活血祛瘀法干預(yù)激素性股骨頭壞死骨組織的修復(fù)

1、www.CRTER.org陳雷雷，等. 活血祛瘀法干預(yù)激素性股骨頭壞死骨組織的修復(fù)活血祛瘀法干預(yù)激素性股骨頭壞死骨組織的修復(fù)陳雷雷1，2，陳曉波2，3，洪郭駒2，3，陳 達2，3，楊 鵬2，3，何 偉1，2 (1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科，廣東省廣州市 510000；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)國家重點學(xué)科中醫(yī)骨傷科學(xué)實驗室，廣東省廣州市 510000；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東省廣州市 510000)引用本文：陳雷雷，陳曉波，洪郭駒，陳達，楊鵬，何偉. 活血祛瘀法干預(yù)激素性股骨頭壞死骨組織的修復(fù)J.中國組織工程研究，2016，20(15):2148-2155.DOI: 10.3969/

2、j.issn.2095-4344.2016.15.003 ORCID: 0000-0002-5610-5245(何偉)文章快速閱讀：活血祛瘀法干預(yù)激素性股骨頭壞死的修復(fù)作用檢測指標：(1)高分辨率MRI檢查股骨頭壞死表現(xiàn)(2)股骨頭病理學(xué)組織檢測(3)Western Blot檢測兔股骨頭ABCB1、RUNX2、OPN、RANK、RANKL、PPARg、骨保護素、血管內(nèi)皮生長因子的蛋白表達水平50只新西蘭兔隨機分為3組模型組20只中藥組(桃紅四物湯組)20只正常組10只制備激素性股骨頭壞死模型干預(yù)方法：中藥組給予桃紅四物湯混懸液灌胃；正常組和模型組灌服等體積超純水陳雷雷，男，1982年生，山東省

3、濱州市人，漢族，2012年廣州中醫(yī)藥大學(xué)畢業(yè)，博士，主治醫(yī)師，主要從事股骨頭壞死的基礎(chǔ)與臨床研究。通訊作者：何偉，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科，廣東省廣州市 510000中圖分類號:R318文獻標識碼:A文章編號:2095-4344(2016)15-02148-08稿件接受：2016-03-07http:/WWW. 文題釋義：激素性股骨頭壞死：在國內(nèi)外報道越來越多，是激素在廣泛應(yīng)用中近年被公認的并發(fā)癥，其發(fā)病率目前已超過了創(chuàng)傷所致的股骨頭壞死，機制尚不十分清楚，一般認為激素在體內(nèi)長期蓄積造成血液黏稠度增加，血脂增高，脂肪栓塞，脂肪肝，造成骨的

4、微細血管阻塞，缺血，骨質(zhì)合成減少，鈣吸收障礙，骨質(zhì)疏松及微細骨折的積累，最后導(dǎo)致激素性股骨頭壞死。使用糖皮質(zhì)激素如地塞米松最短有7 d導(dǎo)致股骨頭壞死的，使用激素后發(fā)病時間不一，有使用激素后不到2個月就發(fā)生股骨頭壞死的報道?；钛觯河镁哂邢⒆饔玫摹⒒蚰芄ブ痼w內(nèi)瘀血的藥物治療中醫(yī)診斷為瘀血病證的方法。摘要背景：激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制尚不明確，該病所伴隨的塌陷破壞和重建性修復(fù)或與“骨形成-吸收”偶聯(lián)失效所引起微觀骨結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。活血祛瘀法經(jīng)臨床證實對該病有積極作用。但目前針對活血祛瘀法促進骨壞死修復(fù)的作用機制尚不清楚，相關(guān)國內(nèi)外文獻報道較少。目的：制備激素性股骨頭壞死兔模型，探究活血祛瘀法對

5、激素性股骨頭壞死修復(fù)的干預(yù)作用。方法：50只新西蘭兔隨機分為3組：正常組10只、模型組和中藥組(桃紅四物湯組)各20只，采用內(nèi)毒素聯(lián)合甲強龍的方法制備激素性股骨頭壞死模型，最后一次肌肉注射甲強龍后24 h，中藥組給予 0.3 g/kg桃紅四物湯混懸液灌胃，正常組和模型組灌服等體積超純水，連續(xù)8周。實驗第8周分別進行高分辨率MRI檢查和病理學(xué)組織檢測以評估建模效果，采用Western Blot檢測兔股骨頭ABCB1、RUNX2、OPN、RANK、RANKL、PPAR、骨保護素、血管內(nèi)皮生長因子的蛋白表達水平。結(jié)果和結(jié)論：經(jīng)蘇木精-伊紅染色顯示：模型組可見部分骨小梁斷裂，骨細胞核固縮，骨小梁空骨陷

