柳枝稷生產(chǎn)燃料乙醇小試工藝研究

1、半纖維素預(yù)處理工藝與乙醇發(fā)酵研究摘要：在利用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇的過(guò)程中，為了有效提高原料中半纖維素成分的利用率，節(jié)約生產(chǎn)成本，進(jìn)行了稀硫酸預(yù)處理預(yù)處理小試工藝研究。本實(shí)驗(yàn)室利用自行設(shè)計(jì)定做的2L小型高溫高壓耐酸反應(yīng)釜對(duì)柳枝稷稀硫酸預(yù)處理工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定在反應(yīng)器可達(dá)到的范圍內(nèi)最優(yōu)反應(yīng)溫度為140，最適稀硫酸濃度為2%，最適液固比為8：1。稀酸水解液中葡萄糖和木糖總濃度為35.3g/L,其中木糖24.7g/L,葡萄糖10.6g/L。利用本實(shí)驗(yàn)室菌種樹(shù)干畢赤酵母Y7進(jìn)行稀酸水解液乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，84小時(shí)內(nèi)木糖和葡萄糖被全部利用完，其中葡萄糖12小時(shí)用完，木糖84小時(shí)用完，最終乙醇濃

2、度為15.3g/L,占理論值產(chǎn)量的86.4%。本研究結(jié)果表明，稀酸水解可以有效提高木質(zhì)纖維素原料中半纖維素成分的利用。 關(guān)鍵詞：預(yù)處理；稀硫酸；水解液發(fā)酵；柳枝稷；樹(shù)干畢赤酵母Y70引言目前，國(guó)內(nèi)外利用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇普遍采用的基本工藝流程是原料的預(yù)處理、預(yù)處理產(chǎn)物的酶解和乙醇發(fā)酵與蒸餾三步法。其中原料預(yù)處理方法的好壞對(duì)原料的中半纖維素利用、纖維素酶解效率和乙醇發(fā)酵效果具有直接影響。國(guó)內(nèi)外報(bào)道的木質(zhì)纖維原料預(yù)處理的方法主要有物理法，化學(xué)法，物理化學(xué)法，生物法等幾大類。其中，稀酸水解預(yù)處理以其工藝簡(jiǎn)單、成本低、效率高等諸多優(yōu)勢(shì)被越來(lái)越廣泛的研究和應(yīng)用。木質(zhì)纖維素的預(yù)處理主要通過(guò)一些物理

3、方法或者化學(xué)方法等對(duì)原料進(jìn)行處理，使木質(zhì)纖維素原料的整體結(jié)構(gòu)更加松散，更加利于酶的接觸與反應(yīng)。同時(shí)，在預(yù)處理過(guò)程中木質(zhì)素也被物理或化學(xué)等方法有效解離，使纖維素成分的保護(hù)結(jié)構(gòu)被打破，更利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行。但是這些預(yù)處理方法中存在一個(gè)越來(lái)越不能被忽視的問(wèn)題就是原料中的半纖維素成分無(wú)法被回收利用。半纖維素是戊糖(木糖、阿拉伯糖)、己糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)和糖酸所組成的不均一聚糖，為異質(zhì)多糖，結(jié)構(gòu)與纖維素不同。木聚糖是含量最多的一類半纖維素1。半纖維素對(duì)溫度，催化劑等的敏感性大于纖維素，在一定的物理或者化學(xué)等條件下比纖維素更加容易被水解。比如在蒸汽爆破預(yù)處理中，半纖維素在預(yù)處理過(guò)程中大量被水解成

4、木糖等可被微生物利用的糖，但這部分糖在預(yù)處理產(chǎn)物的水洗過(guò)程中混雜在水洗液中，很難被回收。在NaOH浸泡預(yù)處理中，半纖維素成分水解出的糖滯留在強(qiáng)堿性廢液中，也很難被回收。 為了解決半纖維素回收利用中存在的問(wèn)題，越來(lái)越多條件相對(duì)溫和的預(yù)處理方法被廣泛研究和利用，稀硫酸預(yù)處理就是其中最有代表性的方法之一。利用稀硫酸進(jìn)行預(yù)處理可以有效的將半纖維素中的糖提取出來(lái)，而且稀硫酸預(yù)處理后的液體中含有的糖調(diào)過(guò)pH后可以直接被微生物利用。有研究報(bào)道在預(yù)處理的條件為100、水解6 h、固液比1：25，4稀硫酸條件下半纖維的提取率為51%。張宇昊等發(fā)現(xiàn)用稀酸預(yù)處理可將半纖維素有效轉(zhuǎn)化為單糖，而剩余的纖維素成分可用纖維

