微生物基本試驗原理及操作

1、.l碳源和氮源利用試驗 l碳水化合物的代謝試驗 l各種酶類試驗 l氨基酸和蛋白質代謝試驗 .l檸檬酸鹽試驗 l葡萄糖酸鹽試驗 .l原理：有些細菌能利用檸檬酸鹽作為唯一碳源，分解檸檬酸鈉生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基呈堿性。能利用檸檬酸鹽作唯一碳源的細菌，也能利用銨鹽作為唯一氮源，銨鹽被分解為氨而產生堿性。.l MgSO4-7H2O 0.2glNH4H2PO4 1glK2HPO4 1gl檸檬酸鈉 5gl氯化鈉 5gl瓊脂 20gl0.2%溴麝香草酚藍溶液 40mll蒸餾水 1000ml.結果：陽性者表面上長有菌落，培養(yǎng)基變?yōu)樗{色。 .l原理：檢查細菌是否具有氧化葡萄糖作為唯一碳源，并具有還原2-酮基葡萄糖

2、酸鹽與班氏試劑混合加熱生成黃紅色酮類的能力。.l方法：接種大量待檢菌于培養(yǎng)基內，35，24-48小時，0.5ml培養(yǎng)基加班氏試劑3滴左右，加熱煮沸后觀察結果。.l蛋白胨 0.15gl酵母浸膏 0.1gl磷酸二氫鉀 0.1gl葡萄糖酸鉀（或鈉）4gl蒸餾水 100ml.l結果：出現(xiàn)黃色到橙紅色沉淀為陽性，無顏色變化為陰性。 .l氧化-發(fā)酵試驗（OF試驗）l糖醇發(fā)酵試驗 lB半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗） l甲基紅試驗 lVP試驗 l 膽汁七葉苷試驗 .l 原理：細菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加的稱為氧化型；在無氧條件下降解葡萄糖的稱為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的細菌稱為產堿型。利用此試驗可以

3、區(qū)別細菌的代謝類型。.l蛋白胨 2gl磷酸氫2鉀0.3克l氯化鈉 5gl葡萄糖 10gl0.2%溴麝香酚藍溶液 12mll瓊脂 2.5gl蒸餾水 1000ml.l方法：將待檢菌接種于二支Hugh-Leifson培養(yǎng)基的試管中，均用接種針穿至管底，其中五支加入滅菌的液體石蠟約1厘米厚。35，培養(yǎng)48小時觀察結果。培養(yǎng)基顏色變黃即為產酸。.l 代謝類型 加蠟封口管 開放管l發(fā)酵型 產 酸 產 酸l氧化型 不變色 產 酸l產堿型 不變色 不變色l .l原理：各種細菌因含有發(fā)酵不同糖、醇類的酶，所以分解糖、醇類的能力各不相同。分解糖、醇類后產生的代謝產物可因菌種不同而異，有的產酸、產氣，有的僅產酸，故

4、用于鑒別細菌。.l蛋白胨水或肉膏湯 100mll所需的糖、醇或苷類 0.5或1gl1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 0.1ml.l 接種的細菌，若能耐分解培養(yǎng)基中的糖類產酸時，則使培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應。若產氣可使半固體培養(yǎng)基內或液體培養(yǎng)基中的倒管內出現(xiàn)氣泡。若不分解則無變化。.l原理：有的細菌可產生B-半乳糖苷酶，此酶可分解鄰-硝基酚-B-D-半乳糖苷（ONPG）。ONPG為無色，經B-半乳糖苷酶水解后，可產生黃色的鄰硝基酚，即使?jié)舛群艿鸵材軝z出。.l呈現(xiàn)黃色為陽性反應。迅速及遲緩分解乳糖的細菌ONPG試驗為陽性，本試驗可作為遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定方法。.l 原理：某些細菌在糖代謝過程中，分