6、窩，骨髓細胞壞死，與正常組相比空骨陷窩率差異有顯著性意義(P < 0.05)，中藥組可見成骨活動仍較為活躍，骨小梁形態(tài)較好，說明活血祛瘀法可改善壞死區(qū)域組織修復(fù)。高分辨率MRI顯示：模型組股骨頭外形基本正常，股骨頭內(nèi)可見低信號帶；中藥組股骨頭外形趨于正常，股骨頭內(nèi)近骨骺處有小塊低密度區(qū)，大部分骨組織灰度值正常，提示活血祛瘀法可改善壞死區(qū)域影像學(xué)改變。Western Blot檢測結(jié)果：模型組與正常組相比RUNX2、RANK、RANKL的蛋白表達升高，ABCB1、骨保護素、血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達下降；中藥組與模型組相比，除RANK、RANKL表達下降外，其余均升高，差異3 P.O.Box

7、1200,Shenyang 110004 kf23385083有顯著性意義(P < 0.05)。結(jié)果說明：活血祛瘀法促進兔激素性股骨頭壞死的修復(fù)可能與調(diào)節(jié)ABCB1、RUNX2、RANK、RANKL、骨保護素、血管內(nèi)皮生長因子蛋白的表達水平有關(guān)。關(guān)鍵詞：Chen Lei-lei, M.D., Attending physician, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong

8、 Province, China; the National Key Discipline and the Orthopedic Laboratory of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, ChinaCorresponding author:He Wei, Doctoral supervisor, Professor, Chief physician, Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital o

9、f Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; the National Key Discipline and the Orthopedic Laboratory of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China組織構(gòu)建；骨組織工程；股骨頭壞死；糖皮質(zhì)激素；活血祛瘀；成骨-破骨；高分辨率MRI；Western blot；國家自然科學(xué)基金主題

10、詞：股骨頭壞死；糖皮質(zhì)激素；組織工程基金資助：國家自然科學(xué)基金資助項目(81302990)；廣東省杰出青年科學(xué)基金(2015A030306037)；廣東省高等學(xué)校學(xué)科與專業(yè)建設(shè)專項資金項目(2013LYM 0010)“Removing Blood Stasis” Method for bone repair in steroid-induced osteonecrosis of the femoral headsChen Lei-lei1, 2, Chen Xiao-bo2, 3, Hong Guo-ju2, 3, Chen Da1, 2, Yang Peng2, 3, He Wei1, 2

11、(1Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; 2the National Key Discipline and the Orthopedic Laboratory of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China; 3t

12、he First Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China)AbstractBACKGROUND: The pathogenesis of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head remains unclear. Femoral head reconstruction after collapse is related to the bone remodeling du

13、e to disorder of the bone formation-absorption coupling. “Removing Blood Stasis” Method has been shown to have a positive effect on the disease in clinics. However, the mechanisms by which the “Removing Blood Stasis” Method confers bone repair after osteonecrosis remain poorly understood.OBJECTIVE:

14、To explore the effect of “Removing Blood Stasis” Method on bone repair in rabbits with steroid-induced femoral head osteonecrosis.METHODS: Fifty New Zealand rabbits were randomly assigned into three groups: normal control (n=10), model (n=20) and Taohong Siwu Decoction (n=20) groups, respectively. T

15、he steroid-induced osteonecrosis of the femoral head animal models were established by intramuscular injection of endotoxin combined with methylprednisolone (MPS). Rabbits in Taohong Siwu Decoction group were intragastrically administered with 0.3 g/kg of Taohong Siwu Decoction suspension after the

16、last injection of methylprednisolone. The control and model groups were administrated by equal volume of ultrapure water for 8 consecutive weeks. High-resolution MRI and pathological determinations were used to assess the successful models. Protein expression levels of ABCB1, RUNX2, OPN, RANK, RANKL

17、, PPAR, osteoprotegerin (OPG), vascular endothelial growth factor (VEGF) in rabbit femoral heads were detected by western blot assay.RESULTS AND CONCLUSION: (1) Hematoxylin-eosin staining showed that trabecular bone fracture, karyopyknosis, empty lacunae, necrotic bone marrow cells were seen in the

18、model group. Empty lacunae rate in the model group was significantly different from that in the normal control group (P < 0.05). Bone formation was active and kept better trabecular morphology in the Taohong Siwu Decoction group. It suggested that “Removing Blood Stasis” Method can improve repair

