第39章 基因工程及蛋白質(zhì)工程

1、第三十九章 基因工程及蛋白質(zhì)工程第一節(jié) DNA 克隆的基本原理基因克隆的技術(shù)路線大致包括以下幾個(gè)程序：分離制備待克隆的DNA 片段（目的DNA）；在體外連接目的DNA 片段和載體；重組DNA 分子轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞；篩選、鑒定陽性重組子；重組子的擴(kuò)增。一DNA 限制酶與連接酶類型限制酶為多亞基雙功能酶，S 亞基為識(shí)別亞基，識(shí)別位點(diǎn)為兩部分序列，中間有一定長度的任意堿基對，M 亞基有甲基化酶活性，R 亞基為切割亞基，可在識(shí)別位點(diǎn)1kb 以上處隨機(jī)切割。類型限制酶有兩個(gè)相同的亞基組成，識(shí)別位點(diǎn)為46bp 的回文序列，切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)，或靠近識(shí)別位點(diǎn)，經(jīng)切割可以生成平頭末端或粘性末端，可以產(chǎn)生相同粘性

2、末端的不同的限制酶稱作同尾酶。類型限制酶是分子生物學(xué)中最重要的工具酶。類型限制酶為兩個(gè)亞基的雙功能酶，M 亞基為識(shí)別亞基，R 亞基為切割亞基，切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)下游2426bp 處，特異性不強(qiáng)。EcoRI 與DNA 的復(fù)合體：外源DNA 可以被插入質(zhì)粒載體：限制性內(nèi)切酶切割DNA 形成對應(yīng)的粘性末端：使用相同的粘性末端進(jìn)行重組，會(huì)有較多的載體自身環(huán)化，或目的基因串聯(lián)，目的基因的定向連接常使用兩種限制酶，產(chǎn)生兩種不同的粘性末端?？梢栽谳d體和目的基因的兩端連接接頭（引入限制酶切點(diǎn)），或銜接物（含有粘性末端），再連接載體和目的基因。接頭用于建立克隆片斷的末端：大腸桿菌的連接酶只能連接粘性末端，T4

3、連接酶可以連接平頭末端，其條件是：提高T4 連接酶的濃度；提高DNA 片段的濃度；降低ATP 濃度；加入多胺類如亞精胺；加入濃縮劑如乙二醇。T4 連接酶催化的反應(yīng)：二分子克隆的載體與宿主系統(tǒng)1分子克隆的載體的基本條件能自主復(fù)制；具有一種或多種限制性內(nèi)切酶的單一切割位點(diǎn)，并在位點(diǎn)中插入外源基因后，不影響其復(fù)制功能；具有1-2 個(gè)篩選標(biāo)記；克隆載體必須是安全的，不應(yīng)含有對受體細(xì)胞有害的基因，并且不會(huì)任意轉(zhuǎn)入其他生物細(xì)胞；易于操作，轉(zhuǎn)化效率高?，F(xiàn)用的載體都是通過改造構(gòu)建而成的。宿主細(xì)胞的基本條件是：易于接受外源DNA；自身無限制酶和重組能力；易于生長和篩選；符合安全標(biāo)準(zhǔn)。pBR322 是由幾個(gè)質(zhì)粒D

4、NA 通過DNA 重組技術(shù)構(gòu)建而成的克隆載體，分子的長度為4363bp。具有氨芐青霉素和四環(huán)素兩種抗藥性標(biāo)記。pBR322 共有24 種限制性內(nèi)切酶的單一識(shí)別位點(diǎn)，其中7 種酶(ecoRV,NheI,BamHI,sphI,salI,Xma,Nru I)的識(shí)別位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，2 種酶(ClaI,Hind)的識(shí)別位點(diǎn)存在于這個(gè)基因的啟動(dòng)子內(nèi)部。所以在這9 個(gè)限制性位點(diǎn)上插入外源DNA 通常都會(huì)導(dǎo)致抗四環(huán)素基因(tetr)的失活。3 種酶(scaI,PvuI,PstI)在氨芐青霉素抗性基因(ampr)內(nèi)具單一的識(shí)別位點(diǎn)，在這3 個(gè)位點(diǎn)插入外源DNA 則會(huì)導(dǎo)致ampr 基因的失活。若將外源

