體外構(gòu)建3D人工皮膚

1、www.CRTER.org劉鈺，等. 體外構(gòu)建3D人工皮膚體外構(gòu)建3D人工皮膚劉 鈺，沈 沖，孟 琴(浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江省杭州市 310027)引用本文：劉鈺，沈沖，孟琴. 體外構(gòu)建3D人工皮膚J.中國組織工程研究，2016，20(46):6915-6921.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.46.010 ORCID: 0000-0002-4320-9221(劉鈺)文章快速閱讀：3D人工皮膚的體外構(gòu)建劉鈺，女，1991年生，江西省豐城市人，漢族，碩士，主要從事組織工程研究。通訊作者：孟琴，教授，浙江大學(xué)化工系聯(lián)合反應(yīng)所，浙江省杭州市3100

2、27中圖分類號:R318文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:2095-4344(2016)46-06915-07稿件接受：2016-09-03結(jié)果表明，將角質(zhì)細(xì)胞接種于牛尾膠原包埋的成纖維細(xì)胞上，可構(gòu)建更好的人工皮膚將角質(zhì)細(xì)胞接種于含鼠尾(或牛尾)膠原包埋的成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)7 d，再氣提培養(yǎng)7 d，獲得人工皮膚從兒童包皮組織中分離培養(yǎng)原代成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞從牛尾和鼠尾中分別提取與純化膠原牛尾(或鼠尾)膠原包埋成纖維細(xì)胞，構(gòu)建真皮層文題釋義：角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法：目前有2種方法，一種用特定的無血清培養(yǎng)基，如M199、F12MCDB153、KSFM、KGM，優(yōu)點是無需飼養(yǎng)層細(xì)胞、培養(yǎng)方法簡便易行；一種用鼠成纖維

3、細(xì)胞系(NIH3T3)或者鼠胚胎成纖維細(xì)胞作飼養(yǎng)層，角質(zhì)細(xì)胞鋪在絲裂霉素C處理過的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，優(yōu)點是培養(yǎng)基含血清和高鈣，細(xì)胞生長快傳代方便，缺點是細(xì)胞更容易分化，傳代次數(shù)低于3次。體外構(gòu)建人工皮膚：最初用飼養(yǎng)層來構(gòu)建二維共培養(yǎng)模型，缺點是形成的皮膚壽命短，不能形成幾層有序的角質(zhì)層。其次將角質(zhì)細(xì)胞種植于膠原包埋的成纖維細(xì)胞上，浸沒培養(yǎng)7 d，隨后氣提培養(yǎng)獲得人工皮膚，這一方法存在皮膚構(gòu)建過程中膠原降解、膠原易收縮的缺點。目前已有研究采用3D 打印人工皮膚，不過存在成本高、成功率不高、皮膚表皮層不能分化為多層等缺陷。摘要背景：已有研究采用3D打印人工皮膚，但存在皮膚表皮層不能分化為多層等缺

4、陷。目的：優(yōu)化人工皮膚的構(gòu)建方法，獲得更好的人工皮膚。方法：從牛尾和鼠尾中分別提取與純化膠原。從兒童包皮組織中分離培養(yǎng)原代成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞，再以牛尾(或鼠尾)膠原包埋成纖維細(xì)胞，構(gòu)建真皮層；將角質(zhì)細(xì)胞接種于含鼠尾(或牛尾)膠原包埋的成纖維細(xì)胞上培養(yǎng) 7 d，再氣提培養(yǎng)7 d，獲得人工皮膚。觀察人工皮膚的收縮性、水接觸角，并進(jìn)行蘇木精-伊紅染色、天狼猩紅染色及免疫熒光染色。結(jié)果與結(jié)論：鼠尾膠原構(gòu)建人工皮膚真皮層面積下降了50%，牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚真皮層面積只下降了21%；牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚的接觸角與人皮膚接近，比鼠尾膠原構(gòu)建人工皮膚的疏水性更好；天狼猩紅染色結(jié)果顯示，與鼠尾膠原構(gòu)建的人工

