大腸埃希菌表達(dá)的含PTD穿膜序列的融合蛋白3種復(fù)性方法比較

1、大腸埃希菌表達(dá)的含PTD穿膜序列的融合 蛋白3種復(fù)性方法比較【摘要】 目的： 探索融合蛋白PTDNFATminiDBDeGFP純化以及復(fù)性的條件，以提高其復(fù)性效率，為后續(xù)融合蛋白生物學(xué)功能的研究做準(zhǔn)備。方法： 表達(dá)、提取并純化包涵體形式的融合蛋白PTDNFATminiDBDeGFP，分別用稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、柱上復(fù)性的方法，對(duì)融合蛋白進(jìn)行復(fù)性，分析不同方法的特點(diǎn)及包涵體復(fù)性率，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)融合蛋白的穿膜活性。結(jié)果： 3種復(fù)性方法得到的融合蛋白復(fù)性率依次為：柱上復(fù)性得率最高，其次是透析復(fù)性，稀釋復(fù)性得率最低。柱上復(fù)性后蛋白的穿膜效率最高，相對(duì)較低的是稀釋復(fù)性，而未復(fù)性的融合蛋白穿膜效率極低

2、。結(jié)論： 3種復(fù)性方法均能對(duì)PTD穿膜蛋白復(fù)性，但以柱上復(fù)性最佳。 【關(guān)鍵詞】 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域 復(fù)性 包涵體 Abstract Objective: To investigate the renaturation parameters of inclusion bodies of the fusion protein PTDNFATminiDBDeGFP and to improve the refolding efficiency for the further research of its biofunction in T cells.Methods： Expressed, extracte

3、d and purified the fusion protein PTDNFATminiDBDeGFP and renaturated it by dilution, dialysis and refolding via Immol/Lobilized MetalIonA ffinity Chromatography（IMAC), respectively.A flow cytometry assay was used to detect the effect of the fusion protein to transduce into the cells cytoplasm. Resul

4、ts： The fusion protein could be refolded by different renaturation ways.The lowest and highest refolding yields could be obtained by dilution and refolding via IMAC, respectively.The flow cytometry analysis indicated that the renaturated protein could transduce into Jurkat cells efficiently and the

5、denaturation protein had low activity. Conclusion： The fusion protein PTDNFATminiDBDeGFP was refolded successfully by the three methods.Moreover, refolding via IMAC was the best one for PTDNFATminiDBDeGFP fusion protein. Key words protein transduction domain; refolding; inclusion bodies(IBS) 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

6、（protein transduction domain，PTD）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的由HIV基因編碼的具穿膜功能的反式激活蛋白(transactivator transcription,TAT)中一段富含堿性氨基酸，帶較多正電荷的多肽，它能夠有效地引導(dǎo)與之共價(jià)相連的核酸、多肽、蛋白質(zhì)等進(jìn)入細(xì)胞。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)不依賴受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也不涉及溫度和能量轉(zhuǎn)換，且轉(zhuǎn)導(dǎo)速度快，效率高 1,2 ，具有廣譜的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。外源性重組蛋白在大腸埃希菌中的高效表達(dá)率，使得蛋白不能形成正確折疊而以不溶性包涵體形式存在。包涵體形式表達(dá)的重組蛋白只有通過(guò)復(fù)性才能得到有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。然而，不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)差異很大

7、，對(duì)不同的變性劑和復(fù)性液的反應(yīng)也不盡相同 3-5 ，因此，需要通過(guò)試驗(yàn)摸索出適合自身蛋白復(fù)性的方法。本文通過(guò)試驗(yàn)研究了不同復(fù)性方法的蛋白得率和復(fù)性后蛋白的穿膜效率，并比較了不同方法的特點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)告如下。 1 材料和方法 1.1 材 料 pQE30 PTDNFAT miniDBDeGFP原核表達(dá)載體由我室構(gòu)建，工程菌E.coli M15，Jurkat細(xì)胞為我室保存；純化樹脂Profinity IMAC金屬螯合填料購(gòu)自BioRad公司；鼠抗-6×His單克隆抗體購(gòu)于Cell Signaling公司，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗以及DAB顯色劑購(gòu)于北京中杉公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物購(gòu)于Fe

8、rmentas公司；還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、IPTG購(gòu)自南京建成生物公司，其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。結(jié)合緩沖液：50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,5 mmol/L咪唑,8 mol/L尿素；洗滌緩沖液：50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑,8 mol/L尿素；洗脫緩沖液：50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,250 mmol/L咪唑,8 mol/L尿素；復(fù)性稀釋液：50 mmol/L NaH2PO4,100 mmol/L NaCl,20 mmol

