, Roederer M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune systemJ. Nat Rev Immunol, 2004,4(8):648-655.19Chattopadhyay P