5、皮膚相比，牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚的膠原折光性更強(qiáng)，膠原排列更有序，纖維更粗；蘇木精-伊紅染色顯示，與鼠尾膠原構(gòu)建人工皮膚相比，牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚真皮層的表皮可形成更多層；結(jié)果表明，將角質(zhì)細(xì)胞接種于牛尾膠原包埋的成纖維細(xì)胞上，可構(gòu)建更好的人工皮膚。關(guān)鍵詞：組織構(gòu)建；組織工程；人工皮膚；角質(zhì)細(xì)胞；成纖維細(xì)胞；膠原；細(xì)胞角蛋白14；飼養(yǎng)層；表皮；國家自然科學(xué)基金主題詞：皮膚，人工；成纖維細(xì)胞；膠原；組織工程基金資助：國家自然科學(xué)基金(21476197)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Artificial skin preparation using

6、three-dimensional printing in vitro Liu Yu, Shen Chong, Meng Qin (School of Chemical Engineering and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang Province, China)AbstractBACKGROUND: Epidermis is unable to differentiate into stratum corneum and other parts in the previous ar

7、tificial skin constructed using three-dimensional printing.OBJECTIVE: To optimize the method of artificial skin construction to obtain more feasible artificial skin. METHODS: Type I collagen extracted from rat-tail and bovine tail was purified. Primary dermal fibroblasts and keratinocytes were isola

8、ted from childrens foreskin, and then embedded in bovine or rat tail collage to construct the dermis; keratinocytes were seeded on the dermis for 7 days, followed by 7-day air liquid interface, and the artificial skin was finally achieved. The contraction and hydrophobicity by water contact angle we

9、re detected, as well as the morphology was observed by hematoxylin-eosin staining, sirius red staining and immunofluorescence analysis.RESULTS AND CONCLUSION: Seven days after fibroblasts embedded in collagen, the area of bovine collagen was reduced by 21%, while that of rat tail collagen decreased

10、about a half. The water contact angle of the skin constructed by bovine tail collagen was similar to that of human skin, which was much higher than that of the skin constructed by rat tail collagen. Sirius red staining found that the skin constructed by bovine tail collagen had stronger refractivity

11、, more intact structure and thicker fibers than those of the skin constructed by rat tail collagen. Moreover, more multilayer keratinocytes appeared in the skin constructed by bovine tail collagen through hematoxylin-eosin staining. In conclusion, bovine tail collagen is more available for the artif

12、icial skin construction.Subject headings: Skin, Artificial; Fibroblasts; Collagen; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 21476197Cite this article: Liu Y, Shen C, Meng Q. Artificial skin preparation using three-dimensional printing in vitro. Zhongguo Zuzhi

13、Gongcheng Yanjiu. 2016;20(46):6915-6921.Liu Yu, Master, School of Chemical Engineering and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang Province, ChinaCorresponding author: Meng Qin, Professor, School of Chemical Engineering and Biological Engineering, Zhejiang University,

14、Hangzhou 310027, Zhejiang Province, China6921ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction皮膚是人體最大的器官，也是體內(nèi)和外界的屏障，它包含表皮層和真皮層2部分1，其中表皮包括基質(zhì)層、棘層、肉芽層、角質(zhì)層；目前燒傷、外科手術(shù)皮膚缺損，慢愈性皮膚病急需新的皮膚替代物，而且皮膚替代物在皮膚病的藥物研究中發(fā)揮重要作用，由于人體真實皮膚模型不可行，動物模型不能針對性代表藥物對人體皮膚的作用，體外構(gòu)建優(yōu)良的人工皮膚具有重大意義。目前，文獻(xiàn)已構(gòu)建了一系列的皮膚替代物體外模型。最初用飼養(yǎng)層來構(gòu)