5、基因插入tetr 基因，將構(gòu)成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入對四環(huán)素和氨芐青霉素均敏感的受體菌，則在含氨芐青霉素的平面培養(yǎng)基上生長，而在含四環(huán)素的平面培養(yǎng)基上不生長的菌落均含有外源基因。20 世紀(jì)70 年代早期主要利用天然質(zhì)粒，1977 年Bolivar 等構(gòu)建成功pBR322、1982 年Viera 和Messsing構(gòu)建成功pUC 系列質(zhì)粒，隨后有不少穿梭質(zhì)粒，表達(dá)質(zhì)粒等問世。2pUC 載體系列是由大腸桿菌pBR322 質(zhì)粒與M13 噬菌體改建而成的雙鏈DNA 質(zhì)粒載體，含有來自pBR322 質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)(ori)，氨芐青霉素抗性基因(ampr)以及大腸桿菌â 半乳糖苷酶基因(lacZ)的啟動(dòng)

6、子及其編碼肽鏈的基因，在lacZ 基因中有一個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)段。當(dāng)外源的DNA 片段插入到這些克隆位點(diǎn)使á 互補(bǔ)鏈破壞時(shí)，形成的是無活性的â-半乳糖苷酶，被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，在Xgal-IPTG 培養(yǎng)基上形成白色菌落，而沒有外源DNA 插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞后，在Xgal-IPTG 培養(yǎng)基上形成藍(lán)色菌落。pUC 質(zhì)粒載體比pBR322 具有更小的相對分子質(zhì)量，而且由于rop 基因的缺失(其基因產(chǎn)物ROP 蛋白，控制質(zhì)粒復(fù)制)，使得其拷貝數(shù)大增，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)500-700 個(gè)拷貝，因此由pUC 質(zhì)粒重組體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，可獲得高產(chǎn)量的克隆DNA 分子。pUC

7、18 和pUC19 的唯一差別是多克隆位點(diǎn)的方 向相反。Xgal(5 溴-4-氯-3-吲哚-â-D-半乳糖苷)可被â-半乳糖苷酶水解生成深蘭色的5-溴-4-靛蘭，IPTG(異丙基硫代â-D-半乳糖苷)可誘導(dǎo)â-半乳糖苷酶á-鏈的合成。適合于藍(lán)白選擇。3ë 噬菌體ë 噬菌體的基因組是長度約為50kb 的線性雙蓮DNA 分子。在其兩端，各有一條由12 個(gè)核苷酸組成的互補(bǔ)粘性末端。當(dāng)ë 噬菌體DNA 進(jìn)入寄主細(xì)胞后，線性DNA 分子通過粘性末端的堿基配對而結(jié)合，形成環(huán)狀DNA 分子。這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段為co

8、s 位點(diǎn)?，F(xiàn)用的ë 噬菌體載體都是在野生型基礎(chǔ)上改造而成的。改建之后的常用載體有兩類：插入型載體，具有一個(gè)可供外源DNA 插入的克隆位點(diǎn)，如ëgt10、ëgt11；替換型載體，具有成對的克隆位點(diǎn)，在兩個(gè)位點(diǎn)之間的ëDNA 區(qū)段可被外源插入的DNA 片段取代，如charon4、charon10、charon35。插入型載體只能插入較小的外源DNA 片段，而替換型載體能插入較大的外源DNA 片段（20-24kb 左右）。當(dāng)重組體DNA分子大于ë 噬菌體基因組105%或小于75%時(shí)，重組噬菌體的活力會(huì)大大下降，不能形成正常大小的噬菌斑，所以重組體DN

9、A 分子長度應(yīng)控制在包裝限度范圍內(nèi)。ë 噬菌體重組體分子不具有抗生素抗性選擇標(biāo)記，主要是依據(jù)噬菌斑的形態(tài)學(xué)特征和Xgal-IPTG 顯色反應(yīng)來篩選重組子。cI 基因的存在將使噬菌體進(jìn)入溶源狀態(tài)，因此在培養(yǎng)基上形成的是混濁型的噬菌斑。cI 基因失活或缺失的噬菌體在培養(yǎng)基上形成清亮型噬菌斑。根據(jù)這個(gè)形態(tài)學(xué)特征可篩選重組體分子。許多ë 載體，如charon2、ëgt11 含有編碼â 半乳糖苷酶基因lacZ（其中引入多克隆位點(diǎn)）。由這種載體感染的大腸桿菌lac-菌，涂布在含有IPTG 和Xgal 的培養(yǎng)基平板上，會(huì)形成藍(lán)色噬菌斑。當(dāng)外源DNA片段插入到這些克隆位