19、 of necrotic area. (2) In the model group, femoral head with a wide range of low-density areas in high-resolution MRI; Taohong Siwu Decoction group showed the relatively normal shape of the femoral head with small areas of low density. It suggested that “Removing Blood Stasis” Method can improve ima

20、ge changes in the necrotic area. (3) Protein expression levels of RUNX2, RANK, RANKL were significantly up-regulated but protein expression levels of ABCB1, OPG, VEGF were significantly down-regulated in the model group compared with the normal control group; whereas, they were all significantly up-

21、regulated in the Taohong Siwu Decoction group compared with the model group, except for RANK and RANKL (P < 0.05). These results suggest that the “Removing Blood Stasis” Method can promote bone repair in steroid-induced femoral head osteonecrosis rabbits by regulating protein expressions of ABCB1

22、, RUNX2, RANK, RANKL, OPG, and VEGF.Subject headings: Femur Head Necrosis; Glucocorticoids; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81302990; Guangdong Funds for Distinguished Young Scholar, No. 2015A030306037; the Key Discipline Construction Project in Highe

23、r Education of Guangdong, No. 2013LYM 0010Cite this article: Chen LL, Chen XB, Hong GJ, Chen D, Yang P, He W. “Removing Blood Stasis”Method for bone repair in steroid-induced osteonecrosis of the femoral heads. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(15):2148-2155.2153ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CO

24、DEN: ZLKHAH0 引言 Introduction激素性股骨頭壞死(steriod-induced osteonecrosis of femoral head，SIONFH)是好發(fā)于中青年人群的骨科難治疾病，也是股骨頭壞死最常見類型。由于激素類藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，并發(fā)激素性股骨頭壞死的病例也日益增多1。激素性股骨頭壞死雖不致威脅生命，但嚴重影響患者工作生活，造成沉重的社會和經(jīng)濟負擔(dān)。激素性股骨頭壞死發(fā)病機制目前尚未明確，或與基因組的表觀遺傳學(xué)的改變密切相關(guān)，包括基因多態(tài)性以及甲基化水平改變等2-3。激素性股骨頭壞死發(fā)生塌陷的機制可能與破骨細胞和成骨細胞構(gòu)成的“骨吸收-形成”偶聯(lián)失效有關(guān)

25、。在病理組織上觀察骨壞死組織，根據(jù)不同時期分別可表現(xiàn)為泡沫細胞生成、骨髓細胞壞死、骨髓纖維化等4。從微觀分子層面觀察，骨壞死的發(fā)生發(fā)展受成骨、破骨、脂化、血管化等多重機制相互作用而成，包括ABCB1、RUNX2、OPN、RANK、RANKL、PPAR、骨保護素、血管內(nèi)皮生長因子等一系列關(guān)鍵因子或通路。從宏觀上看，激素性股骨頭壞死在大體標本上呈現(xiàn)除新生骨、硬化帶外，病灶內(nèi)死骨與活骨并存，部分股骨頭壞死區(qū)存在小的囊變。在MRI上表現(xiàn)為，負重區(qū)軟骨下出現(xiàn)局灶性信號改變，低信號帶、雙線征、水腫高信號區(qū)域及囊變低信號區(qū)。激素性股骨頭壞死發(fā)生后并不立即出現(xiàn)明顯的骨結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能改變，在修復(fù)過程啟動后才出現(xiàn)

26、骨結(jié)構(gòu)損害和力學(xué)性能降低。壞死骨組織表現(xiàn)為骨小梁數(shù)量減少、變薄、甚至發(fā)生斷裂，骨小梁的連續(xù)性損壞和斷裂則可致應(yīng)力傳導(dǎo)出現(xiàn)障礙，最終導(dǎo)致塌陷的發(fā)生5。因此，如何通過有效的措施延緩和改善頭內(nèi)壞死組織的破壞和塌陷，是目前激素性股骨頭壞死非手術(shù)治療的研究重點。已有較多臨床實踐和研究表明，中醫(yī)藥治療股骨頭壞死的療效確切6，目前主要從“瘀”的病理因素認識其發(fā)病的機制。股骨頭壞死癥候虛實錯雜，兼夾痰濕、肝腎虧虛，但脈絡(luò)瘀阻起著關(guān)鍵作用，貫穿疾病始終。以桃紅四物湯為代表方的活血祛瘀法廣泛應(yīng)用于股骨頭壞死的臨床治療。 為了進一步研究活血祛瘀法對激素性股骨頭壞死的干預(yù)作用及內(nèi)在微觀機制，作者建立新西蘭兔激素性股骨