15、建二維共培養(yǎng)模型，缺點是形成的皮膚壽命短，不能形成幾層有序的角質(zhì)層細(xì)胞2-3。其次將角質(zhì)細(xì)胞種植于膠原包埋的成纖維細(xì)胞上，浸沒培養(yǎng)7 d，隨后氣提培養(yǎng)獲得人工皮膚，這一方法存在皮膚構(gòu)建過程中膠原降解、膠原易收縮的缺點。目前已有研究采用3D打印人工皮膚，不過存在成本高、成功率不高、皮膚表皮層不能分化為多層等缺陷4-5。實驗擬將原代角質(zhì)細(xì)胞接種于包埋有成纖維細(xì)胞的膠原基質(zhì)層，待角質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)增成多層進(jìn)行氣提培養(yǎng)，構(gòu)建人工皮膚6；分別采用牛尾膠原和鼠尾膠原包埋成纖維細(xì)胞，構(gòu)建真皮層，再將角質(zhì)細(xì)胞接種其上，待角質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)增成多層后氣提培養(yǎng)7 d，比較兩種皮膚的收縮性、膠原束組成及組織形態(tài)。此人工皮膚不僅可用

16、于燒傷患者的皮膚移植，還可以作為新藥評價體外模型，充實了人工皮膚的構(gòu)建新方法。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計 3D人工皮膚的體外構(gòu)建。1.2 時間及地點 實驗于2014年10月至2016年3月在浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院聯(lián)合反應(yīng)所完成。1.3 材料 經(jīng)倫理委員會和供者家屬同意，自浙江大學(xué)兒童附屬醫(yī)院門診手術(shù)室獲取1例年齡小于10歲患兒的包皮皮膚，大小約長5 cm×寬1 cm。3D人工皮膚體外構(gòu)建實驗的主要試劑：試劑來源Dispase中性蛋白酶Roche型膠原酶、DMEM粉末、F12粉末、霍亂毒素、三碘甲狀腺原氨酸、胰島素、乙醇胺、磷酸乙醇

17、胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白Sigma無鈣DMEM粉末上?？ㄟ~舒生物科技公司氫化可的松、腺嘌呤、胰蛋白酶、孕酮上海生物工程有限公司胎牛血清gibco人表皮生長因子peprotech絲裂霉素CmerckCK1、Collagen 武漢博士德生物科技公司CK14、P63、IgG-FITC Invitrogen1.4 實驗方法 人包皮成纖維細(xì)胞及角質(zhì)細(xì)胞的分離：將新鮮的環(huán)切包皮放置在PBS中，在超凈工作臺去除皮下脂肪，經(jīng)含500 U/mL青鏈霉素雙抗的PBS漂洗3次，去除殘余的血液與脂肪，以眼科剪將皮膚塊剪成5 mm2大小的皮片，在含2.5 U/mL中性蛋白酶的HBSS中4 過夜，消化18 h；次日用鑷子揭去表皮層，

18、將表皮層放置在含有少許PBS的培養(yǎng)皿中，用于分離角質(zhì)細(xì)胞，剩下的真皮組織用PBS清洗2次，洗去殘余的角質(zhì)細(xì)胞，真皮層用于分離成纖維細(xì)胞，方法參考文獻(xiàn)7。人包皮成纖維細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)：將真皮剪碎，用10 mL 0.1% 型膠原酶振蕩消化1.0-2.0 h，消化液用200目濾網(wǎng)過濾，離心得到的細(xì)胞沉淀重懸，計數(shù)，在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至90%融合時用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA進(jìn)行13傳代。將得到的表皮用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化15 min，在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的角質(zhì)培養(yǎng)基中終止消化，用200目的濾網(wǎng)過濾，

19、離心重懸，將細(xì)胞接種在預(yù)鋪有飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿，角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基用經(jīng)典的改良的Greens的培養(yǎng)基8，即31 DMEM/F12、含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、氫化可的松0.4 mg/L、人表皮生長因子 10 µg/L、霍亂毒素10-10 mol/L、胰島素5 mg/L、青鏈霉素100 U/mL，角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)在絲裂霉素C處理的原代成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上；角質(zhì)細(xì)胞在飼養(yǎng)層上長成克隆，約長至80%融合，用0.02%EDTA作用20 s，接著0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA孵育15 s，去除飼養(yǎng)層后，追加0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA繼續(xù)消化，不超過 15 min，傳代細(xì)胞培養(yǎng)在預(yù)鋪有飼養(yǎng)層