10、點(diǎn)時(shí)，寄主細(xì)胞就會(huì)在Xgal-IPTG 培養(yǎng)基上形成無色噬菌斑，如果在替換型載體的可替換區(qū)段含有l(wèi)acZ 基因序列，也會(huì)出現(xiàn)同樣結(jié)果。4Cosmid 質(zhì)粒黏粒載體本身長4-6kb，具有質(zhì)粒和ë 噬菌體兩種載體的性質(zhì)，能像質(zhì)粒一樣復(fù)制及轉(zhuǎn)化細(xì)菌，在細(xì)菌中其增殖與質(zhì)粒復(fù)制一樣，產(chǎn)生的重組子是菌落而不是噬菌斑，同時(shí)也具有ë 噬菌體的cos 位點(diǎn)，能與ë 噬菌體一樣在體外被包裝成病毒顆粒并感染宿主菌，但是由于在黏粒中克隆基因組文庫要比在ë 噬菌體中困難得多，只有在靶基因過大，不能作為單個(gè)DNA 區(qū)段在ë 噬菌體載體中克隆增殖，或者要分離一系列跨過染色體

11、DNA 特大區(qū)段的重疊克隆時(shí)，才使用黏粒載體。用于克隆大片段DNA 的 Cosmid 質(zhì)粒：5酵母人工染色體定向克?。簝蓚€(gè)粘性末端的序列不同，僅按照一個(gè)方向插入質(zhì)粒。三外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞外源基因?qū)朐思?xì)胞的常用方法有：轉(zhuǎn)染，即用冰冷的CaCl2 處理后瞬間加熱，將含有外源DNA的質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)的宿主細(xì)胞；轉(zhuǎn)化，即用噬菌體將外源DNA 導(dǎo)入感受態(tài)的宿主細(xì)胞；電穿孔法，即用脈沖高壓電瞬間擊穿細(xì)胞膜，將含有外源DNA 的質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞；ë 噬菌體的體外包裝，將含有外源DNA 的ë 噬菌體DNA 與外殼蛋白在體外包裝成噬菌體，可以大幅度提高轉(zhuǎn)化率，包裝蛋白有商品出售。外源基因

12、導(dǎo)入酵母細(xì)胞的常用方法有：用蝸牛消化酶消化細(xì)胞壁，制成原生質(zhì)體，再用CaCl2 和聚乙二醇處理，促進(jìn)重組DNA 的吸收。外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞的常用方法有：磷酸鈣共沉淀法；DEAE-葡聚糖或聚陽離子促進(jìn)吸收法；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法；電穿孔法；病毒轉(zhuǎn)染法；顯微注射法。外源基因?qū)胫参锛?xì)胞的常用方法有：用纖維素酶消化細(xì)胞壁，制成原生質(zhì)體，再用CaCl2 和聚乙二醇處理，促進(jìn)重組DNA 的吸收，也可使用電穿孔法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法；將外源DNA 插入Ti 質(zhì)粒的T-DNA，借助土壤農(nóng)桿菌將外源DNA 導(dǎo)入植物細(xì)胞；基因槍微彈射擊法；顯微注射法。四陽性克隆的篩選1快速裂解菌落鑒定分子大小從平板中直接挑取菌落裂解后，不

13、需要內(nèi)切酶消化，直接進(jìn)行凝膠電泳，與載體DNA 比較遷移率，初步判斷是否有插入片段存在，本方法適用于插入片段較大的重組子初步篩選。2內(nèi)切酶圖譜鑒定對于初步篩選鑒定具有重組子的菌落，應(yīng)小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體DNA，用相應(yīng)的內(nèi)切酶(1 種或2 種)切割重組子釋放出插入片段，對于可能存在雙向插入的重組子，還要用內(nèi)切酶消化鑒定插入方向，然后凝膠電泳檢測插入片段和載體的大小。3Southern 印跡雜交為了進(jìn)一步確定DNA 插入片段的正確性，在內(nèi)切酶消化重組子，凝膠電泳分離后，通過Southern 印跡轉(zhuǎn)移將DNA 移至硝酸纖維膜上，再用放射性核素或非放射性標(biāo)記的相應(yīng)外源DNA 片段作