5、素酶將其水解為小分子糖。 利用玉米秸稈在15%固體含量、0.5%的H2S04濃度、121、1 h條件下，先將半纖維素進(jìn)行水解，然后用酶解法提取預(yù)處理產(chǎn)物中的小分子糖，糖回收率可以達(dá)到85%。本研究以能源草柳枝稷為原料，在反應(yīng)釜中利用稀硫酸高溫蒸煮的方法提取木質(zhì)纖維素原料中半纖維素成分中的可利用糖，旨在建立一種可以簡(jiǎn)單高效利用半纖維素的方法。通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)反應(yīng)溫度、稀硫酸濃度、固液比三個(gè)因素對(duì)半纖維素水解的影響進(jìn)行了分析，尋找最佳的工藝參數(shù)，并利用本實(shí)驗(yàn)室的乙醇發(fā)酵菌種樹(shù)干畢赤酵母Y7對(duì)水解液進(jìn)行乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究水解產(chǎn)物利用的可行性。實(shí)驗(yàn)證明，改方法可以有效回收和利用木質(zhì)纖維素原料中的半纖維素成分

6、，提高原料的利用率。1 材料與方法11 菌種樹(shù)干畢赤酵母Y7（Pichia. stipitis Y7）由首都師范大學(xué)微生物學(xué)系保藏，該菌種能夠同時(shí)代謝木糖和葡萄糖，并且具有高抑制劑耐受性。12 原料粉碎柳枝稷樣品由北京市農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究中心提供，樣品含纖維素30%，半纖維素25.5%，其他45.5%。自然晾干后，利用小型粉碎機(jī)粉碎，過(guò)30目篩。13 木質(zhì)纖維素稀酸水解131 反應(yīng)釜本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器是從威海新元化工機(jī)械公司定制的耐酸高溫高壓反應(yīng)釜，最大裝量2L，最高反應(yīng)溫150，最高攪拌速率6000rpm。132 裝量反應(yīng)釜最大裝量為2L。本批實(shí)驗(yàn)中，每次實(shí)驗(yàn)裝入液體1.5L，固體量按照實(shí)驗(yàn)設(shè)定的

7、液固比添加。133 反應(yīng)條件溫度梯度：110；120；130；140。硫酸濃度梯度：1%（v/v）；2%；3%；4%；5%。固液比梯度：1：2（w/v）；1：4；1：6；1：8；1：10；1：12；1：14。反應(yīng)時(shí)間：60min。14 水解液處理與培養(yǎng)基配制稀酸水解液用NaOH固體調(diào)價(jià)pH值至中性，然后加入2%（w/v）蛋白胨和1%（w/v）酵母浸粉。在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)115滅菌30min。15 乙醇發(fā)酵151 接種物制備將斜面保藏的菌種接種于100ml培養(yǎng)基中，30 、150rpm樹(shù)干畢赤酵母Y7培養(yǎng)12h。在不同三角瓶中轉(zhuǎn)接三次。種子液細(xì)胞干重為3.0g/L。接種時(shí)1000rmp離心10m

8、in取菌泥，接種量為10%。152 發(fā)酵條件控制在額定裝量2L的小型發(fā)酵罐上進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵溫度30 ，pH值控制在4.5-5.5，攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，裝量1.5L。定時(shí)取樣，測(cè)定測(cè)定乙醇產(chǎn)量和殘?zhí)橇俊?6 分析方法161 糖濃度測(cè)定樣品經(jīng)0.12m微型過(guò)濾器過(guò)濾,用高效液相色譜儀(Highliquid chromatography HPLC，Waters 2690)測(cè)定樣品中葡萄糖和木糖的含量。測(cè)定條件：氨柱(200 ×46mm)，柱溫40，waters410視差測(cè)器，流動(dòng)相已腈：水=85：15，進(jìn)樣量20L.162 乙醇含量測(cè)定樣品經(jīng)0.12m微型過(guò)濾器過(guò)濾,用SP-342

9、0 氣相色譜測(cè)定乙醇含量。測(cè)定條件:柱溫80 ,注射室溫度150 ,檢測(cè)器溫度50 ,進(jìn)樣量0.5L 。17計(jì)算方法高效液相色譜和氣相色譜的計(jì)算方法均采用樣品峰面積與標(biāo)準(zhǔn)峰面積相比較獲得。 乙醇含量的計(jì)算方法:X = ( S1 ×C)/S2 ×100 %式中, X 樣品中乙醇含量, g/L ; S1 樣品峰面積; C 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度g/L; S2 標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積。乙醇生成率計(jì)算公式:X = C1/( C2 ×0.51) ×100 %式中, X 乙醇生成率; C1 測(cè)得的乙醇含量;C2 消耗糖的量g/L2 結(jié)果與討論21 硫酸濃度對(duì)水解液中糖濃度的影響在14