20、的培養(yǎng)瓶中，具體方法參考文獻(xiàn)9。飼養(yǎng)層的準(zhǔn)備：待人皮膚成纖維細(xì)胞融合，用含10 mg/L絲裂霉素C的培養(yǎng)基在37 培養(yǎng)2 h，消化重新接種至50%融合，飼養(yǎng)層貼壁后半融合對角質(zhì)細(xì)胞的克隆生長最優(yōu)9。角質(zhì)細(xì)胞的鑒定：將角質(zhì)細(xì)胞以2×108 L-1的細(xì)胞濃度接種入24孔板，待細(xì)胞長至約80%融合時，將細(xì)胞孔用PBS洗3遍，40 g/L多聚甲醛4 固定過夜，PBS清洗3×2 min，用0.5%曲拉通孵育30 min，用PBS清洗3次× 2 min，再用含5%BSA的PBS封閉1 h，然后分別滴細(xì)胞角蛋白14(11 000)和角質(zhì)細(xì)胞核蛋白p63(11 000)，4 過夜

21、，次日用PBS清洗3×5 min，加入帶有熒光標(biāo)記的二抗，放在室溫孵育1 h，然后用PBS清洗3×5 min，接著DAPI避光染色細(xì)胞核5 min，然后用PBS洗3次，熒光顯微鏡下觀察并照相10-12。膠原提取與純化：型鼠尾膠原提取經(jīng)Rajan等13報道的方法改進(jìn)獲得：從鼠尾中提取膠原絲并剪碎，用1%乙酸溶解3 d，離心除去未溶解部分，溶解部分經(jīng)等體積10%NaCl鹽析，5 000 r/min離心獲得粗提膠原凝膠，再將獲得的膠原重新溶解在0.1%乙酸中，可獲得純度較高的膠原溶液；牛尾膠原提取參考文獻(xiàn)14-15報道的方法：從牛尾中提取牛尾膠原絲，剪碎，用1%乙酸和含0.2%胃

22、蛋白酶混合液溶解浸泡膠原3 d，離心除去未溶解部分，溶解部分經(jīng)等體積10%NaCl鹽析 5 000 r/min離心獲得粗提膠原凝膠，再將獲得的膠原重新溶解在0.1%乙酸中，可獲得純度較高的膠原溶液，純化用SDS-PAGE電泳分析純度16。3D人工皮膚的構(gòu)建：將角質(zhì)細(xì)胞種植在膠原包埋成纖維細(xì)胞收縮而成的真皮層上，待角質(zhì)長至多層，氣提培養(yǎng)7 d，分化成含基質(zhì)層、棘層、肉芽層，角質(zhì)層的人工皮膚，方法參考文獻(xiàn)8。首先構(gòu)建真皮層，在每個淺孔transwell孔先鋪一層非細(xì)胞膠原層，待成纖維細(xì)胞融合后胰酶消化，以終濃度2×109 L-1加至膠原溶液中，按表1順序依次加，將混合物在冰上混合均勻，取

23、3 mL加至淺孔transwell中的內(nèi)孔，培養(yǎng)箱孵育30 min；膠原凝固后，將2 mL培養(yǎng)基加至淺孔transwell中的內(nèi)孔，3 mL加至外面的孔，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d左右，膠原和細(xì)胞一起收縮成穩(wěn)定大小的真皮層，第8天，成纖維細(xì)胞膠原層收縮完全，角質(zhì)細(xì)胞加至真皮層的中央，加50 µL濃度1×1010 L-1的原代角質(zhì)細(xì)胞至真皮層的中心，不加任何培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中2 h，待角質(zhì)貼壁后，第9-11天2 mL EPi培養(yǎng)基加至transwell的內(nèi)孔，3mL加至外孔。第12-15天，將2 mL EPi培養(yǎng)基加至淺孔transwell的內(nèi)孔，3 mL加至孔中，第15-21天，

