212165 寡核苷酸類抗流感藥物鈉含量測定 仲婕VIP

1、寡核苷酸抗流感藥物鈉含量測定仲婕1,2，李保山1,2，朱德領(lǐng)1,2*，張金鐘1,2，施明珠1,2（1. 杭州天龍藥業(yè)有限公司，浙江杭州 310021； 2.軍科天龍藥物研究院，浙江杭州 310021）摘要：目的：用離子色譜法、原子吸收光譜法評價(jià)抗流感藥物鈉含量，以了解兩種方法的在生產(chǎn)檢驗(yàn)中的優(yōu)劣。探討兩種測量方法定量結(jié)果的一致性。方法：在戴安ICS900離子色譜儀上，用陽離子分析柱Ionpac CS12（4×250mm），流動相：甲烷磺酸；電導(dǎo)檢測；流速1mL·min-1；測量結(jié)果與國標(biāo)方法（火焰原子收光譜法）進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)比較；應(yīng)用配對t檢驗(yàn)和Bland -Altman法

2、對兩種測量方法進(jìn)行一致性評價(jià)。結(jié)果：兩種方法的精密度分別為：2.0%和0.7%，重現(xiàn)性分別為2.0%和7.96%，回收率分別為97.2%和89.5%，線性方程分別為：Y=105.22X=0.1007,r=1.0000,Y=0.2894X+0.006, r=0.9991；測量結(jié)果無顯著性差異，配對t檢驗(yàn)P0.05；Bland -Altman一致性評價(jià)的95%一致性界限為：(-1.514,1.487)，絕大多數(shù)差值都位于該區(qū)間內(nèi)。結(jié)論：離子色譜法的重現(xiàn)性和回收率均優(yōu)于原子吸收法；Bland -Altman法綜合判斷兩組數(shù)據(jù)具有高度的一致性。關(guān)鍵詞：離子色譜法;原子吸收光譜法;鈉含量；t檢驗(yàn)；Bla

3、nd -Altman法;一致性Study on the content of sodium in oligonucleotide bulk pharmaceuticalsZHONG Jie1,2，LI Bao-shan1,2 ZHU De-ling1,2* ZHANG Jing-zhong1,2，SHI Min-zhu1,2 (1.Hangzhoutianlong Pharmaceutinal CO.,Ltd.，Hangzhou 310021, China;2. Institute of Junketianlong Materia Medica, Hangzhou 310021, China

4、)ABSTRACT: OBJECTIVE Determination of sodium content in oligonucleotide bulk pharmaceuticals by ion-chromatography and atomic absorption spectrophotometry. To evaluate the the degree of agreement between measurements.METHODS The precision,linearity, repeatability and analytical recovery were evaluat

5、ed on Dionex ICS900 and Shimadzu AA-6300C. By using paired t test and Bland-Sltman method to estimate consistency of two kinds of instrument and decide whether the data is replaceability or not. RESULTS The two method results showed that the precision were 2.0% and 0.7%,the repeatability were 2.0% a

6、nd 7.96%,the analytical recovery were 97.2%(RSD=2.46%,n=6) and 89.5%(RSD=8.59%,n=6) for ion-chromatography and atomic absorption spectrophotometry,respectively. The mean difference was -0.0136% with 95% confidence interval -1.514 to 1.487.Most of the differences lay between these limist (between d-1

7、.96s and d+1.96S).CONCLUSION There is no significant difference compared with the standard methodflame absorption spectrum method. Moreover, the ion-chromatography method had demonstrated its superiority in repeatability and analytical recovery.KEY WORDS: IC;AAS;comparison;paired t test; bland-altma

8、n method; the degree of agreement基金項(xiàng)目：“十二五”國家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)：核酸藥物“流感泰得”鼻噴劑的臨床前研究(基金編號：2011ZX09102-009-09)作者簡介：仲婕 女 副研究員 Tel： E-mail：*通訊作者：朱德領(lǐng) 男，教授級高工 Tel： E-mail： 鈉離子的電化學(xué)分類是很復(fù)雜的，抗流感新藥FLUTIDE，是寡核苷酸的鈉鹽，分子式為C126H152O70N36S12P12Na12，因?yàn)榉肿恿枯^大，受大分子環(huán)境的影響，鈉電離更為復(fù)雜，因此分析方法上有些局限。測定鉀、鈉的方法較多，有化學(xué)比濁法，已宣布淘汰，火焰光度法（EP），EP

9、的分析條件難以控制，且靈敏度及精密度都比原子吸收法和原子發(fā)射法差，離子選擇電極法（ISE），但電極老化快，壽命短，造成消耗品成本大，電極的材料不同，電極的選擇系數(shù)也不同，這對待測離子的影響是一個(gè)難以預(yù)測的變量。原子吸收光譜法（AAS）是國家標(biāo)準(zhǔn)1和醫(yī)院制劑2檢驗(yàn)中常用的方法。我們應(yīng)用現(xiàn)已有的儀器條件，用AAS法和離子色譜法同時(shí)測定寡核苷酸抗流感藥物中鈉含量，前者是將樣品的水溶液吸進(jìn)空氣-乙炔火焰中，鈉被解離成基態(tài)原子，能吸收588.9或330.2特征譜線的光（特征譜線由鈉空心陰極燈提供），與標(biāo)準(zhǔn)鈉溶液比較光譜吸收量，記錄峰高。后者是用應(yīng)用了離子交換的原理，使被測鈉離子在陽離子交換柱上與H+交換