5、解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸可進一步被分解為甲酸、乙酸、乳酸等，而使培養(yǎng)基的pH下降至4.5以下，加入甲基紅指示劑出現(xiàn)紅色（陽性）。 .l原理：有些細菌分解葡萄糖產酸量少，或產生的酸進一步轉化為其它物質（如醇、酮、醛、氣體和水），則培養(yǎng)基的酸堿度仍在6.2以上，故加入甲基紅指示劑呈黃色（陰性）。.l多價蛋白胨 7gl葡萄糖 5gl磷酸氫二鉀 5gl蒸餾水 1000ml . 方法：被檢菌接種于上述培養(yǎng)基內，于35培養(yǎng)48小時，于2ml培養(yǎng)液內加甲基紅指示劑2滴，立即觀察結果。.l結果：紅色為陽性；桔紅色為弱陽性；黃色為陰性。 .l原理：有些細菌在葡萄糖的代謝過程中生成丙酮酸，丙酮酸進一步脫羧后可產

6、生乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣的氧氧化為二乙酰（丁二酮），進而與培養(yǎng)基內蛋白胨中的精氨酸所含的胍基發(fā)生反應，生成紅色化合物，即VP反應陽性。培養(yǎng)基中的胍基太少時，加入少量含胍基的化合物，如肌酸或肌酸酐等，可加速此反應。 . 試劑：甲液：6%a-萘酚乙醇溶液 乙液：40%氫氧化鉀溶液.l方法：將被檢菌接種葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基后，于35培養(yǎng)48小時，于2ml培養(yǎng)基內加入甲液1ml和乙液0.4ml，振搖后觀察結果。.l結果：于數(shù)分鐘內呈紅色為陽性；如無紅色出現(xiàn)，而且于35中4小時后仍如故者即為陰性。本試驗較為敏感。.l原理：在10-14%膽汁存在下，測定細菌水解葡萄糖苷七葉苷為七葉亭

7、和葡萄糖的能力。.l 蛋白胨 5gl 牛肉浸膏 3gl 牛膽汁（膽汁）40gl 七葉苷 1gl 檸檬酸鐵 0.5gl 瓊脂 15gl 蒸餾水 1000ml.l結果：培養(yǎng)基變?yōu)楹谏蛏詈稚珵殛栃?。有生長物時，并不表示七葉苷裂解，僅表示膽汁濃度不能抑制D群鏈球菌外的細菌生長。.l過氧化氫酶（觸酶）試驗 l氧化酶試驗 l血漿凝固酶試驗 l硝酸鹽還原試驗l膽汁溶解試驗l環(huán)腺苷酸（cAMP）試驗 .l原理：有些細菌具有過氧化氫酶，能將過氧化氫酶分解為水。l試劑：3%過氧化氫溶液。.l方法：玻片法：用牙簽挑取1824小時培養(yǎng)的菌苔，置于潔凈的玻片上，滴加3%過氧化氫溶液12滴。試管法：取不含血液的1824

8、小時培養(yǎng)物一接種環(huán)于試管內，加入1ml 3%過氧化氫溶液。3%過氧化氫溶液應置于棕色瓶內冷藏。.l結果：產生大量氣泡為陽性，不產生氣泡為陰性。.l原理：凝固酶能凝固血漿纖維蛋白，是鑒定金黃色葡萄球菌的主要試驗。本試驗分玻片法和試管法，玻片法主要是檢測結合凝固酶，試管法是為了肯定玻片法試驗結果和對玻片法試驗陰性者進行復查，檢測游離凝固酶。.l原理：結合凝固酶為金黃色葡萄球菌細胞表面含有，游離凝固酶為金黃色葡萄球菌產生的一種胞外酶，兩酶均可作用于血漿中的纖維蛋白原，使其轉變?yōu)槔w維蛋白，形成凝塊。. 方法：l玻片法：在玻片上加一滴滅菌生理鹽水，取葡萄球菌18-24小時肉湯培養(yǎng)物一環(huán)，或挑取平板上一個