27、頭壞死動物模型，采用高分辨率MRI觀察骨頭壞死區(qū)域影像學(xué)變化，通過組織病理學(xué)及Western blot等方法，觀察活血祛瘀法對激素性股骨頭壞死股骨頭修復(fù)的生物學(xué)影響。實驗?zāi)康陌ǎ河^察激素性股骨頭壞死動物模型股骨頭影像學(xué)與組織形態(tài)學(xué)變化，通過分子生物學(xué)方法研究活血祛瘀法促進激素性股骨頭壞死修復(fù)的作用機制。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計 隨機對照動物實驗。1.2 時間及地點 于2015年1至10月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心及重點學(xué)科中醫(yī)骨傷科學(xué)實驗室完成。1.3 材料 中藥干預(yù)激素性股骨壞死實驗用藥物、試劑及儀器：藥物、試劑及儀器來源Lipopolys

28、accharide,批號L2880 (from 055: B5)美國sigma公司注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉，批號Z07412美國輝瑞公司Protease Inhibitor Cocktail Set IIICalbiochem，539134吐溫20(T104863)、氯化鉀(P112133)、三(羥甲基)氨基甲烷(T110601)、冰乙酸(A116167)、氯化鈉(C111547)、乙二胺四乙酸(E112487)、甘氨酸(A110752)、甲醇(M116115)、異丙醇(I112011)、甘油(G116208)、EGTA(E104434)、曲拉通X-100 (T109027)、氟化鈉(S1115

29、91)、過硫酸銨(A112450)、十二烷基硫酸鈉(S108346)上海阿拉丁生化科技股份有限公司Deoxychlate(D6750)Sigma公司，30%丙烯酰胺預(yù)混液(AS0500)Labtide公司ECL發(fā)光液(32106)Pierce公司，Immobilon-P PVDF膜(IPVH00010)Millipore公司轉(zhuǎn)印濾紙(170-3931)、預(yù)染marker(1610374)BIO-RAD公司BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012)、HRP山羊抗小鼠IgG二抗(A0216)、HRP山羊抗兔IgG二抗(A0208)上海碧云天生物技術(shù)有限公司RUNX2(sc101145)抗體、OPN抗體

30、(sc73631)、PPAR抗體(sc7273)、骨保護素(sc8468)抗體Santa Cruz公司ABCB1(13978)、GAPDH(5174)，RANK(4845)抗體CST公司血管內(nèi)皮生長因子(ab1316)抗體、RANKL(ab22113)Abcam公司Mini-PROTEAN Tera System、PowerPac Basic、ChemiDoc MP凝膠成像儀美國BIO-RAD公司ELix10+ Milliq-B超純水系統(tǒng)美國Millipore公司Multiskan GO酶標儀美國Thermo ScientificTP1020自動脫水機、Autos全自動染色機德國Leica公司

31、BX53顯微鏡OLYMPUS公司3.0 T MRI 掃描儀GE health care公司實驗動物：健康新西蘭白兔50只，普通級，雌雄各半，24周齡，體質(zhì)量3.0-3.5 kg，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證編號：44002100005081。廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心標準飼養(yǎng)，標準兔糧適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由飲水，室溫(23±2) ，間隔12 h照明，定期消毒及通風(fēng)。中藥制備：桃紅四物湯藥物按醫(yī)宗金鑒組成：桃仁10 g、紅花5 g、生地12 g、當(dāng)歸12 g、赤芍10 g、川芎10 g，采用專用中藥壺制備成混懸液，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。1.4 實驗方法1.4.1 動物分組

32、 50只新西蘭兔隨機分為3組：正常組10只、模型組和中藥組(桃紅四物湯組)各20只。1.4.2 造模方法 激素性股骨頭壞死的造模建立參照Qin等7的方法。模型組和中藥組兔采用內(nèi)毒素10 g/kg耳緣靜脈注射1次，24 h后臀部肌肉注射甲強龍40 mg/kg，隔間24 h連續(xù)注射6次。正常組注射等體積生理鹽水。注射激素期間，每天每只動物相應(yīng)臀肌處注射青霉素10×104 U，連續(xù)6次，預(yù)防感染。1.4.3 各組干預(yù)方法 桃紅四物湯藥物按照人的臨床等效劑量換算，兔的臨床等效劑量為0.3 g/kg。最后一次注射甲強龍24 h后，中藥組給予桃紅四物湯混懸液灌胃，正常組和模型組灌服等體積超純水，