10、，再用強(qiáng)陽離子洗脫劑洗脫下來，以達(dá)到與基質(zhì)中相鄰峰的分離，將產(chǎn)生的電導(dǎo)信號，轉(zhuǎn)變成色譜值，與標(biāo)準(zhǔn)鈉離子比較色譜值確定含量。從光譜數(shù)據(jù)和色譜數(shù)據(jù)綜合分析這一大分子中的鈉含量，比較兩種方法的優(yōu)劣，評價(jià)兩種方法所得結(jié)果的一致性成度3-4。1 儀器與試藥離子色譜儀（ICS-900，美國Dionex ），抑制型電導(dǎo)檢測器，Chromeleon色譜工作站。色譜柱為Ionpac CS12離子交換柱（4 mm×250mm）。原子吸收分光光度計(jì)（AA-6300C，日本島津），鈉空心陰極燈（日本HAMAMATSU PHOTONICS K.K.公司），乙炔氣（純度98%,杭州氣體廠），空氣壓縮機(jī)（QSAC

11、-106,北京瑞昌匯博科技有限公司）。鈉離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000mg·L-1，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)，甲烷磺酸（優(yōu)級純，批號：，F(xiàn)luka 分司）超純水（18.2M·cm-1，Millipore公司）試驗(yàn)用藥物（寡核苷酸抗流感新藥，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所九室）。2 測試條件2.1 離子色譜法（IC）色譜條件：淋洗液為20mM甲烷磺酸，電導(dǎo)檢測；流速1mL·min-1；抑制器的抑制電流為59mA；進(jìn)樣量10L。2.2 原子吸收分光光度法（AAS）吸收波長588.9nm，狹縫0.2nm，燈電流8mA，燃燒器高度6，角度0°，乙炔-空氣火焰，燃?xì)猓ㄒ?/p>

12、炔）1.8L·min-1，助燃?xì)猓諝猓?5.0L·min-1，進(jìn)樣體積20L。3實(shí)驗(yàn)方法3.1 對照品溶液的制備和線性 取市售鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(1000mg·L-1 )，用超純水稀釋至下表所列濃度，作為對照品溶液，分別用原子吸收法和離子色譜法測定吸收度（AAS法）和峰面積（IC法）。結(jié)果見表1。表1 兩種方法對比試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab.1 Comparative study of IC and AAS to determination the sodium content AAS法IC法濃度/ppm吸收值濃度/mg·mL-1峰面積10.06250.0309

13、0.0001250.057920.12500.04890.01251.290030.25000.07950.12513.307340.50000.14000.50052.975051.00000.28351.000105.180362.00000.5927線性方程Y=0.2894X +0.006, r=0.9991Y=105.22 X + 0.1007, r=1.0000線性范圍0.06252.0000 ppm0.0001251.000 mg·mL-1精密度RSD 0.70%，n=6RSD 2.00%，n=6重現(xiàn)性RSD 7.96%，n=6RSD 2.00%，n=6回收率89.5%，

14、 RSD8.59%，n=697.2%， RSD 2.46%，n=63.2 樣品前處理 取樣品0.40.5g置鉗鍋中，電爐上緩緩熾灼至完全炭化，放冷，加濃硫酸1ml使?jié)櫇?，低溫加熱至硫酸蒸氣除盡后，在500600（實(shí)驗(yàn)中控制馬福爐溫度在550）使完全灰化，移至干燥器中，備用，臨用時(shí)以水定量稀釋至所需濃度，作為供試品溶液。3.3 精密度試驗(yàn)取鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，IC(0.029mg·mL-1）, AAS(0.83ppm)，分別用離子色譜法和原子吸收法重復(fù)測定6次，RSD分別為2.00%和0.70%。結(jié)果見表1。3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一批樣品，6份，按3.2項(xiàng)下樣品處理方法制得樣品貯備液，按IC和

15、AAS所要求的濃度范圍稀釋，進(jìn)樣，測定樣品含量，計(jì)算RSD分別為IC法2.00%和AAS法7.96%。結(jié)果見表1。3.5 回收率測定3.5.1 IC法回收率試驗(yàn)取樣品0.23g，共6份，分別至25ml容量瓶中，加水溶解，分別取4ml置鉗鍋中，加入鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(C=1 mg·mL-1)2.5ml，置電爐上緩慢蒸干，置于500600的馬富爐中，熾灼至灰化，殘?jiān)盟芙猓哭D(zhuǎn)移至10ml容量瓶中，加水至刻度，作為母液。取1ml母液置10ml容量瓶中，加水至刻度，搖勻，過濾，作為IC法回收率測定用溶液，分別進(jìn)樣10l，按供試品溶液的方法測定。結(jié)果見表1。3.5.2 AAS法回收率試驗(yàn)取3.5