9、單個菌落制成濃菌懸液，再加一接種環(huán)新鮮人或兔血漿與菌懸液混勻。同時做陽性菌和陰性菌對照試驗，立刻觀察凝塊的形成。本試驗應先在生理鹽水中乳化，檢查有否自凝現(xiàn)象。防止出現(xiàn)假陽性結果。陽性結果一般在5-20秒內出現(xiàn)，若3-4分鐘后仍無凝固，可考慮為玻片法試驗陰性。 .l試管法：將潔凈小試管中加0.5ml未稀釋的人或兔血漿，加0.5ml培養(yǎng)18-24小時的葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物一滿環(huán)，或挑取平板上的純菌落，輕輕轉動（不要搖動）試管混勻。放35水浴中4小時，每隔30分鐘檢查一次有無凝固。檢查時不要振動或搖動試管，可輕輕將試管傾斜以觀察有無凝塊。大多數(shù)金黃色葡萄球株在354小時可以凝固血漿，如果陰性對照。枸椽

10、酸鹽抗凝的血漿可產生假陽性結果。 . 原理：某些細菌具有氧化酶，在有氧和細胞色素C時，使還原型細胞色素C氧化，氧化型細胞色素C再使二甲基對苯二胺氧化，產生玫瑰紅至暗紫色。有時菌落本身帶有紅色，不易觀察，可再加入a-萘酚乙醇溶液，使生成深藍色的靛酚藍。.l 試劑：l1 1%鹽酸二甲基對苯二胺（或四甲對苯二胺）水溶液l2 1%a-萘酚95%乙醇溶液.l 方法：取18-28小時的新鮮培養(yǎng)物，用無菌濾紙條，蘸取菌落少許，滴加1%鹽酸二甲基對苯二胺1-2滴，觀察結果。.l 結果：一分鐘內出現(xiàn)紫紅色為陽性。若菌落本身有色素，則再滴加a-奈酚1-2滴，出現(xiàn)藍色則為陽性。.l原理：硝酸鹽還原反應有兩個過程，其

11、一是硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，其二是繼續(xù)將亞硝酸鹽進一步分解為氨、氮、氧化氮等氣體終末產物。.l 蛋白胨 1gl 硝酸鉀 0.1gl 蒸餾水 100ml.l方法：將待檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，35培養(yǎng)1-4天，將甲、乙試劑各加0.1ml于試管內，混勻觀察結果 .l 結果：出現(xiàn)紅色為陽性。如無紅色出現(xiàn)，應加少量鋅粉，如仍無紅色說明亞硝酸鹽進一步分解成氮、氨等氣體，應判為陽性；如加鋅粉出現(xiàn)紅色，說明還原劑鋅粉使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，待檢菌無還原硝酸鹽的能力，為陰性。.l 原理：在特定時間和溫度條件下測定膽鹽溶解細菌的能力。溶菌的機理尚未定論，有人認為膽鹽或膽汁能激活肺炎鏈球菌的自溶酶，使菌體發(fā)生溶解。

12、.l試劑：10%去氧膽酸鈉溶液或牛膽汁 .l平板法：10%去氧膽酸鈉溶液一接種環(huán)，加于血瓊脂平板的試驗菌落上，置于35孵育30分鐘，肺炎鏈球菌菌落消失為陽性。陰性者菌落仍存在。.l 原理：B群鏈球菌（無乳鏈球菌）能產生一種因子（cAMP因子），這種因子在綿羊血或牛血培養(yǎng)基上與金黃色葡萄球菌-溶血素起協(xié)同作用，促進-溶血素的活性。因此在兩種細菌的交界處溶血力增加，出現(xiàn)箭頭形溶血區(qū)。.l方法：首先在羊血平板上接種一長條金黃色葡萄球菌（藥敏質控菌）再將被檢菌與金黃色葡萄球菌接種線垂直接種一短條，兩者不能相交，應相距3mm左右，同時在被檢菌接種線對側，用同樣方法接種陰性和對照菌，35培養(yǎng)過夜，如放在C