24、氣提培養(yǎng)，將10 mL角質(zhì)培養(yǎng)基加至深孔transwell的外孔，第21天收獲皮膚。培養(yǎng)基成分與文獻(xiàn)8相同。表1 兩種膠原層的各成分Table 1 Components of the two kinds of collagens成分非細(xì)胞膠原層(每孔1 mL)細(xì)胞膠原基質(zhì)層(每孔3 mL)10×DMEM0.59 mL1.65 mL谷氨酰胺0.05 mL0.15 mLFBS0.6 mL1.8 mL5 mol/L NaOH0.02 mL0.06 mL3 g/mL膠原4.6 mL14 mL人原代成纖維細(xì)胞-1 mL(細(xì)胞濃度2×109 L-1)總體積6 mL18 mL1.5 主要

25、觀察指標(biāo)蘇木精-伊紅染色：氣提培養(yǎng)完成，取出皮膚，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗1遍，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%、100%乙醇脫水，體積分?jǐn)?shù)50%乙醇-二甲苯、純二甲苯、純二甲苯透明、過夜浸泡在石蠟中，第2天石蠟包埋，切 8 m薄片，蘇木精-伊紅染色，用干性樹膠封固，顯微鏡下觀察皮膚形態(tài)。免疫熒光染色：石蠟切片同蘇木精-伊紅染色中切片步驟，切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，體積分?jǐn)?shù)5%山羊血清封閉，孵育10 min，加適當(dāng)比例稀釋的一抗(角蛋白CK1、CK14、型膠原蛋白)，4 過夜，PBS洗3次，每次5 min，加適當(dāng)比例的二抗(避光)

26、，DAPI染核，免疫熒光顯微鏡下觀察。天狼猩紅染色：切片經(jīng)脫蠟，入水，直接泡在天狼猩紅染料1 h，純乙醇洗2次，二甲苯中10 min，封固，在偏振顯微鏡中觀察，可以看出膠原的類型及含量17。接觸角測量：將表面平整的人工皮膚在接觸角測量儀上進(jìn)行接觸角測試，將3 L去離子水垂直滴在皮膚壓片上，在液滴接觸皮膚表面后第0，10秒采集圖片樣本，切線法讀出接觸角18。2 結(jié)果 Results 2.1 成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的分離 新鮮分離的原代成纖維細(xì)胞貼壁后6 d之內(nèi)可以長融合，呈明顯的旋渦狀纖維細(xì)胞樣生長，見圖1A；角質(zhì)細(xì)胞需要9-14 d才能長至融合，形態(tài)呈鋪路石狀，見圖1B。圖1 兒童包皮分離的成纖

27、維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞形態(tài)(×100)Figure 1 Morphology of fibroblasts and keratinocytes isolated from childrens foreskin (×100)圖注：圖中A為成纖維細(xì)胞，旋渦狀形態(tài)生長；B為角質(zhì)細(xì)胞，呈鋪路石形態(tài)生長。2.2 角質(zhì)細(xì)胞鑒定結(jié)果 P63是一個角質(zhì)細(xì)胞特有的轉(zhuǎn)錄核因子，在表皮形成過程扮演雙重的角色，其不僅作為角質(zhì)細(xì)胞角質(zhì)化形成上皮的開關(guān)，也維持基質(zhì)層角質(zhì)細(xì)胞的增殖能力，P63的表達(dá)最初在表皮的基質(zhì)層發(fā)現(xiàn)19，CK14是基質(zhì)層細(xì)胞(具備活躍增殖能力的角質(zhì)細(xì)胞)表達(dá)的角蛋白?；|(zhì)層角質(zhì)細(xì)胞特異性

28、表達(dá)角蛋白CK14和P6320-21，免疫熒光鑒定結(jié)果表示細(xì)胞角蛋白CK14與P63陽性，從而鑒定出該細(xì)胞為基質(zhì)層角質(zhì)細(xì)胞，其具有活躍增殖能力，見圖2。圖2 角質(zhì)細(xì)胞的免疫熒光鑒定結(jié)果(×100)Figure 2 Identification of keratinocytes (immunofluorescence staining, x100)圖注：圖中A顯示，細(xì)胞含有角質(zhì)特異性角蛋白K14角蛋白；B顯示，細(xì)胞含有角質(zhì)特異性角蛋白P63角蛋白(×100)。2.3 牛尾膠原和鼠尾膠原包埋成纖維細(xì)胞的皮膚收縮性比較 牛尾與鼠尾膠原包埋成纖維細(xì)胞做基質(zhì)層構(gòu)建皮膚，兩者收縮有明顯