16、.1項(xiàng)下的母液1ml，置10ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，再取1ml置100ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，作為AAS法的加樣回收率測定用溶液。分別吸入樣品,測定吸收值，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。3.6 樣品的含量測定取樣品0.46g，每批樣品取2份，置于500600的馬富爐中，熾灼至灰化，殘?jiān)盟芙猓哭D(zhuǎn)移至容量瓶中，加水稀釋至所需濃度，樣品測定結(jié)果見表2。3.6.1 t檢驗(yàn)假設(shè)H0:兩種儀器方法檢驗(yàn)結(jié)果含量無偏差,即d=0；H1:有偏差, 即d0，=0.05因?yàn)閚=12, d=-0.164 d2=6.448，所以偏差的平均值為-0.164/12=-0.0136(%)Sd=1.94t=0.0

17、24= n-1=12-1=11.查t界值勤表,t0.05,11=2.201,現(xiàn)t=0.024<2.201,得P>0.05,按=0.05水準(zhǔn)接受H0假設(shè)。3.6.2 Bland-Altman 檢驗(yàn)用差值進(jìn)行Bland-Altman的分析3-4，見圖2。從圖中可以看出，差值的均數(shù)為-0.,差值的標(biāo)準(zhǔn)差Sd=0.765，則95%一致性界限為(-1.514,1.487)。全部點(diǎn)在95%一致性界限以內(nèi)，差值的絕對值最大為1.286%,兩種方法平均為6.33%,這種相差的幅度在實(shí)際產(chǎn)品檢驗(yàn)中可勉強(qiáng)接受。因此可以認(rèn)為兩種方法測量的結(jié)果仍具有一致性，可以相互替代。用比值進(jìn)行Bland-Altman

18、的分析5，見圖3。從圖中可以看出，比值的均數(shù)為1.000847,接近于1.000,比值的標(biāo)準(zhǔn)差Sr=0.12，則95%一致性界限為(0.764,1.238)，所有點(diǎn)在此95%一致性界限以內(nèi),且最大值為1.209，最小值為0.784。圖1 離子色譜圖A-對照品溶液；B-供試品溶液； Fig.1 IC chromatograms A-standard solution; B-sample solution圖2 用差值進(jìn)行Bland-Altman分析圖Fig.2 Assessing agreement between two measurements with differences by Blan

19、d-Altman method圖3 用比值進(jìn)行Bland-Altman分析圖Fig.3 Assessing agreement between two measurements with ratios by Bland-Altman method4討論4.1 離子色譜法測樣品中的鈉離子，目標(biāo)峰與其它峰可實(shí)現(xiàn)較好地分離，分離度為1.92：理論塔板數(shù)以鈉離子峰計(jì)算為2869。見圖1。4.2 樣品在450550加熱灰化45h，以破壞樣品的有機(jī)物基體，排除大分子有機(jī)物干擾，同時(shí)克服本品大分子水溶液粘度對噴霧速率的影響。4.3 為了排除基質(zhì)干擾，在原子吸收測定方法中還標(biāo)準(zhǔn)加入法測定，通過用兩種方法對同一

20、批樣品(第7批樣品)鈉含量進(jìn)行平行測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線法為6.90%，標(biāo)準(zhǔn)加入法為7.01%，結(jié)果具有可比性，基本一致，說明標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法均可精確測得本品的鈉含量。4.4 配對t檢驗(yàn)說明，假設(shè)H0成立，兩種儀器方法檢驗(yàn)結(jié)果含量無偏差,即d=0。Bland-Altman分析法綜合考慮了兩種儀器的系統(tǒng)誤差和偶然誤差，綜合判斷的結(jié)果顯示：兩組數(shù)據(jù)具有高度的一致性，以一致性界限和實(shí)際生產(chǎn)意義，得出這兩種方法測鈉的方法具有可替代性的結(jié)論。4.5 離子色譜法的重現(xiàn)性和回收率均優(yōu)于原子吸收法，在條件允許的情況，首選離子色譜法測定鈉含量。REFERENCES1 GB/T 13888-2003(國家標(biāo)準(zhǔn))&#

21、160;S. 20032 ZHOU B H，ZHANG F，WANG J，WANG Z CH，CAI H SH. Study on the content of sodium in Compound sodium lactate injection by AAS. J. Chin J Mod Appl Pharm(中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)), 1995, 12(6): 21-23. 3 Altman D G, Bland J M. Measurement in medicine:the analysis of method comparison studies. The Statistician,1983,32:307-317.4 Bland J M,Altman D G. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement.Lancet,1986,1:307-310.5 CHEN H. Applications of Bland-Altman method for