9、/L Tris·HCl,1 mmol/L EDTA,0.25% NP40,4 mol/L尿素,調(diào)整pH至8.0；透析復(fù)性液：尿素(6 mol/L,4 mol/L,3 mol/L,2 mol/L,1 mol/L,0.5 mol/L,0 mol/L),20 mmol/L Tris·HCl,1 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl,0.25% NP40,調(diào)整pH至8.0；復(fù)性緩沖液：尿素(6 mol/L,4 mol/L,3 mol/L,2 mol/L,1 mol/L,0.5 mol/L,0 mol/L)，50 mmol/L NaH2PO4,100 mmol/L

10、NaCl,20 mmol/L Tris·HCl,1 mmol/L EDTA,0.25% NP40,調(diào)整pH至8.0。 1.2 方 法 1.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)與誘導(dǎo)表達(dá) 將37 ，250 r/min 培養(yǎng)過(guò)夜的菌液按照1100體積比接種于新鮮的含0.1 g/L氨芐西林和0.025 g/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至D(600 nm)為0.60.8，此時(shí)取1 ml菌液，離心收集菌體，置于-20 以下冰箱內(nèi)凍存，作為誘導(dǎo)前陰性對(duì)照，其余部分加入終濃度為1 mmol/L的IPTG繼續(xù)在上述條件下培養(yǎng)6 h。將每100 ml的LB液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)的菌體用pH 7.4的PBS洗滌2次，離

11、心收集菌體，稱重后備用。 1.2.2 融合蛋白的純化 取一份備用的菌體，按Profinity IMAC金屬螯合填料的使用說(shuō)明：以含8 mol/L尿素的結(jié)合緩沖液與收集的菌體濕重之比為10 ml1 g加入結(jié)合緩沖液，反復(fù)凍融3次后冰浴中超聲裂解，離心收集上清，過(guò)濾，加入含有1 ml填料的平衡柱中，用含有20 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液洗滌，待流出液D(280 nm)趨近于0時(shí)，加入含有250 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫液即為目的蛋白，用Bradford測(cè)定蛋白濃度。 1.2.3 3種方法復(fù)性融合蛋白 1.2.3.1 稀釋復(fù)性 將上述純化的變性蛋白逐滴加入復(fù)性稀釋液(臨用前加入0

12、.2 mmol/L PMSF，0.2 mmol/L GSSG，2 mmol/L GSH，0.6 mol/L L精氨酸)，使蛋白終濃度在0.050.1 g/L范圍，于4低速攪拌復(fù)性24 h以上，再用PBS透析過(guò)夜。在4用吹干法或PEG20000濃縮蛋白，10 000 r/min，離心15 min，收集上清測(cè)濃度。 1.2.3.2 透析復(fù)性6 將純化的目的蛋白，調(diào)整濃度為0.11 g/L裝入透析袋，置于20倍蛋白液體積的透析復(fù)性液(臨用前加入0.2 mmol/L PMSF，0.2 mmol/L GSSG，2 mmol/L GSH，0.6 mol/L L精氨酸，10%甘油，1%蔗糖，0.1%PEG

13、8000)中，每12 h更換透析復(fù)性液1次，按照6，4，3，2，1，0.5，0 mol/L的梯度依次降低尿素的濃度，最后用PBS透析過(guò)夜，濃縮方法如上。 1.2.3.3 柱上純化和復(fù)性7 取一份準(zhǔn)備好的包涵體蛋白，與上述包涵體蛋白純化步驟類似，所不同的是在流出液D(280 nm)趨近于0時(shí)，再加入含不同濃度尿素的復(fù)性緩沖液，使得尿素的濃度緩慢降低至0，最后加入不含尿素的洗脫緩沖液(其余成分不變)收集目的蛋白。第二種柱上復(fù)性的方法是根據(jù)在透析復(fù)性過(guò)程中，當(dāng)透析復(fù)性液中尿素的濃度從2 mol/L變?yōu)? mol/L時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)明顯的絮狀沉淀物，確定融合蛋白的重折疊的關(guān)鍵點(diǎn)在尿素濃度為2 mol/L左右

