柳枝稷生產燃料乙醇小試工藝研究

1、半纖維素預處理工藝與乙醇發(fā)酵研究摘要：在利用木質纖維素原料生產燃料乙醇的過程中，為了有效提高原料中半纖維素成分的利用率，節(jié)約生產成本，進行了稀硫酸預處理預處理小試工藝研究。本實驗室利用自行設計定做的2L小型高溫高壓耐酸反應釜對柳枝稷稀硫酸預處理工藝條件進行了優(yōu)化，最終確定在反應器可達到的范圍內最優(yōu)反應溫度為140，最適稀硫酸濃度為2%，最適液固比為8：1。稀酸水解液中葡萄糖和木糖總濃度為35.3g/L,其中木糖24.7g/L,葡萄糖10.6g/L。利用本實驗室菌種樹干畢赤酵母Y7進行稀酸水解液乙醇發(fā)酵實驗，84小時內木糖和葡萄糖被全部利用完，其中葡萄糖12小時用完，木糖84小時用完，最終乙醇濃

2、度為15.3g/L,占理論值產量的86.4%。本研究結果表明，稀酸水解可以有效提高木質纖維素原料中半纖維素成分的利用。 關鍵詞：預處理；稀硫酸；水解液發(fā)酵；柳枝稷；樹干畢赤酵母Y70引言目前，國內外利用木質纖維素原料生產燃料乙醇普遍采用的基本工藝流程是原料的預處理、預處理產物的酶解和乙醇發(fā)酵與蒸餾三步法。其中原料預處理方法的好壞對原料的中半纖維素利用、纖維素酶解效率和乙醇發(fā)酵效果具有直接影響。國內外報道的木質纖維原料預處理的方法主要有物理法，化學法，物理化學法，生物法等幾大類。其中，稀酸水解預處理以其工藝簡單、成本低、效率高等諸多優(yōu)勢被越來越廣泛的研究和應用。木質纖維素的預處理主要通過一些物理

3、方法或者化學方法等對原料進行處理，使木質纖維素原料的整體結構更加松散，更加利于酶的接觸與反應。同時，在預處理過程中木質素也被物理或化學等方法有效解離，使纖維素成分的保護結構被打破，更利于酶解反應的進行。但是這些預處理方法中存在一個越來越不能被忽視的問題就是原料中的半纖維素成分無法被回收利用。半纖維素是戊糖(木糖、阿拉伯糖)、己糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖)和糖酸所組成的不均一聚糖，為異質多糖，結構與纖維素不同。木聚糖是含量最多的一類半纖維素1。半纖維素對溫度，催化劑等的敏感性大于纖維素，在一定的物理或者化學等條件下比纖維素更加容易被水解。比如在蒸汽爆破預處理中，半纖維素在預處理過程中大量被水解成

4、木糖等可被微生物利用的糖，但這部分糖在預處理產物的水洗過程中混雜在水洗液中，很難被回收。在NaOH浸泡預處理中，半纖維素成分水解出的糖滯留在強堿性廢液中，也很難被回收。 為了解決半纖維素回收利用中存在的問題，越來越多條件相對溫和的預處理方法被廣泛研究和利用，稀硫酸預處理就是其中最有代表性的方法之一。利用稀硫酸進行預處理可以有效的將半纖維素中的糖提取出來，而且稀硫酸預處理后的液體中含有的糖調過pH后可以直接被微生物利用。有研究報道在預處理的條件為100、水解6 h、固液比1：25，4稀硫酸條件下半纖維的提取率為51%。張宇昊等發(fā)現用稀酸預處理可將半纖維素有效轉化為單糖，而剩余的纖維素成分可用纖維

5、素酶將其水解為小分子糖。 利用玉米秸稈在15%固體含量、0.5%的H2S04濃度、121、1 h條件下，先將半纖維素進行水解，然后用酶解法提取預處理產物中的小分子糖，糖回收率可以達到85%。本研究以能源草柳枝稷為原料，在反應釜中利用稀硫酸高溫蒸煮的方法提取木質纖維素原料中半纖維素成分中的可利用糖，旨在建立一種可以簡單高效利用半纖維素的方法。通過實驗對反應溫度、稀硫酸濃度、固液比三個因素對半纖維素水解的影響進行了分析，尋找最佳的工藝參數，并利用本實驗室的乙醇發(fā)酵菌種樹干畢赤酵母Y7對水解液進行乙醇發(fā)酵實驗，研究水解產物利用的可行性。實驗證明，改方法可以有效回收和利用木質纖維素原料中的半纖維素成分

6、，提高原料的利用率。1 材料與方法11 菌種樹干畢赤酵母Y7（Pichia. stipitis Y7）由首都師范大學微生物學系保藏，該菌種能夠同時代謝木糖和葡萄糖，并且具有高抑制劑耐受性。12 原料粉碎柳枝稷樣品由北京市農業(yè)科學院草業(yè)研究中心提供，樣品含纖維素30%，半纖維素25.5%，其他45.5%。自然晾干后，利用小型粉碎機粉碎，過30目篩。13 木質纖維素稀酸水解131 反應釜本實驗反應器是從威海新元化工機械公司定制的耐酸高溫高壓反應釜，最大裝量2L，最高反應溫150，最高攪拌速率6000rpm。132 裝量反應釜最大裝量為2L。本批實驗中，每次實驗裝入液體1.5L，固體量按照實驗設定的