29、差異，氣體培養(yǎng)7 d后，鼠尾膠原構(gòu)建人工皮膚大小收縮至原來面積的一半，牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚僅縮小了原來面積的21%，見圖3。圖3 牛尾與鼠尾膠原構(gòu)建人工皮膚的收縮性比較Figure 3 Comparison of the contraction of artificial skin established bovine tail collagen or rat tail collagen120100806040200皮膚面積(%)0 10 20 30時間(d)牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚鼠尾膠原構(gòu)建人工皮膚鼠尾 牛尾 2.4 牛尾與鼠尾膠原構(gòu)建人工皮膚接觸角的比較 將表面平整的人工皮膚在接觸角測量儀上

30、進(jìn)行接觸角測試，發(fā)現(xiàn)牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚的接觸角與豬皮和人皮膚接近，而鼠尾膠原構(gòu)建人工皮膚水接觸角很小，見表2。表2 不同來源皮膚的接觸角Table 2 The contact angle of skins from different samples樣品皮膚來源接觸角豬皮腹部41.5°成人皮膚樣品(浙江大學(xué)兒童附屬醫(yī)院提供)手指78.5°手臂75°人工皮膚牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚49°鼠尾膠原構(gòu)建人工皮膚< 10°2.5 3D人工皮膚的組織形態(tài)學(xué)觀察蘇木精-伊紅染色結(jié)果：可見完整的真皮層與完整的表皮層，在牛尾膠原基質(zhì)上的角質(zhì)細(xì)胞長成更多層，

31、可見角質(zhì)細(xì)胞在牛尾膠原基質(zhì)上生長更好，見圖4。天狼猩紅染色結(jié)果：牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚真皮層的膠原折光性更強(qiáng)，膠原排列更有序，纖維更粗；鼠尾膠原構(gòu)建人工皮膚真皮層膠原折光性偏弱，膠原排列疏松，纖維更細(xì)，推測其與兩者在收縮性上的差異有關(guān)，見圖5。圖4 不同膠原構(gòu)建人工皮膚的蘇木精-伊紅染色結(jié)果(×100)Figure 4 Hematoxylin-eosin staining of the artificial skin constructed with different collagens (×100)圖注：圖中A為牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚，可見含基質(zhì)層、棘層、肉芽層、角化層的完

32、整表皮；B為鼠尾膠原構(gòu)建人工皮膚，表皮層只有2層，基質(zhì)層和角化層。圖5 不同膠原構(gòu)建人工皮膚的石蠟切片天狼猩紅染色結(jié)果(×50)Figure 5 Paraffin sections of the artificial skin constructed with different collagens (sirius red staining, ×50)圖注：圖中A為牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚，型膠原排列緊密，纖維粗；B為鼠尾膠原構(gòu)建人工皮膚，膠原排列疏松，纖維細(xì)。2.6 3D人工皮膚組織的免疫熒光染色觀察 將牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚組織進(jìn)行角蛋白CK14、CK1、型膠原免疫熒光學(xué)染色

33、，其中CK14可表征皮膚的基質(zhì)層，CK1可顯示上面的肉芽層和角化層，型膠原可現(xiàn)實真皮層與表皮層的連接部位基層，見圖6。圖6 牛尾膠原構(gòu)建人工皮膚的免疫熒光染色(×100)Figure 6 Immunofluorescence staining of the artificial skin constructed by bovine tail collagen (×100)圖注：圖中A為角質(zhì)細(xì)胞角蛋白CK14陽性表達(dá)，位于表皮基質(zhì)層；B為角質(zhì)細(xì)胞角蛋白CK1陽性表達(dá)，位于表皮的棘層與肉芽層；C為型膠原陽性表達(dá)，位于表皮與真皮結(jié)合處。3 討論 Discussion能否構(gòu)建完整的