14、為探針，進(jìn)行分子雜交，鑒定重組子中的插入片段是否是所需的靶基因片段。4PCR 篩選重組子一些載體的外源DNA 插入位點(diǎn)兩側(cè)，存在恒定的序列，用相應(yīng)的引物對小量抽提的質(zhì)粒DNA 進(jìn)行PCR 分析，不但可迅速擴(kuò)增插入片段，而且可以直接進(jìn)行DNA 順序分析。對于原核或真核系統(tǒng)表達(dá)型重組子，其插入片段的序列正確性是非常關(guān)鍵的，故有必要對重組子進(jìn)行序列測定，DNA 序列分析現(xiàn)多采用自動(dòng)測序儀完成。5菌落（或噬菌斑）原位雜交菌落或噬菌斑原位雜交技術(shù)是先將轉(zhuǎn)化菌直接鋪在硝酸纖維素薄膜或瓊脂平板上，再轉(zhuǎn)移到另一硝酸纖維素薄膜上，用核素標(biāo)記的特異DNA 或RNA 探針進(jìn)行分子雜交，然后挑選陽性克隆菌落。本方法能

15、進(jìn)行大規(guī)模操作，一次可篩選5×105-5×106 個(gè)菌落或噬菌斑，對于從基因文庫中挑選目的重組子，是一項(xiàng)首選的方法。典型的細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：第二節(jié) 基因的分離、合成和測序一目的基因的來源1基因組DNA 的非特異性斷裂超聲波處理基因組DNA 可得到300bp 左右的隨機(jī)片段，高速組織搗碎器，控制一定的條件也能得到不同大小的DNA 片段，如將高分子量DNA1500r/m 搗碎30 分鐘，可得到大約8kb 的DNA 片段。由機(jī)械處理產(chǎn)生的DNA 片段末端不一，斷點(diǎn)隨機(jī)，條件難以掌握，所以目前較少使用這種方法。2染色體DNA 的限制性內(nèi)切酶解型限制性內(nèi)切酶可專一識(shí)別并切割特定的DNA

16、順序，產(chǎn)生不同類型的DNA 末端。若載體DNA 與插入片段用同一種內(nèi)切酶消化，可以直接進(jìn)行連接。內(nèi)切酶識(shí)別的DNA 順序長短與降解后DNA 產(chǎn)生的片段大小有直接關(guān)系。若識(shí)別順序?yàn)? 個(gè)堿性對，則該順序在DNA 鏈上出現(xiàn)的機(jī)率為44，即在堿基隨機(jī)排列的前提下，每256 個(gè)堿基對就有一個(gè)切點(diǎn)。對于識(shí)別6 個(gè)核苷酸的限制性內(nèi)切酶，其順序出現(xiàn)的頻率為46(4096)，可獲得較大的DNA 片段，也可用于DNA 文庫的建立。3通過mRNA 合成cDNA基因組DNA中重復(fù)順序和假基因占有很大比重，克隆完整的基因比較困難。用mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，得到相應(yīng)的雙鏈cDNA，再進(jìn)行克隆，獲得較完整的連續(xù)編碼順序

17、，容易在宿主細(xì)胞中表達(dá)。除建立cDNA 文庫以外，對于一些高豐度表達(dá)、容易純化的蛋白質(zhì)，可以直接通過該蛋白質(zhì)的單克隆抗體純化該基因的核糖體，再分離該蛋白質(zhì)的特異mRNA，直接反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行基因克隆，從而直接獲得該特定基因的克隆，這是用染色體DNA 難以達(dá)到的克隆效果。4人工體外合成DNA 片段隨著體外合成DNA 的技術(shù)日漸完善，合成DNA 的長度不斷加長。一些小分子生物活性多肽，可以通過人工合成編碼順序插入載體后，轉(zhuǎn)化細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)。分子較大的基因，可以通過分段合成，然后連接組裝成完整的基因。目前已經(jīng)合成了人胰島素A、B 鏈基因和干擾素基因，并成功表達(dá)，制備成商業(yè)產(chǎn)品。5聚合酶鏈反應(yīng)（P

18、CR）擴(kuò)增特定基因片段對于有部分了解或完全清楚的基因，可以通過PCR 反應(yīng)，直接從染色體DNA 或cDNA 上高效快速地?cái)U(kuò)增出目的基因片段，然后進(jìn)行克隆操作。唯一的要求是，對基因片段兩側(cè)的序列了解清楚。二基因文庫的構(gòu)建克隆數(shù)目的估算公式為：N=ln(1-p)/ln(1-f)。P：任意基因存在于文庫中的概率；f：克隆DNA(bp)占基因組(bp)的分?jǐn)?shù)。三cDNA 文庫的構(gòu)建真核mRNA 的分離：逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：四克隆基因的分離與鑒定用克隆雜交對基因組文庫進(jìn)行篩選：用已知氨基酸序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針篩選文庫克隆基因：差別雜交：若A 組細(xì)胞用生長因子處理，B 組細(xì)胞不作處理，將其中的一組mRN