7、液固比添加。133 反應條件溫度梯度：110；120；130；140。硫酸濃度梯度：1%（v/v）；2%；3%；4%；5%。固液比梯度：1：2（w/v）；1：4；1：6；1：8；1：10；1：12；1：14。反應時間：60min。14 水解液處理與培養(yǎng)基配制稀酸水解液用NaOH固體調價pH值至中性，然后加入2%（w/v）蛋白胨和1%（w/v）酵母浸粉。在高壓蒸汽滅菌鍋內115滅菌30min。15 乙醇發(fā)酵151 接種物制備將斜面保藏的菌種接種于100ml培養(yǎng)基中，30 、150rpm樹干畢赤酵母Y7培養(yǎng)12h。在不同三角瓶中轉接三次。種子液細胞干重為3.0g/L。接種時1000rmp離心10m

8、in取菌泥，接種量為10%。152 發(fā)酵條件控制在額定裝量2L的小型發(fā)酵罐上進行發(fā)酵實驗。發(fā)酵溫度30 ，pH值控制在4.5-5.5，攪拌轉速為300rpm，裝量1.5L。定時取樣，測定測定乙醇產量和殘?zhí)橇俊?6 分析方法161 糖濃度測定樣品經0.12m微型過濾器過濾,用高效液相色譜儀(Highliquid chromatography HPLC，Waters 2690)測定樣品中葡萄糖和木糖的含量。測定條件：氨柱(200 ×46mm)，柱溫40，waters410視差測器，流動相已腈：水=85：15，進樣量20L.162 乙醇含量測定樣品經0.12m微型過濾器過濾,用SP-342

9、0 氣相色譜測定乙醇含量。測定條件:柱溫80 ,注射室溫度150 ,檢測器溫度50 ,進樣量0.5L 。17計算方法高效液相色譜和氣相色譜的計算方法均采用樣品峰面積與標準峰面積相比較獲得。 乙醇含量的計算方法:X = ( S1 ×C)/S2 ×100 %式中, X 樣品中乙醇含量, g/L ; S1 樣品峰面積; C 標準溶液濃度g/L; S2 標準溶液峰面積。乙醇生成率計算公式:X = C1/( C2 ×0.51) ×100 %式中, X 乙醇生成率; C1 測得的乙醇含量;C2 消耗糖的量g/L2 結果與討論21 硫酸濃度對水解液中糖濃度的影響在14

10、0，固液比為1：8的條件下研究了硫酸濃度對水解液中木糖和葡萄糖濃度的影響。從圖1中可以看出，木糖濃度在1%硫酸濃度時最高，最高糖濃度為25.6g/L，并隨著硫酸濃度的升高呈現下降趨勢。葡萄糖濃度隨硫酸濃度的增加呈上升趨勢，在5%硫酸濃度時達到最大為11.9 g/L。隨著酸濃度的增加木糖濃度下降，主要原因是由于硫酸濃度的增加導致了木糖的氧化分解加劇。而葡萄糖濃度之所以升高則是由于隨著酸濃度的增加木質纖維素中的纖維素水解程度增加，所以水解液中葡萄糖的含量升高。所以根據經濟性和回收率的綜合考慮，最適酸濃度為2%。圖1 硫酸濃度對水解液中糖含量的影響Fig1 Glucose fermentation

11、of Y5？22 反應溫度對水解液中糖濃度的影響從圖2中可以隨著溫度的升高，水解液中的木糖濃度逐漸上升。在2%硫酸濃度條件下，木糖濃度在140達到最高為24.7g/L。通過2%與3%硫酸濃度比較發(fā)現，二者最終的木糖量相差不大，這表明在2%硫酸濃度下，原料中的半纖維素成分已經得到比較充分的水解，所以不再隨硫酸濃度的增加而增加。從圖3可以看出，隨著溫度的升高，水解液中葡萄糖濃度逐漸上升，在2%硫酸濃度條件下，葡萄糖濃度在140為10.6g/L。葡萄糖濃度在2%與3%硫酸濃度條件下依然相差不大。從以上結果可以看出，在反應釜可以達到的溫度范圍內，最適反應溫度為140。圖2 溫度對水解液中木糖含量的影響

12、圖3 溫度對水解液中葡萄糖含量的影響23 固液比對水解液中糖濃度的影響圖4顯示的是，隨著固液比的提高，水解液中木糖和葡萄糖糖濃度的變化規(guī)律。隨著固液比的提高，稀酸水解液中木糖的濃度呈上升趨勢。在固液比為1：4時木糖濃度達到最高為26.2g/L。隨著固液比的提高，葡萄糖的濃度呈下降趨勢，即當反應體系中的含水量減少，水解液中葡萄糖的濃度隨之降低。實驗發(fā)現，反應體系中液體的絕對量越大，水解出的糖的總量就越高。圖5顯示了，以1：14固液比時水解液中糖的質量為基準，各固液比反應體系中水解出糖量的相對值。在固液比為1：12、1：10、1：8、1：6、1：4時，水解出的木糖總質量分別是固液比1：14時水解液

13、中木糖總質量的97.50%、94.80%、93.72%、72.40%、49.60%，水解出的葡萄糖的總質量分別是固液比1：14時水解液中葡萄糖總質量的92.16%、70.33%、67.05%、55.81%、20.90%。因此，兼顧經濟性和總體回收率的考慮，反應體系的最適的固液比為1：8。從以上實驗結果可以看出，木糖和葡萄糖在稀酸水解的過程中對水都有一定的依賴性，而且葡萄糖水解對水的依賴性大于木糖，理論上來講，反應體系中的液體量越大，對糖的水解反應越有利。但是，如果固液比過低，會造成反應體系運行效率低，也會造成后續(xù)工藝成本的大幅度提高。圖4 固液比對水解液中糖濃度的影響圖5 不同固液比中糖回收率（以固液比1：14時糖量為基準）24 未