34、分化多層的皮膚，成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的增殖能力至關(guān)重要。不少文獻(xiàn)在分離表皮與真皮用胰酶消化，處理效果并不好22。實驗分別用胰酶和中性蛋白酶消化皮膚塊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶處理過的皮膚表皮與真皮很容易分開，比胰酶處理的效果好(數(shù)據(jù)未在結(jié)果中顯示)。這是因為中性蛋白酶只破壞真皮與表皮分界層的半橋粒，不會分解細(xì)胞與細(xì)胞間的橋粒，可將完整的表皮從真皮剝離，分離得到的原代角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞都很少混雜其他細(xì)胞，細(xì)胞活率更強(qiáng)，生長也更好。角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)目前有2種方法，一種用特定的無血清培養(yǎng)基23，如M199，F(xiàn)12，MCDB15324、KSFM25、KGM26，優(yōu)點是無需飼養(yǎng)層細(xì)胞、培養(yǎng)方法簡便易行；一種用鼠

35、成纖維細(xì)胞系(NIH3T3)或者鼠胚胎成纖維細(xì)胞作飼養(yǎng)層，角質(zhì)細(xì)胞鋪在絲裂霉素C處理過的飼養(yǎng)層上7，優(yōu)點是培養(yǎng)基含血清而且高鈣，細(xì)胞生長快傳代方便，缺點是細(xì)胞更容易分化，傳代次數(shù)低于3次。鑒于無血清培養(yǎng)基價格昂貴，實驗采用經(jīng)典的飼養(yǎng)層培養(yǎng)法，用原代成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，擴(kuò)增角質(zhì)，而不是用常用的3T3或鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層。另外有研究比較不同飼養(yǎng)層接種密度的角質(zhì)克隆情況，結(jié)果證明了角質(zhì)細(xì)胞與飼養(yǎng)層11接種，角質(zhì)細(xì)胞生長速度與克隆大小最理想9。實驗驗證了飼養(yǎng)層的密度對于角質(zhì)細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)以1×108 L-1最佳，即飼養(yǎng)層貼壁后半融合狀態(tài)，飼養(yǎng)層與角質(zhì)細(xì)胞11接種培養(yǎng)最利于角質(zhì)

36、細(xì)胞的克隆生長。Lam等27發(fā)現(xiàn)用異體成纖維作飼養(yǎng)層和自體成纖維細(xì)胞作飼養(yǎng)層可獲得一樣的好效果，但是Rheinwald等28發(fā)現(xiàn)3T3飼養(yǎng)層細(xì)胞比人成纖維細(xì)胞更有助于人角質(zhì)細(xì)胞的生長，然而也有報道結(jié)論相反。有研究發(fā)現(xiàn)角質(zhì)生長在原代皮膚成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上比在NIH3T3飼養(yǎng)層上生長狀態(tài)更好，克隆更大，支持了部分文獻(xiàn)的結(jié)論29。型膠原是一種天然的生物可降解材料，雖然膠原的理化性質(zhì)較差，存在力學(xué)強(qiáng)度低、易收縮、易降解等缺點30，但具有良好的生物學(xué)性能，被廣泛用于組織工程支架、基質(zhì)材料31，已在臨床多個領(lǐng)域得到應(yīng)用，如可吸收縫合線、人工皮膚。膠原由、鏈組成的單聚體和二聚體組成32，在透射電鏡下，膠原由

37、相互交織的膠原原纖維組成，有規(guī)則的橫紋存在33，鼠尾型膠原的纖維絲直徑280 m，牛型膠原和鼠尾型膠原在透射電鏡下結(jié)構(gòu)類似，牛尾膠原纖維絲的直徑和鼠尾膠原略有不同，在5-15 nm范圍差異不等34。人工皮膚的真皮層往往收縮很嚴(yán)重，甚至收縮至原來面積20%35。其收縮受多種因素影響36，如細(xì)胞密度、膠原濃度、血清等，有研究用不降解支架和成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建3D人工皮膚37，但是基于膠原可以通過調(diào)節(jié)pH溫度自行凝固而不需添加交聯(lián)劑的優(yōu)點，膠原包埋成纖維細(xì)胞作為真皮層應(yīng)用廣泛。實驗發(fā)現(xiàn)與鼠尾膠原相比，牛尾膠原收縮會明顯降低，角質(zhì)細(xì)胞分別接種在這2種真皮層，牛尾膠原、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建

