HRP標記抗體原理及方法戊二醛二步法和過碘酸鈉法

1、HRP標記抗體原理及方法（戊二醛二步法和過碘酸鈉法）酶標記物包括酶標記抗原、酶標記抗體和酶標記SPA等。酶標記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱為關(guān)鍵的試劑。酶標記物中最常用的是酶標記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當方法連接而成。酶標記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質(zhì)量的酶（如辣根過氧化物酶，簡稱HRP）國內(nèi)已有商品供應(yīng)。高質(zhì)量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡便易行的方法。（一）酶制劑及其底物凡無毒性又能呈現(xiàn)有色化學反應(yīng)的酶，原則上均可作為標記用。但

2、作為標記抗體用的酶應(yīng)滿足下列要求：（1）來源方便，易于純化;（2）比活性高，性質(zhì)穩(wěn)定;(3)酶活性和量能用簡單方法測定。目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和磴性磷酸酶(AP),其次還有葡萄糖氧化酶，B-半乳糖昔酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。由于辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵嚇咻結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個同功酶組成，分子量為40,000，等電點為PH39,酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左

3、右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸鏤溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm,一般以O(shè)D403nm/OD275nm的比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右(最高可達3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度并不表示酶活性，如當酶變性后，RZ值仍可不變。HRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)o供氫體多為無色的還原型染料，通過反應(yīng)可生成有色的氧化型染料（D）o酶促反應(yīng)的過程如下：HRPDH2+H2O2>DH2O供氫體的種類很多，形成的產(chǎn)物特點不一。如DAB（3.3-二氨基聯(lián)苯胺）的反

4、應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度,故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。5AS（5-氨基水楊酸）早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現(xiàn)已很少應(yīng)用。OT（鄰聯(lián)甲苯胺）的特點是能產(chǎn)生鮮艷的藍綠色產(chǎn)物且靈敏度較高，但反應(yīng)中受溫度影響較大，而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在短時間內(nèi)進行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD（鄰苯二胺）和TMB（四甲基聯(lián)苯胺）o前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無色，靈敏度上據(jù)報道后者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱ABTS2,2'-邊氮基-雙（3-乙基苯并曝叱咯咻-

5、6磺酸）,其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應(yīng)中使用的H2O2不能過量。應(yīng)控制在經(jīng)較短時間反應(yīng)后呈色即達高峰(說明H2O2已消耗殆盡)。這樣即使再延長時間也不會增加反應(yīng)產(chǎn)物顏色。(二)HRP標記抗體的方法酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種，根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對于制備HRP結(jié)物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法更為常用。戊二醛二步法1,原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合

6、物。2.標記步驟：(1)稱取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。(2) 反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)SephadexG-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1分鐘,收集棕色流由液。如體積大于5ml,則以PEG濃縮至5ml放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。(3) 將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml,攪拌下逐滴加入酶溶液中。(4) 用1MPH9.5碳酸緩沖液0.25ml,繼續(xù)攪拌3?小時。(5) 加0.2M賴氨酸0.25ml,混勻后，置室溫2小時。(6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸鏤，置4cl小時。(7) 3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸鏤洗二

7、次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。(8)將上述溶液裝入透析袋中，對0.15MPH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除鏤離子后(用蔡氏試劑檢測),10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。3.結(jié)果判定:（1）定性及效價滴定：用特異性抗原（或抗體）同酶標記抗體（或抗免疫球蛋白抗體）作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA法（或在正式實驗系統(tǒng)里）對酶結(jié)合物進行滴定（見本節(jié)（三）工作濃度的選擇）。（2）定量和克分子比值測定：可用分光光度計測定（光程1cm）。酶量（mg/ml）=OD403nm&

8、lt;0.4IgG束(mg/ml)=OD280nm-OD403nm<0.42)X0.94X0.62酶量(mg/ml)IgG量(mg/ml)酶量克分子比值=(3)本法標記步驟比較簡單，重復(fù)性好。缺點是酶的利用率低，一般只有24%的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。4,試劑及器材：(1) 0.1MPH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS):取0.2MNa2HPO449ml,0.2MNaH2PO451ml,NaCl1.8克，加蒸儲水至200ml。(2) 1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。(3) 1MPH9.5碳酸鹽緩沖液：取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。(4) 0.2M

