ELISA標準操作及技術(shù)服務(wù)的常見問題分析

1、詳細介紹： 一.ELISA 標準操作要點優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA 檢測結(jié)果準確可靠的必要條件。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的本公司要求使用的純化水電導(dǎo)率小于1.5s/cm。1. 標本的采取和保存大部分ELISA 檢測均以血清為標本。血清標本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP 為標記的ELISA 測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。一般說來，在5 天內(nèi)測定的血清標本可放置于4，標本在冰箱

2、中保存時間過長導(dǎo)致血清IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需20保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢吮緫?yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當防腐劑?？鼓煌耆臉吮疽蚶w維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。2.加樣加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出。3.保溫在建立ELISA 方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37經(jīng)

3、1-2 小時，產(chǎn)物的生成可達頂峰。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應(yīng)，邊上的值會偏高，建議為了客觀的判斷結(jié)果，將質(zhì)控放在非邊緣位置。4.洗滌洗滌在ELISA 過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的

4、吸附是普遍性的，而在洗滌時應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在ELISA 操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴格按要求洗滌，不得馬虎。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。洗板

5、時注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應(yīng)按要求稀釋，所用的水電導(dǎo)率最好在1.5us/cm 之下，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制。保證洗板浸泡時間為40 秒左右，孔內(nèi)液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。5. 顯色和比色TMB 經(jīng)HRP 作用后，約40 分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2 小時后即可完全消退至無色。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24 小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸

6、光值。酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指專用于測讀ELISA 結(jié)果吸光度的光度計。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數(shù)的準確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準確性為±1%，重復(fù)性達0.5%。酶標儀不應(yīng)安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在1530，使用前先預(yù)熱儀器15-30 分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀A 值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm 波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不 移動ELISA 板的位置，最終測得的A 值為兩者之差（W1-W

7、2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。二.本底及假陽性產(chǎn)生的原因分析1. 基因工程抗原與合成肽抗原的區(qū)別1.1 基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點：a.分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達到數(shù)百個氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。b.穩(wěn)定性好。包被的抗原的穩(wěn)定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原的試劑盒效期只有3-4 個月，采用基因工程抗原后效期大大延長了。c.基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達，表達產(chǎn)物包含更多的

8、抗原決定簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。d.純化難度大?；蚬こ炭乖募兓夹g(shù)難度較大。1.2 合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點：a.分子量太小b.一般只含有一個抗原決定簇c.純度高d.穩(wěn)定性差由于基因工程抗原較于合成肽抗原有無可比擬的優(yōu)越性，ELISA 診斷試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。就HCV ELISA 試劑盒來講，第一代產(chǎn)品為合成肽抗原，主要是HCV 特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當時的基因工程抗原不全，僅包括了HCV 的核心區(qū)片段；第三代產(chǎn)品基本上采用了

9、基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的HCV 特異性抗原。第三代試劑的敏感度大大提高了。由于歷史的原因，人們往往以反應(yīng)本底的好壞來衡量ELISA 反應(yīng)試劑盒，因此有些廠家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學(xué)敏感度不夠，穩(wěn)定性也成問題。值得欣慰的是也有廠家堅持試劑盒高的流行病學(xué)敏感度，科學(xué)得對待反應(yīng)結(jié)果。2假陽性本底產(chǎn)生的原因2. 1 抗原因素2.1. 1 融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷試劑盒為例為例，因為包被的基因工程抗原為融合蛋白，包含了來自表達載體的一些序列，因此可以與血清中抗大腸桿菌的因子發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生了可疑標本。2

10、.1.2 錯誤排序的影響。合成肽在制備過程中，如果某些肽序列錯誤，會導(dǎo)致合成肽特異性改變而產(chǎn)生假陽性。另外，在構(gòu)建基因工程表達載體時引入的HCV 核苷酸發(fā)生相位改變或點突變也會對抗原的特異性產(chǎn)生不利的影響，但由于基因工程技術(shù)的不斷進步，由工藝原因造成的抗原特異性降低會逐漸被克服。2.2. 3 抗原純度對特異性的影響。以HCV 抗原為例，利用大腸桿菌大規(guī)模表達后需經(jīng)破碎細胞、鹽析、粒子交換柱等分離純化步驟才能最后的到一定純度的HCV 抗原。目前的工藝還不能做到抗原純度為100，因此抗原中還混有大腸桿菌的其它雜蛋白，受過大腸桿菌感染的人，血清中的抗大腸桿菌抗體可和這些雜蛋白產(chǎn)生反應(yīng)而引起假陽性。2