33、連續(xù)8周。1.4.4 高分辨率MRI參數(shù) 由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院影像科提供3.0T高分辨率磁共振影像儀。掃描序列包括軸位T2 WI、軸位T2WI壓脂及冠狀位T1WI序列。其中，軸位T2WI序列：TR/TE=4 100 ms/85 ms，層厚/層間距為2 mm/0.2 mm，F(xiàn)OV為180 mm×180 mm，矩陣為320×224。軸位T2WI壓脂序列：TR/TE=367 ms/ 76.8 ms，層厚/層間距為2 mm/0.2 mm，F(xiàn)OV為170 mm× 170 mm，矩陣為320×224。冠狀位T1WI序列：TR/TE= 4 134 ms/85

34、ms，層厚/層間距為2 mm/0.2 mm，F(xiàn)OV為180 mm×180 mm，矩陣為320×224。1.5 主要指標測定1.5.1 高分辨率磁共振檢查 麻醉前禁食12 h，戊巴比妥30 mg/kg耳緣靜脈注射進行麻醉，靜脈注射必須緩慢，同時觀察肌肉的緊張度、角膜反射和對皮膚疼痛的反應(yīng)。麻醉中采取保溫措施，保持氣道通暢和組織的營養(yǎng)，進行雙側(cè)髖關(guān)節(jié)的MRI掃描。MRI掃描在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院進行，生成的圖像文件保存為DICOM格式，通過移動硬盤拷貝至計算機工作站。MRI檢查完成后將新西蘭兔運送回動物房，蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng)。1.5.2 蘇木精-伊紅染色收光鏡觀察 截取股骨頭

35、，剔除周圍肌肉及韌帶組織，沿正中冠狀面剖開，用體積分數(shù)10%中性甲醛溶液(pH 7.4)固定48 h，再置于10% EDTA-Tris緩沖液中脫鈣，隔天更換脫鈣液，直至完全脫鈣以后，流水沖洗，逐級乙醇脫水，二甲苯透明處理2 h，石蠟包埋、切片，切片厚度為4 m，常規(guī)蘇木精-伊紅染色。光鏡下觀察骨髓腔內(nèi)骨髓細胞、骨小梁及骨細胞形態(tài)及空骨陷窩等。1.5.3 Western Blot實驗 樣品制備：將研磨缽用液氮預(yù)冷，從液氮中取出股骨頭，稱重后迅速放入研磨缽中，研磨至粉末狀，按50 mg骨組織/200 L RIPA裂解液制備樣品。BCA法測量總蛋白濃度。SDS-PAGE：分別制備10%分離膠、5%濃

36、縮膠，待凝膠聚合后，小心拔出梳子，放入電泳槽內(nèi)，注入電泳緩沖液。每組取30 g樣品裂解液，與上樣緩沖液按51充分混勻，置沸水浴中加熱5 min，冷卻后用微量移液器吸取樣品與預(yù)染蛋白marker點樣，80 V電壓進行電泳。待預(yù)染蛋白marker前沿遷移出膠底板后，停止電泳，取出凝膠。轉(zhuǎn)膜：PVDF膜預(yù)先在甲醇中浸泡5 min，在半干轉(zhuǎn)膜槽上，夾子黑面朝下，從下至上依次放轉(zhuǎn)膜緩沖液浸濕的濾紙、凝膠、PVDF膜和另一塊浸濕的濾紙，形成“三明治”，保持整個裝置內(nèi)濕潤，并避免產(chǎn)生氣泡，350 mA轉(zhuǎn)膜3 h。封閉：取出轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜置于盛有5%脫脂奶粉的封閉液的平皿中，置于搖床上室溫封閉1 h。抗體

37、孵育：傾倒封閉液，加入一抗(ABCB1、血管內(nèi)皮生長因子、RANK、骨保護素按11 000稀釋，GAPDH按12 000稀釋，RUNX2、OPN、PPAR按1500稀釋，RANKL按1650稀釋)，搖床上室溫振蕩孵育2 h或者4 孵育過夜?；厥找豢梗肨BST洗滌3-5次，每次10 min。加入相應(yīng)HRP標記的二抗(11 000)，置搖床上室溫振蕩孵育2 h。TBST洗滌3-5次，每次10 min?；瘜W(xué)發(fā)光、顯影：將ECL發(fā)光顯色試劑盒中的顯色劑A和B等體積混合后，加在PVDF膜上充分接觸反應(yīng)2 min后，將PVDF膜移至另一保鮮袋中，去盡殘液，包好，避免產(chǎn)生氣泡，放入凝膠成像系統(tǒng)中進行成像分