38、的皮膚更大，可更好解決皮膚移植時皮膚量不足的問題，牛尾膠原構(gòu)建的皮膚收縮性比鼠尾膠原小，猜測這與膠原性質(zhì)有關(guān)，如膠原纖維粗細(xì)、膠原凝膠支架的孔隙。細(xì)胞在這兩種膠原基質(zhì)中的生長能力也會影響膠原的收縮，文獻(xiàn)15發(fā)現(xiàn)兩種膠原支架的孔隙相差不大，均由、鏈組成，人牙齦成纖維細(xì)胞在鼠尾膠原支架上的生長增殖能力優(yōu)于牛尾膠原支架，這可能導(dǎo)致牛尾膠原支架收縮顯著下降。通過蘇木精-伊紅染色觀察構(gòu)建的人工皮膚，可在顯微鏡中看到包含完整真皮與表皮層的皮膚，上層是表皮層，下層是真皮層，表皮層比真皮層薄，與文獻(xiàn)38報道的結(jié)果基本一致，牛尾型膠原構(gòu)建真皮層的表皮可形成更多層。免疫熒光染色分析構(gòu)建的人工皮膚，結(jié)果與文獻(xiàn)38-

39、40基本一致。天狼猩紅染料與膠原分子結(jié)合，長軸平行，可在偏振纖維鏡下加強(qiáng)雙折射，且與不同類型膠原結(jié)合，顏色會不一，可特異性的表征膠原類型，定位膠原及膠原粗細(xì)，被廣泛用于組織中膠原形態(tài)觀察及組織纖維化、組織病變形態(tài)觀察17，41，天狼猩紅染色比馬松三色染色效果更好。天狼猩紅染色結(jié)果顯示，與鼠尾膠原構(gòu)建的皮膚相比，牛尾型膠原構(gòu)建的皮膚真皮層膠原折光性更強(qiáng)，膠原排列更有序，纖維更粗，由此推測這和角質(zhì)細(xì)胞的增殖分化相關(guān)，牛尾膠原基質(zhì)更有利于角質(zhì)的增殖分化，從而長成更多層皮膚。實驗構(gòu)建的人工皮膚包含成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞，可用于臨床移植皮膚，也可用于皮膚病的治療，人工皮膚替代物可加快慢性愈合如糖尿病足廯的

40、治療，但由于缺少血管內(nèi)皮細(xì)胞，造成傷口血管新生延遲，不利于傷口處的皮膚再生。因此可構(gòu)建出含成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞的人工皮膚，將成纖維細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞包埋在牛膠原，構(gòu)建真皮層，角質(zhì)接種在真皮層，最終氣提培養(yǎng)得到完整的人工皮膚。結(jié)論：用絲裂霉素C處理的原代成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層比NIH3T3飼養(yǎng)層更有利于角質(zhì)細(xì)胞的生長，而且飼養(yǎng)層的接種細(xì)胞濃度為1×108 L-1時，原代角質(zhì)細(xì)胞的生長及克隆效率最優(yōu)，且比無血清條件下的原代角質(zhì)細(xì)胞生長快，成本低；實驗分別采用牛尾型膠原和鼠尾型膠原構(gòu)建3D人工皮膚，發(fā)現(xiàn)牛尾膠原構(gòu)建的皮膚收縮性更小，皮膚組織形態(tài)疏水性均和人體皮膚接近，從而可獲得

41、更好的皮膚，降低皮膚生產(chǎn)的成本。作者貢獻(xiàn)：通訊作者進(jìn)行實驗設(shè)計，第一作者實施評估，結(jié)果分析，成文，審校。利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。倫理問題：皮膚供者家屬對實驗知情同意。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)進(jìn)行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者對研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機(jī)數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻(xiàn) References1 Bouwstr

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