10、0，固液比為1：8的條件下研究了硫酸濃度對(duì)水解液中木糖和葡萄糖濃度的影響。從圖1中可以看出，木糖濃度在1%硫酸濃度時(shí)最高，最高糖濃度為25.6g/L，并隨著硫酸濃度的升高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。葡萄糖濃度隨硫酸濃度的增加呈上升趨勢(shì)，在5%硫酸濃度時(shí)達(dá)到最大為11.9 g/L。隨著酸濃度的增加木糖濃度下降，主要原因是由于硫酸濃度的增加導(dǎo)致了木糖的氧化分解加劇。而葡萄糖濃度之所以升高則是由于隨著酸濃度的增加木質(zhì)纖維素中的纖維素水解程度增加，所以水解液中葡萄糖的含量升高。所以根據(jù)經(jīng)濟(jì)性和回收率的綜合考慮，最適酸濃度為2%。圖1 硫酸濃度對(duì)水解液中糖含量的影響Fig1 Glucose fermentation

11、of Y5？22 反應(yīng)溫度對(duì)水解液中糖濃度的影響從圖2中可以隨著溫度的升高，水解液中的木糖濃度逐漸上升。在2%硫酸濃度條件下，木糖濃度在140達(dá)到最高為24.7g/L。通過(guò)2%與3%硫酸濃度比較發(fā)現(xiàn)，二者最終的木糖量相差不大，這表明在2%硫酸濃度下，原料中的半纖維素成分已經(jīng)得到比較充分的水解，所以不再隨硫酸濃度的增加而增加。從圖3可以看出，隨著溫度的升高，水解液中葡萄糖濃度逐漸上升，在2%硫酸濃度條件下，葡萄糖濃度在140為10.6g/L。葡萄糖濃度在2%與3%硫酸濃度條件下依然相差不大。從以上結(jié)果可以看出，在反應(yīng)釜可以達(dá)到的溫度范圍內(nèi)，最適反應(yīng)溫度為140。圖2 溫度對(duì)水解液中木糖含量的影響

12、圖3 溫度對(duì)水解液中葡萄糖含量的影響23 固液比對(duì)水解液中糖濃度的影響圖4顯示的是，隨著固液比的提高，水解液中木糖和葡萄糖糖濃度的變化規(guī)律。隨著固液比的提高，稀酸水解液中木糖的濃度呈上升趨勢(shì)。在固液比為1：4時(shí)木糖濃度達(dá)到最高為26.2g/L。隨著固液比的提高，葡萄糖的濃度呈下降趨勢(shì)，即當(dāng)反應(yīng)體系中的含水量減少，水解液中葡萄糖的濃度隨之降低。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)體系中液體的絕對(duì)量越大，水解出的糖的總量就越高。圖5顯示了，以1：14固液比時(shí)水解液中糖的質(zhì)量為基準(zhǔn)，各固液比反應(yīng)體系中水解出糖量的相對(duì)值。在固液比為1：12、1：10、1：8、1：6、1：4時(shí)，水解出的木糖總質(zhì)量分別是固液比1：14時(shí)水解液

13、中木糖總質(zhì)量的97.50%、94.80%、93.72%、72.40%、49.60%，水解出的葡萄糖的總質(zhì)量分別是固液比1：14時(shí)水解液中葡萄糖總質(zhì)量的92.16%、70.33%、67.05%、55.81%、20.90%。因此，兼顧經(jīng)濟(jì)性和總體回收率的考慮，反應(yīng)體系的最適的固液比為1：8。從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，木糖和葡萄糖在稀酸水解的過(guò)程中對(duì)水都有一定的依賴性，而且葡萄糖水解對(duì)水的依賴性大于木糖，理論上來(lái)講，反應(yīng)體系中的液體量越大，對(duì)糖的水解反應(yīng)越有利。但是，如果固液比過(guò)低，會(huì)造成反應(yīng)體系運(yùn)行效率低，也會(huì)造成后續(xù)工藝成本的大幅度提高。圖4 固液比對(duì)水解液中糖濃度的影響圖5 不同固液比中糖回收率（以固液比1：14時(shí)糖量為基準(zhǔn)）24 未