14、。因此，我們?nèi)∫环輦溆玫木w，根據(jù)比例加入含2 mol/L尿素的結(jié)合緩沖液(其余成分不變)，超聲裂解后離心，將上清加入含2 mol/L尿素的結(jié)合緩沖液平衡后的柱中，用含2 mol/L尿素洗滌緩沖液(其余成分不變)洗滌至流出液D(280 nm)趨近于0時(shí)，加入復(fù)性緩沖液(其余成分不變，尿素濃度梯度改為2，1.5，1，0.5，0 mol/L)使得尿素的濃度緩慢降低至0，然后用不含尿素的洗脫緩沖液(其余成分不變)收集目的蛋白。 1.2.4 融合蛋白鑒定及濃度測(cè)定 用Bradford測(cè)定蛋白濃度，SDSPAGE,蛋白質(zhì)印跡法鑒定表達(dá)的和純化復(fù)性后的蛋白。 1.2.5 融合蛋白穿膜活性檢測(cè) 將復(fù)性前和復(fù)

15、性后的融合蛋白以2 mol/L的濃度與5×105的Jurkat細(xì)胞共同孵育4 h，收集細(xì)胞，并用PBS洗兩次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)融合蛋白的穿膜效果。 2 結(jié) 果 2.1 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 經(jīng)12% SDSPAGE電泳分析，宿主菌用IPTG誘導(dǎo)后的總菌體蛋白電泳圖譜與誘導(dǎo)前陰性對(duì)照比較，在分子量約53 kD處出現(xiàn)一條較粗的蛋白帶(見(jiàn)圖1a)，與預(yù)計(jì)的PTDNFAT miniDBDeGFP蛋白分子量大小相符，且大部分以包涵體的形式存在。 2.2 不同復(fù)性方法所得蛋白濃度及復(fù)性得率 經(jīng)樹脂Profinity IMAC純化后復(fù)性前的蛋白總量為3.1 mg。稀釋復(fù)性后蛋白總量為0.537 mg，復(fù)

16、性率為17.3%；透析復(fù)性后蛋白總量為0.92 mg，復(fù)性率為30%；兩種柱上復(fù)性后測(cè)得蛋白總量分別為1.025和1.295 mg，復(fù)性率分別為33%和41.7%。 2.3 復(fù)性后融合蛋白的鑒定 純化后與復(fù)性后的PTDNFAT miniDBDeGFP融合蛋白經(jīng)12% SDSPAGE電泳分析可見(jiàn)，目的蛋白無(wú)論是在變性還是復(fù)性條件下，位置一致且均為單一的1條帶(圖1b)。蛋白質(zhì)印跡法分析顯示，復(fù)性后的蛋白與總菌體蛋白位置一致(圖2)。 2.4 不同復(fù)性方法所得融合蛋白穿膜效應(yīng) 復(fù)性后的融合蛋白經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示：PTDNFAT miniDBDeGFP融合蛋白能夠進(jìn)入Jurkat細(xì)胞，且3種

17、不同復(fù)性方法得到的融合蛋白在同樣條件下穿膜效應(yīng)以柱上復(fù)性方法2最高，稀釋復(fù)性效率相對(duì)較低，而未復(fù)性的蛋白穿膜能力最弱(圖3)。 3 討 論 重組蛋白在大腸桿菌高效表達(dá)時(shí)，往往以不溶的、無(wú)活性的包涵體形式存在于細(xì)胞內(nèi)。包涵體形式的重組蛋白需要復(fù)性才能得到有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)復(fù)性是蛋白的折疊與聚集競(jìng)爭(zhēng)的過(guò)程，是蛋白質(zhì)研究中面臨的最大困難。這個(gè)過(guò)程一方面受到復(fù)性條件的影響例如變性劑、蛋白性質(zhì)和濃度、復(fù)性液pH值和溫度、氧化還原環(huán)境、離子強(qiáng)度、助溶劑和時(shí)間等 3,8-11；另一方面也受到不同復(fù)性方法的影響。本文運(yùn)用了3種不同的方法對(duì)融合蛋白進(jìn)行復(fù)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柱上復(fù)性蛋白得率和穿膜效率最高，稀釋復(fù)性蛋白得率和穿膜效率最低。稀釋復(fù)性和透析復(fù)性耗時(shí)較長(zhǎng)(通常4896 h)，蛋白長(zhǎng)期在4 致使生物活性容易損失或喪失；而柱上復(fù)性可以使純化和復(fù)性一步完成，快速簡(jiǎn)單，縮短了操作時(shí)間。另外，根據(jù)蛋白的折疊關(guān)鍵點(diǎn)，我們運(yùn)用了兩種柱上復(fù)性的方法，其主要區(qū)別是變性劑的起始濃度一個(gè)是8 mol/L尿素，一個(gè)是2 mol/L尿素。尿素是一種較弱的變性劑，它通過(guò)離子間的相互作用，打開(kāi)包涵體蛋白質(zhì)分子的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展。對(duì)PTDNFAT miniDBDeGFP而言，2 mol/L尿素對(duì)蛋白的變性作用較小，去除尿