38、析。先曝光3- 5 min，根據(jù)信號的強弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間，保存圖像，分析結(jié)果，使用image-pro plus軟件進行半定量分析。1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料結(jié)果以±s表示，先做方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法，計數(shù)資料的比較采用卡方檢驗，P < 0.05為差異有顯著性意義。CBA圖1 造模后不同組新西蘭兔股骨頭蘇木精-伊紅染色圖像特點(×200)Figure 1 Hematoxylin-eosin staining of the rabbit femoral head after model

39、ing (×200)圖注：圖中A為正常組；B為模型組，可見部分骨小梁斷裂，骨細胞核固縮，骨小梁空骨陷窩，骨髓細胞壞死；C為中藥組，可見成骨活動較為活躍，骨小梁形態(tài)較好。CBA圖2 激素型新西蘭兔股骨頭高分辨率MRI圖像Figure 2 High-resolution MRI images of the femoral head of rabbits in each group圖注：圖中A為正常組；B為模型組；C為中藥組。2 結(jié)果 Results 2.1 造模過程事件分析 新西蘭兔50只，隨機分為3組，40只新西蘭兔用于建立激素性股骨頭壞死模型，其有7只在注射內(nèi)毒素后24 h死亡，33

40、只存活，存活率為82.5%。模型組有14只出現(xiàn)壞死征象，壞死發(fā)生率為82.4%(14/17)；中藥組有5只出現(xiàn)壞死征象，壞死發(fā)生率為(5/16)31.3%。2.2 股骨頭壞死模型評價 股骨頭壞死造模成功的標準參照Ikemura等的評價方法8。模型組：骨小梁稀疏變細，結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)骨髓細胞碎片，骨小梁空骨陷窩或骨小梁內(nèi)骨細胞核固縮，伴隨著周圍骨髓細胞的壞死，細胞數(shù)目及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較正常稀疏，脂肪細胞體積增大，有的融合成泡狀。正常組：骨小梁完整，排列規(guī)則，骨小梁中的骨細胞清晰可見，空骨陷窩少見，骨髓中造血細胞豐富，脂肪細胞相對較少，形態(tài)正常。模型組出現(xiàn)股骨頭壞死的病理征象，可見部分骨小梁斷裂，骨細胞核

41、固縮，骨小梁空骨陷窩，骨髓細胞壞死，見圖1。中藥組股骨頭病理征象，可見成骨活動較為活躍，骨小梁形態(tài)較好。正常組空骨陷窩率為(8.96±1.43)%，模型組為(26.00±1.25)%，兩組比較差異有顯著性意義(P < 0.05)。2.3 高分辨率磁共振掃描 人體股骨頭壞死MRI表現(xiàn)為，負重區(qū)軟骨下出現(xiàn)局灶性信號改變，低信號帶、雙線征、水腫高信號區(qū)域及囊變低信號區(qū)。家兔模型較人體為不典型，可依據(jù)其信號變化進行判斷，見圖2。MRI掃描顯示，正常組股骨頭外形為半圓形，灰度信號均勻；模型組股骨頭外形基本正常，股骨頭內(nèi)可見低信號帶，提示為股骨頭壞死區(qū)；中藥組股骨頭外形正常，股骨

42、頭內(nèi)近骨骺處有小片狀低信號區(qū)，大部分骨組織灰度值正常，提示股骨頭壞死修復(fù)較好。2.4 激素性股骨頭壞死相關(guān)蛋白檢測 Western blot檢測ABCB1、RUNX2、OPN、RANK、RANKL、PPAR、骨保護素、血管內(nèi)皮生長因子的蛋白表達。與正常組相比，模型組ABCB1的蛋白表達明顯降低，差異有顯著性意義(P < 0.05)，而中藥組相對于模型組的ABCB1蛋白表達升高，差異有顯著性意義(P < 0.05)，說明在股骨頭壞死時ABCB1蛋白功能降低，而活血祛瘀中藥可促進ABCB1的蛋白表達。與正常組相比，模型組RANK、RANKL、RUNX2蛋白均升高，骨保護素蛋白降低，差異

43、有顯著性意義(P < 0.05)，說明發(fā)生股骨頭壞死時，機體成骨細胞受激活分化增加而破骨細胞活躍；而中藥組相比模型組，RUNX2、骨保護素升高而RANK、RANKL表達降低(P < 0.05)，說明活血祛瘀中藥可有效激活RANK/RANKL/骨保護素通路，調(diào)控成骨細胞內(nèi)骨鈣素的表達，從而進一步促進成骨細胞分化與活性，抑制破骨細胞的功能活動。相對于正常組，模型組內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子的蛋白表達降低，差異有顯著性意義(P < 0.05)，說明股骨頭壞死抑制血管內(nèi)皮細胞的生長及血管生成。相對于模型組，中藥組血管內(nèi)皮生長因子的蛋白升高，差異有顯著性意義(P < 0.05)，說明活血