11、.2 人血清中的正常IgG人血清中IgG 的濃度對HCV 試劑盒有較大的影響。HCV 試劑盒采用的間接法，酶標抗抗體能與人所有IgG 結(jié)合，而IgG 吸附于板孔的能力很強，因此我們采用100 微升樣稀加10 微升血清來將其稀釋以降低本底。到成人時，據(jù)統(tǒng)計學(xué)調(diào)查，成人的IgG 為12mg/ml，而有些人的IgG 濃度會遠遠高于此，這部分人的血清經(jīng)ELISA 反應(yīng)后往往會顯色。2.3 人血情中異常的IgG結(jié)締組織?。ㄏ到y(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性骨髓瘤等）等病癥時，血清中的風濕小體和其它異常IgG（IgG 濃度達到50mg/ml）會引起本底升高或假陽性。2.4 溶血的影響當溶血時，紅細胞中的血紅蛋白釋放到

12、血清中，血紅蛋白具有過氧化物酶的性質(zhì)，當其通過吸附或“PP 效應(yīng)”（蛋白質(zhì)間相互吸附的現(xiàn)象）結(jié)合后，可催化A、B 液顯色而造成假陽性。2.5 操作不當引起任何操作不當都會影響結(jié)果，因此在操作過程中保證操作的規(guī)范，嚴格按照說明書進行是得到準確結(jié)果的關(guān)鍵核基礎(chǔ)。2.5.1 加樣2.5.1.1 樣品稀釋液少加，或血清多加，都會引起本底增高。對于間接法來說，受上述兩個因素影響更大。因為血清中受檢的特異性IgG 只占總IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很強，非特異IgG 可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異的IgG均可以和酶標二抗發(fā)生反應(yīng)而造成較高陰性本底或假陽性。如果加

13、入的血清過多，高于規(guī)定的稀釋倍數(shù)，必將帶來陰性高值。2.5.1.2 酶結(jié)合物的不正確加入。一般來講，酶也有一定的非特異吸附，將包被好的酶聯(lián)板再封閉，一方面也可避免酶的非特異性吸附。通常每孔加入的封閉液為120l。如果加入的酶多于120l 或加在較高的孔壁上或孔口，也會引起本底升高或假陽性。2.5.2 溫育5.2.1 由于試劑盒確定的一定溫度下的反應(yīng)時間并不是反應(yīng)的終點，升高反應(yīng)的溫度，會加快反應(yīng)，同樣增加時間會延長反應(yīng)，這樣得到的反應(yīng)程度會比試劑盒確定的反應(yīng)程度多，也會引起陰性高值或假陽性。5.2.2 由于試劑盒通常設(shè)定的反應(yīng)溫度為37 度，在這個溫度下放置30 分鐘，蒸發(fā)的水分會很多，對于整

14、個反應(yīng)體系來講，各種反應(yīng)物的濃度會不斷增加，這樣必會導(dǎo)致反應(yīng)最后的值升高。因此溫育時應(yīng)蓋上膠貼。5.2.3 試劑盒在設(shè)計時，反應(yīng)是在靜置條件下完成的，如果反應(yīng)改變?yōu)檎駝訔l件，會加快分子的熱運動，增加反應(yīng)的機會。5.2.4 試劑盒的溫育過程是在培養(yǎng)箱中進行，這和水浴的條件不一樣。水浴可是酶聯(lián)板迅速升溫，但較難將溫度控制在較穩(wěn)定的溫度，往往高于37 度，同樣會引起高值陰性。2.5.3.洗板2.5.3.1 各個廠家使用的洗液配方是不同的，是根據(jù)各自試劑的條件配制的，采用不配套的洗液常會得到不正常的反應(yīng)結(jié)果，包括本底過高。本公司的洗液采用獨特的洗滌系統(tǒng)不能和其它公司的試劑盒混用。2.5.3.2 試劑盒