9、賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶于0.01MPH9.5碳酸緩沖液1ml中。(5) 0.15MPH7.4PBS及生理鹽水。(6) PH7.8飽和硫酸鏤溶液及半飽和硫酸鏤溶液。(7) 蔡氏試劑及聚乙二醇(PEG,MW2000)o(8)純化的特異性抗體或抗Ig抗體。(9) HRP(RZ&gt;3.0)。(10) SephadexG-25層析柱(2cmx50cm)。(11)攪拌器，分光光度計，離心機。(12)透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。簡易過碘酸鈉法本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結(jié)合，所獲酶標記抗體的產(chǎn)率高，將近70%的HRP和Ig結(jié)合，99

10、%的Ig與酶結(jié)合，酶與Ig的活性無重大損失，是目前最常用的方法。1 .原理：經(jīng)典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的a-和£氨基基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP,從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏磴，后者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標記抗體。2 .標記步驟：(1) 稱取5mgHRP溶解于1ml蒸播水中。1mMPH4.4的醋酸(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。(3)將上述溶液裝入透析袋中

11、，對鈉緩沖液透析，4c過夜。(4) 加20以l0.2MPH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化？RP的PH升高到9.09.5,然后立即加入10mgIgG（抗體，或SPA5mg）在1ml0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。（5）力口0.1ml新配的4mg/mlNaBH4液，混勻，再置4C2小時。（6）將上述液裝入透析袋中，對0.15MPH7.4PBS透析，4c過夜。其余步驟（純化）同戊二醛標記步驟的（6）、（7）、（8）。3 .結(jié)果判定：除標記物IgG量的計算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nnX0.3)x0.62.試劑及器材：(1)

12、 0.1MNalO4:稱取241mg高碘酸鈉(廣州化學試劑廠，批號830602)溶于蒸儲水10ml中。(2) 1mMPH4.4醋酸鈉緩沖液：0.2MNaAc(1.361克/50ml)3.7ml0.2MHAc(0.601ml/50ml)6.3ml加蒸播水至2,000mlo0.2MPH9.5碳酸鹽緩沖液：Na2CO30.32克NaHCO30.586克加蒸儲水至50ml再用蒸儲水作20倍稀釋，即成0.01MPH9.5的碳酸鹽緩沖液。(3) NaBH4溶液（4mg/ml）:臨用時稱取NaBH44mg溶于1ml蒸儲水中。（5）其它的試劑及器材可參見戊二醛標記法。（三）工作濃度的選擇在免疫酶技術(shù)中，首先要

13、確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化，便可導(dǎo)致試驗結(jié)果產(chǎn)生很大的波動。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應(yīng)增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。酶標記抗體的滴定方法是：將抗原（或抗體）物理吸附于固相載體上，然后將經(jīng)過一系列稀釋的酶標抗體（或抗Ig抗體）與吸附在載體上的抗原（或抗體）起反應(yīng)，以酶與底物的顯色反應(yīng)程度來確定酶標記抗體的效價，或稱工作濃度。其步驟為：先將抗原（或抗體）用0.05MPH9.6包被緩沖液稀釋為10以g/ml左右，于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1ml,4c過夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標記抗體用1%BSA-PB

14、S液依次稀釋成1：100,1：200,1:400,1：800,1：1600?（根據(jù)據(jù)抗體的滴度而定），分別加入反應(yīng)孔中，每個稀釋度二孔，每孔0.1ml,37c孵育1小時后洗滌。然后加底物液，每孔0.1ml,37c1030分鐘。以2MH2SO40.05ml終止反應(yīng)。結(jié)果判定主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值。并以O(shè)D為縱座標，結(jié)合物濃度為橫座標，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率最大時的酶標抗體稀釋度，即為該標記物的工作濃度。有關(guān)試驗的試劑及器材均見ELISA部分。要說明的是，本法為ELISA直接法，所測的工作濃度與在實際應(yīng)用中的最適濃度可相差幾個滴度。這就要求在建立ELISA實驗系統(tǒng)中,因此基礎(chǔ)上還應(yīng)進一步確定實際工作濃度（可采用方陣法），以達到最適的實驗條件（四）注意事項1 .在具備高質(zhì)量HRP的條件下，所要標記的抗體也要活性高，效價高（最低1：16）,純度高，親和力好，這是保證標記物效價高，免