44、祛瘀中bBARUNX2蛋白相對表達ABCB1蛋白相對表達0.20正常組 模型組 中藥組01.51.00.50baa正常組 模型組 中藥組RUNX2(55 000)GAPDH(37 000)ABCB1(141 000)GAPDH(37 000)aCDbRANK蛋白相對表達OPN蛋白相對表達正常組 模型組 中藥組正常組 模型組 中藥組RANK(42 000)GAPDH(37 000)OPN(25 000-55 000)GAPDH(37 000)FE骨保護素蛋白相對表達正常組 模型組 中藥組ab0.200.4

45、00.20ab0abPPAR蛋白相對表達正常組 模型組 中藥組RANKL蛋白相對表達正常組 模型組 中藥組PPAR(53 000)GAPDH(37 000)RANKL(95 000)GAPDH(37 000)血管內(nèi)皮生長因子蛋白相對表達GH正常組 模型組 中藥組VEGF(26 000)GAPDH(37 000)OPG(45 000)GAPDH(37 000)圖3 各組兔股骨頭ABCB1、RUNX2、OPN、RANK、RANKL、PPAR、骨保護素、血管內(nèi)皮生長因子蛋白的達水平 Figure 3 Protein expression leve

46、ls of ABCB1, RUNX2, OPN, RANK, RANKL, PPAR, osteoprotegerin, and vascular endothelial growth factor in the femoral head of rabbits in each group圖注：圖A為ABCB1蛋白表達；B為RUNX2蛋白表達；C為OPN蛋白表達；D為RANK蛋白表達；E為RANKL蛋白表達；F為PPAR蛋白表達；G為骨保護素蛋白表達；H為血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達。與正常組比較，aP < 0.05；與模型組比較，bP < 0.05。藥可通過升高血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達

47、以促進壞死骨組織內(nèi)血管化修復(fù)。各組間PPAR和OPN的蛋白表達水平，差異無顯著性意義。見圖3，表1。表1 各組兔股骨頭ABCB1、RUNX2、OPN、RANK、RANKL、PPAR、骨保護素、血管內(nèi)皮生長因子蛋白的表達水平(±s)Table 1 Protein expression levels of ABCB1, RUNX2, OPN, RANK, RANKL, PPAR, osteoprotegerin, and vascular endothelial growth factor in the femoral head of rabbits in each group指標正常組

48、模型組中藥組ABCB10.923±0.0080.149±0.003a1.088±0.028bRUNX20.011±0.0010.023±0.003a0.400±0.010bOPN0.152±0.0020.159±0.0050.335±0.007RANK0.483±0.0310.733±0.028a0.643±0.011bRANKL0.328±0.0270.598±0.013a0.412±0.022bPPARg0.335±0.0070.3

49、25±0.0070.295±0.044骨保護素0.652±0.0270.403±0.010a0.425±0.008b血管內(nèi)皮生長因子0.486±0.0090.293±0.007a0.336±0.027b表注：與正常組比較，aP < 0.05；與模型組比較，bP < 0.05。3 討論 Discussion激素性股骨頭壞死發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚未完全明確。在發(fā)病過程中，除了骨吸收-形成偶聯(lián)失效引起的骨質(zhì)破壞以外，糖皮質(zhì)激素可使骨髓間充質(zhì)干細胞骨髓間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化能力增強，而向成骨細胞的分化降低。激

50、素性股骨頭壞死的骨組織內(nèi)會出現(xiàn)骨細胞、造血細胞及骨基質(zhì)降解等表現(xiàn)，繼而發(fā)生壞死區(qū)周圍的修復(fù)反應(yīng)9。長期以來，激素性股骨頭壞死缺乏針對病因的特效藥物，而中醫(yī)藥在實驗與臨床研究中已顯示具有良好的前景10。激素性股骨頭壞死在中醫(yī)學(xué)中屬于“骨蝕”、“骨痹”的范疇，主要從“瘀”的病理因素認識其發(fā)病的原因和機制11-12。桃紅四物湯作為活血祛瘀法的經(jīng)典方，臨床上治療骨傷科“瘀證”取得了良好效果。文獻研究認為活血祛瘀法是治療激素性股骨頭壞死的基本法則13。實驗研究采用桃紅四物湯含藥血清干預(yù)壞死骨微粒刺激的巨噬細胞發(fā)現(xiàn)，含藥血清能增高轉(zhuǎn)化生長因子1的表達，抑制腫瘤壞死因子 的表達，進而促進激素性股骨頭壞死骨修