13、O2燭缸內結果更為好看（金黃色葡萄球菌用ATCC25923為佳）。.l結果：在被檢菌接種線與金黃色葡萄球菌接種線處出現(xiàn)一個矢狀加強溶血區(qū)，為CAMP陽性。陰性無加強溶血區(qū)。 .l吲哚試驗 l硫化氫試驗 l苯丙氨酸脫氨酶試驗 l氨基酸脫羧酶試驗（賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸） l脲酶試驗 l明膠液化試驗 .l原理：細菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚（靛基質），經與試劑 中的對二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈紅色。.l蛋白胨（或胰胨）10-20gl氯化鈉 5gl蒸餾水 1000ml. kovac氏試劑l對二甲氨基苯甲醛 10gl純戊醇 150mll純濃鹽酸 50mll 先將試劑溶于醇中，緩慢加入鹽酸

14、即成。 .l 方法：挑取純培養(yǎng)物接種蛋白胨水培養(yǎng)基，于35培養(yǎng)1-2天，沿管壁徐徐加入kovac氏試劑0.5ml，使成兩層，觀察結果。.l結果：在兩者液面交界處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性。.l原理：細菌分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）和含硫化物生成硫化氫，硫化氫遇鉛或鐵離子生成黑色的硫化物。由此間接地檢測細菌是否產生硫化氫。 .l培養(yǎng)基：三糖鐵培養(yǎng)基或克氏雙糖鐵培養(yǎng)基 .l結果：培養(yǎng)基黑為陽性，無變化為陰性。 .l原理：細菌產生苯丙氨酸脫氨酶，能使苯丙氨酸脫去氨基生成苯丙酮酸，苯丙酮酸與鐵離子作用生成綠色絡合物。.lDL苯丙氨酸 0.2g（L苯丙氨酸0.1g）l 酵母浸膏 0.3

15、gl 氯化鈉 0.5gl 磷酸氫二鈉 0.1gl 瓊脂 1.2gl 蒸餾水 100ml.l試劑： 10%三氯化鐵溶液：將10克三氯化鐵溶于100ml蒸餾水中即成。 .l方法：將待檢菌接種于培養(yǎng)基斜面上，35培養(yǎng)24小時，滴加三氯化鐵試劑，觀察結果。.l結果：培養(yǎng)基斜面上顯綠色為陽性，不變色為陰性。 .l原理：檢查細菌使氨基酸脫去羧基，生成胺類化合物，使培養(yǎng)基變堿的能力。 .l蛋白胨 5gl酵母浸膏 3gl葡萄糖 1gl6%溴甲酚紫灑精溶液 1mll蒸餾水 1000mll將上述成分溶于蒸餾水，然后加進所需氨基酸（賴氨酸，鳥氨酸、精氨酸），使其濃度為. 。對照管不加氨基酸 。.l方法：取待檢菌接種

16、于氨基酸脫羧培養(yǎng)基和對照管中，封滅菌液體石蠟，35培養(yǎng)24小時以上觀察結果。.l培養(yǎng)基pH應偏酸，有利于酶的形成。l加封液體石蠟造成厭氧環(huán)境，在厭氧環(huán)境下氨基酸脫羧生成的胺才穩(wěn)定，另外也可避免出現(xiàn)假陽性。 l如對照管不變色則不能判斷結果。 .l 結果：接種待檢菌的測定的培養(yǎng)基是紫色，對照管是黃色為陽性；兩管均是黃色為陰性。.l原理：某些細菌能產生脲酶。脲酶 可分解尿素，尿素經分解后產生大量的氨，使培養(yǎng)基變堿。.l蛋白胨 1gl氯化鈉 5gl葡萄糖 1glKH2PO4 2gl20%尿素水溶液 100mll瓊脂 15gl0.1%酚紅水溶液 12mll 蒸餾水 900ml.l方法：將被檢菌接種于尿素培養(yǎng)基后，置35培養(yǎng)18-24小時觀察結果。陰性應觀察4天。.l結果：細菌分解尿素后培養(yǎng)基變紅為陽性，不變?yōu)殛幮浴?l原理：明膠酶是細菌產生的一種胞外酶，能分解明膠為氨基酸，從而失去凝固力，使半固體的明膠培養(yǎng)基成為液體。 .l于普通瓊脂中加入1%明膠即成。 .l方法：將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，于20培養(yǎng)7天，逐日觀察明膠液化現(xiàn)象。l如室溫高培養(yǎng)基自行溶