19、A 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA文庫，與另一組的mRNA 雜交，或?qū)山M的mRNA 均逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 再進(jìn)行分子雜交，不能形成雜交雙鏈的是二者差異表達(dá)的基因?？鄢s交：比差別雜交省時(shí)、省力、靈敏度高，基本原理如圖所示。用Southern 雜交法鑒定克隆基因：五聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增基因六篩選目的基因的其他方法蛋白質(zhì)組學(xué)：通過雙向電泳，聚焦層析-電泳等方法對比相關(guān)樣本，確定目標(biāo)蛋白，經(jīng)測序用遺傳密碼推測基因的部分序列，用PCR 等方法獲取目的基因；基因芯片：分析相關(guān)樣本的mRNA，確定目標(biāo)基因；mRNA 差異顯示：提取欲對比的兩個(gè)樣本的mRNA，分別用5T11-MN 或5-T12MN(M 代表除T以外的任意核

20、苷酸，N 代表任意核苷酸)共12 種不同的下游引物合成cDNA 的第一鏈，所得24 種cDNA的第一鏈均用通用引物合成第二鏈，并引入放射性同位素標(biāo)記，將相對應(yīng)的12 對cDNA 分別用測序膠電泳分離，放射自顯影，對比二者的條帶，找出差異，回收特異性差別條帶，擴(kuò)增，測序，或合成探針篩選基因。表達(dá)序列庫：將基因克隆到表達(dá)載體，表達(dá)后用免疫學(xué)方法、產(chǎn)物功能測定、產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)研究等方法鑒定特定的基因。七基因定位誘變八DNA 序列的測定第三節(jié) 克隆基因的表達(dá)一基因表達(dá)的控制元件在典型的表達(dá)載體中，真核編碼序列被插入啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游，插入位點(diǎn)的下游應(yīng)當(dāng)有轉(zhuǎn)錄終止信號，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA 應(yīng)包含核糖體

21、結(jié)合位點(diǎn)。二RNA 的表達(dá)表達(dá)載體攜帶能夠被噬菌體SP6 的RNA 聚合酶辨認(rèn)的啟動(dòng)子. SP6 RNA 聚合酶可以在體外高效率地轉(zhuǎn)錄,將任何目的DNA 插入SP6 啟動(dòng)子下游的多接頭克隆位點(diǎn)，可以連續(xù)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA，轉(zhuǎn)錄起始前，環(huán)狀的表達(dá)載體會(huì)在插入位點(diǎn)或其附近被單一位點(diǎn)裂解而線性化，因此，轉(zhuǎn)錄會(huì)在固定的位點(diǎn)終止。三蛋白質(zhì)的表達(dá)1表達(dá)非融合蛋白用原核生物對真核基因進(jìn)行非融合表達(dá)，容易得到較大的表達(dá)量，但表達(dá)產(chǎn)物不易形成正確的折疊，不能被糖基化，容易被分解，或形成包含體，裂解包含體時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)變性，需要復(fù)性，才能得到有活性的蛋白質(zhì)。融合lac 和trp 的啟動(dòng)子，可被IPTG 誘導(dǎo)，是最常用

22、的原核啟動(dòng)子。2表達(dá)融合蛋白融合蛋白的N 末端由原核DNA 序列編碼，C 端由真核DNA 的完整序列編碼，含原核細(xì)胞多肽的融合蛋白可避免細(xì)菌蛋白酶的破壞。表達(dá)融合型蛋白時(shí)，為了得到正確的真核蛋白，在插入真核基因時(shí)，其閱讀框架與融合的DNA 片段的閱讀框架要一致，翻譯時(shí)，才不至于產(chǎn)生移碼突變。工程菌必須在有足夠量的繁殖以后，再表達(dá)目的基因，否則，沒有足夠的菌量，就得不到足夠的表達(dá)產(chǎn)物。通常在細(xì)菌達(dá)到對數(shù)生長期后，再加入誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，X-gal 是常有的誘導(dǎo)物。5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷：3表達(dá)分泌蛋白表達(dá)分泌蛋白是防止宿主菌對表達(dá)產(chǎn)物的降解，減輕宿主細(xì)胞代謝負(fù)荷及恢復(fù)表