51、復(fù)14-15。然而活血祛瘀法通過何種方式影響糖皮質(zhì)激素對成骨-破骨反應(yīng)作用則尚不明確。因此，需要深入研究該法在激素性股骨頭壞死的生物學(xué)作用，以進一步闡明其促進激素性股骨頭壞死修復(fù)的作用機制。隨著激素性股骨頭壞死發(fā)病機制的深入研究，目前可探知在激素性股骨頭壞死壞死中起關(guān)鍵性作用的若干基因或蛋白。其中包括ABCB1是編碼糖蛋白的多藥耐藥物質(zhì)，其反映了激素抵抗的主要基因，主要作用機制是介入到P糖蛋白對于藥物基質(zhì)的細胞內(nèi)外運輸。研究表明，基因多態(tài)性可能導(dǎo)致了激素在細胞內(nèi)外分布，從而調(diào)控激素性股骨頭壞死的發(fā)生16。RANKL由成骨細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞和T、B淋巴細胞分泌，RANKL與破骨細胞表面的RA

52、NK受體結(jié)合，通過接頭蛋白使TRAF-6 途徑引起核因子B的激活，進一步促進破骨細胞的生長和增殖，破骨細胞的過度增殖引發(fā)過度溶骨和骨吸收17。骨保護素是由成骨細胞系的各種細胞合成的骨保護蛋白，它的表達與細胞分化呈正相關(guān)。RANK/RANKL/骨保護素通路在股骨頭壞死中發(fā)揮抑制破骨細胞形成分化、活化并誘導(dǎo)破骨細胞凋亡的功能18。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RunX2)控制著成骨細胞特異蛋白骨鈣素的表達，是成骨細胞分化及行使功能的中樞調(diào)控，而且研究表明激素可抑制Runx2的表達和活性19-20。血管內(nèi)皮生長因子在體內(nèi)外均可特異性的促進血管內(nèi)皮細胞的生長并誘導(dǎo)血管生成，具有強大的促內(nèi)皮細胞增殖、促血管生

53、成作用，對壞死區(qū)內(nèi)成骨及骨修復(fù)過程中的血管長入發(fā)揮重要作用21。實驗基于上述生物機制認為，活血祛瘀法可能通過某種途經(jīng)直接或間接地影響了ABCB1、RUNX2、RANK、RANKL、骨保護素、血管內(nèi)皮生長因子等相關(guān)因子的表達，調(diào)控成骨細胞、破骨細胞的分化及功能來完成壞死骨組織的修復(fù)。實驗發(fā)現(xiàn)活血祛瘀法可降低新西蘭兔激素性股骨頭壞死的發(fā)生率，促進股骨頭壞死的修復(fù)。與正常組相比，模型組中RUNX2、RANK、RANKL的蛋白表達上調(diào)，ABCB1、骨保護素、血管內(nèi)皮生長因子蛋白表達下調(diào)；而與模型組相比，中藥組除RANK、RANKL表達下調(diào)外，其余均上調(diào)。說明活血祛瘀法促進新壞死修復(fù)機制可能與抑制RAN

54、K、RANKL的表達，促進ABCB1、骨保護素、血管內(nèi)皮生長因子、RUNX2表達有關(guān)。作者貢獻：設(shè)計、評估者為第一作者和通訊作者，實施為全體作者。利益沖突：所有作者共同認可文章無相關(guān)利益沖突。倫理問題：實驗動物在戊巴妥納麻醉下進行所有的手術(shù)，并盡一切努力最大限度地減少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻檢測系統(tǒng)進行3次查重。文章外審：本刊實行雙盲外審制度，文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家審核，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：文章第一作者對研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。

55、文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻 References1 Wang XS,Zhuang QY,Weng XS,et al.Etiological and clinical analysis of osteonecrosis of the femoral head in Chinese patients.Chin Med J (Engl).2013; 126(2): 290-295.2 Gong LL,Fang LH, Wang HY, et al. Genetic risk factors for glucocorticoid-induced oste

56、onecrosis: a meta-analysis. Steroids.2013;78(4):401-408.3 Sun Z,Yang S,Ye S,et al.Aberrant CpG islands' hypermethylation of ABCB1 in mesenchymal stem cells of patients with steroid-associated osteonecrosis. J Rheumatol.2013;40(11):1913-1920.4 Chernetsky S,Mont M,Laporte D,et al.Pathologic features in steroid and nonsteroid associa