15、中提供的洗液是濃縮的，應(yīng)該稀釋到規(guī)定的倍數(shù)使用，過多稀釋洗液，會影響洗液的效果，而使反應(yīng)的本底過高。2.5.3.3 稀釋洗液的水應(yīng)該是新鮮的蒸餾水，電導(dǎo)率小于1.2s。如果水中含有過多的Ca2+、Mg2+，這些離子會占用表面活性劑，影響洗滌效果。2.5.3.4 洗板時，應(yīng)每孔加滿洗液，如果加入的洗液液量不夠，對洗滌的效果影響也是很大的。本公司的酶聯(lián)板板孔為400l，比別的廠家的板孔大，因此洗了別公司的板后要及時調(diào)整液量，以避免加液量不滿。2.5.3.5 洗板的次數(shù)不夠孔內(nèi)多余的抗原（抗體）或酶結(jié)合物不能徹底去除，也會因此本底升高。2.5.3.6 洗板的強度和洗板的浸泡時間是密切相關(guān)的。洗板機不

16、同，使用的泵不同，液體加入時的沖力不同。如果加入洗液的沖力不大，也沒有設(shè)定浸泡時間，同樣會使結(jié)果的A 值偏高。2.5.3.7 洗板完畢后，要進行拍板，盡量采用質(zhì)量好的毛巾和吸水紙，使用易掉渣的紙，紙屑會留在板孔中，由于紙屑中含有氧化劑而造成高值陰性。2.5.4 顯色。加A、B 液準確，順序不能顛倒，要及時終止顯色。終止后要在3 分鐘內(nèi)讀數(shù)，否則強陽性會變低。2.5.5.槍頭、加樣槽或其它來源的污染如果使用的槍頭、加樣槽是反復(fù)使用的，必須肯定其沒有來自酶或陽性的污染。酶作為反應(yīng)的催化劑，及其微量也會很明顯影響反應(yīng)。反復(fù)使用的槍頭、加樣槽清洗不當，也會干擾反應(yīng)。如將槍頭使用84 消毒液浸泡而沒有沖

17、洗干凈，因為84 是強氧化劑，加入AB 液后就會顯色。同樣槍頭和加樣槽不正確清洗，改變加入試劑的PH 值，反應(yīng)的結(jié)果也會不正常。常常有人用手紙將加樣槽擦干，但是如果使用的手紙容易掉渣，會將紙上的強氧化劑留在槽中而影響反應(yīng)。2.5.6.測A 值時，微孔條底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面都可能引起A 值的升高。 三、cut off 值附近血清的處理1.cut off 值附近的值是客觀存在的cutoff 值指經(jīng)過大量臨床調(diào)查后自行制定的判斷陰陽性的界限。Cut off 值附近的值客觀存在基于以下原因：大量臨床陰性樣本A 值呈正態(tài)分布；這些陰性樣本A 值是由低到高的連續(xù)曲線；cutoff 值是

18、這個連續(xù)曲線上的截斷值。1.1 正常血清A 值的正態(tài)分布如圖一：當試劑盒研發(fā)完成后，需要進行大量的臨床樣品的考核。其中陰性血清的A 值呈正態(tài)分布，大約95的陰性血清值與平均值相近，而有5的陰性血清則明顯低于或高于平均值，這是cutoff 值可根據(jù)95的置信限來確定。若試劑盒的特異性很好，可用98作為置信限來確定cutoff 值。但不論是選擇多少的置信限，總存在置信限以外的區(qū)域，該區(qū)域的部分樣品A 值會高于cutoff 值，從統(tǒng)計上說是無法避免的。1.2 正常血清A 值的連續(xù)分布經(jīng)過大量的臨床調(diào)查會發(fā)現(xiàn)，正常血清的A 值是一條從小到大的連續(xù)曲線。如圖二：在這條連續(xù)的曲線上，經(jīng)過計算選取一點作為cutoff 值，這一點之下為陰性，之上為陽性，因此cuto