23、達(dá)產(chǎn)物天然構(gòu)象的最有力措施。在原核表達(dá)系統(tǒng)中，人們研究比較多的主要是大腸桿菌。大腸桿菌主要由四部分組成：胞質(zhì)、內(nèi)膜、外膜及內(nèi)外膜之間的周間質(zhì)。一般情況下，所謂“分泌”是指蛋白質(zhì)從胞質(zhì)跨過內(nèi)膜進(jìn)入周間質(zhì)這一過程。而蛋白質(zhì)從胞質(zhì)跨過內(nèi)、外膜進(jìn)入培養(yǎng)液的情況較為少見，被稱為“外排”以區(qū)別于“分泌”。4外源基因在酵母中的克隆和表達(dá)在酵母中表達(dá)真核基因，表達(dá)產(chǎn)物容易形成正確的折疊和糖基化，但不容易形成較大的表達(dá)量。通常將目的基因插入穿梭載體，在大腸桿菌中擴(kuò)增后，再轉(zhuǎn)入酵母菌進(jìn)行表達(dá)。用酵母菌表達(dá)的不少蛋白質(zhì)已經(jīng)作為基因工程產(chǎn)品，產(chǎn)生了很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。典型的穿梭質(zhì)粒，分別含有酵母和細(xì)菌的起始位點(diǎn)

24、。整合載體（yeast integrating plasmid）無酵母的復(fù)制起點(diǎn)，必須整合到染色體中才能穩(wěn)定存在。附加體質(zhì)粒（yeast integrating plasmid）有酵母的復(fù)制起點(diǎn)，在酵母細(xì)胞中以高拷貝存在。復(fù)制質(zhì)粒（yeast integrating plasmid)有酵母的自主復(fù)制序列（autonomous replicating sequence,ARS），在酵母細(xì)胞中以中等拷貝存在。含著絲粒（CEN）的質(zhì)粒（yeast centromere- containing plasmid）含有ARS 和CEN，在酵母細(xì)胞中以單拷貝穩(wěn)定存在。酵母的表達(dá)載體必須含有可以被RNA 聚合

25、酶識(shí)別的強(qiáng)啟動(dòng)子，如可誘導(dǎo)型的GAL（半乳糖激酶）、PHO5（堿性磷酸酯酶），組成型的ADH1（醇脫氫酶）、PGK（磷酸甘油激酶）、GPD（葡萄糖-6-磷酸脫氫酶）等的啟動(dòng)子。酵母人工染色體（yeast artificial chromosome)含有ARS 和CEN 和TEL 端粒(telomere)，能以微型染色體存在，可以克隆超過100kb 的DNA 片斷。外源基因在植物細(xì)胞中的克隆和表達(dá)：植物細(xì)胞有全能性，轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞或組織容易培養(yǎng)成植株，但將基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞較困難，被轉(zhuǎn)入的基因有時(shí)不能表達(dá)，或表達(dá)量不足以引起性狀變化，有時(shí)會(huì)抑制內(nèi)源基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因作物已有大規(guī)模種植，以抗性基因?yàn)橹?/p>

26、，也有耐貯藏和改善品質(zhì)的成功范例。使用共整合載體時(shí)，常用三個(gè)菌株配合：具有輔助轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的大腸桿菌；具有攜帶目的基因質(zhì)粒的大腸桿菌；具有onc-Ti 質(zhì)粒衍生的受體載體的根瘤土壤桿菌菌株。胭脂堿合成酶-新霉素抗性基因：T-DNA 右端邊緣；T-DNA 左端邊緣。編碼多種轉(zhuǎn)移和整合作用相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)。外源基因在動(dòng)物細(xì)胞中的克隆和表達(dá)：猿猴細(xì)胞為SV40 的受納細(xì)胞，嚙齒類細(xì)胞為非受納細(xì)胞，人體細(xì)胞為半受納細(xì)胞。T 抗原基因、外殼蛋白基因。構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，將原病毒DNA 插入大腸桿菌的質(zhì)粒pBR322，然后用抗性基因如新霉素抗性基因(neo)、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)、二氫葉酸還原酶基因(dhfr)等取代病毒的gag (group specific antigen，種群特異性抗原)、pol（polymerase，聚合酶）和env（envelope，被膜）基因的全部或大部。包裝位點(diǎn)：負(fù)鏈引物結(jié)合位點(diǎn)(negative strand primer binding site)。綠色熒光蛋白（