基因工程匯總

1、3、 基因工程的基本條件（1） 、用于核酸操作的工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶（修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵）、DNA聚合酶、核酸酶、核酸修飾酶（2）、用于基因克隆的載體：載體的功能及特征、質(zhì)粒（plasmid）、噬菌體或病毒DNA、考斯質(zhì)粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體載體的功能:1)、運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞2）、為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力3）、為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件載體應(yīng)具備的條件：1）具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）； 2）具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn) ； 3）具有較高的外源DNA的載裝能力 ； 4）具有多種單一

2、的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn) ； 5）具有合適的篩選標(biāo)記 。(3)、受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件：1）限制性缺陷型：外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-） 2）重組整合缺陷型：用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞（recA-） 3）具有較高的轉(zhuǎn)化效率4）具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型5）感染寄生缺陷型：防止重組細(xì)菌擴(kuò)散污染，生物武器除外 各種基因工程受體的特性1）、大腸桿菌：遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，重組子穩(wěn)定；產(chǎn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多的內(nèi)毒素；適用于外源DNA的擴(kuò)增和克隆、原核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫的構(gòu)建，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要受體菌。2）、枯草桿菌

3、：遺傳背景清楚，蛋白質(zhì)分泌機(jī)制健全 ，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，不產(chǎn)內(nèi)毒素；遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備；適用于原核生物基因的克隆、表達(dá)以及重組蛋白多肽的有效分泌。3）、鏈霉菌：抗生素的主要生產(chǎn)者，分子遺傳相對(duì)操作簡(jiǎn)便，不產(chǎn)內(nèi)毒素；遺傳不穩(wěn)定，生長(zhǎng)相對(duì)緩慢； 主要用于抗生素生產(chǎn)菌株的改良。4）、酵母菌：具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，外源基因表達(dá)系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定；內(nèi)源性蛋白產(chǎn)物種類繁多且含量高；適用于外源DNA的擴(kuò)增、克隆以及真核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫的構(gòu)建、真核生物基因表達(dá)調(diào)控的研究，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程重要的真核性受體菌。5）、昆蟲細(xì)胞（家蠶）：1、具有真核

4、生物的特征，外源基因表達(dá)量高，繁殖相對(duì)較快，培養(yǎng)成本低廉，遺傳穩(wěn)定； 2、DNA重組操作系統(tǒng)欠完善；適用于真核生物基因的高效表達(dá)。6）、哺乳動(dòng)物細(xì)胞（中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞 CHO） ：與人的親緣關(guān)系近，分子重組表達(dá)系統(tǒng)健全，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng)；細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻，生長(zhǎng)緩慢 ；適用于哺乳類動(dòng)物和人的基因表達(dá)調(diào)控研究、基因藥物的生產(chǎn)，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要哺乳動(dòng)物受體。7）、植物細(xì)胞（擬南芥菜、煙葉） ：農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)意義重大，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞易于分化，細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)單且成本低廉，具有光合作用；遺傳操作繁瑣 ；適用于高等植物基因表達(dá)調(diào)控的研究、基因藥物的生產(chǎn)，農(nóng)作物品質(zhì)的改良。實(shí)驗(yàn)室常用的基因工

5、程受體：大腸桿菌用于接受質(zhì)粒：DH5a、HB101、BL21(DE3)、 JM109、 JM110（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE392、ED8654 酵母菌畢赤酵母：GS115、X-33 、KM71、KM71H 啤酒酵母哺乳動(dòng)物細(xì)胞 CHO 四、基因工程的操作過程（1）、DNA的體外重組（切與接）：1、同種內(nèi)切酶生產(chǎn)的粘性末端的連接 2、同尾酶生產(chǎn)的粘性末端的連接 3、不同粘性末端的連接 4、人工粘性末端的連接 5、粘性末端的更換 6、重組率。重組率的定義：重組率 = 含有外源DNA的重組分子數(shù) / 載體分子總數(shù)。 在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下，重組率一般為25 - 75%。重組率是衡

6、量連接反應(yīng)效率的重要指標(biāo)，較高的重組率可以大大簡(jiǎn)化DNA重組的后續(xù)操作。提高重組率的方法：1、提高外源DNA片段與載體的分子比：5 : 1 - 10 : 1 ；2、載體DNA分子在連接前先除去磷酸基團(tuán)（可防止自連）； 3、加裝同聚尾末端；（2）、重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)與增）：1、轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)：Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化適用于革蘭氏陰性細(xì)菌（如大腸桿菌等），1970年建立此技術(shù)，其原理是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)叫做感受態(tài) 。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備：1、100 ml

7、菌體培養(yǎng)至OD600 = 0.5，離心收集菌體 ；2、用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液懸浮菌體，離心收集菌體；3、用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液懸浮菌體 4、冰浴放置12 - 24小時(shí)，備用 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：1、取100 ml 感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于50 ng 載體的重組DNA連接液，混勻；2、冰浴放置半小時(shí) ；4、在42保溫 2 分鐘（熱脈沖） ；5、快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1 - 2分鐘 ；6、加入1 ml 新鮮培養(yǎng)基，于37培養(yǎng) 1 小時(shí)（擴(kuò)增） ；7、涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選 。細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：革蘭氏陽性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈

8、霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常采用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蛑亟MDNA分子 。酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化 。細(xì)菌原生質(zhì)體的制備：不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細(xì)菌需生長(zhǎng)在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的敏感性。在制備過程中，菌體應(yīng)始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無水無去污劑 。細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：取0.2 - 1ml的原生質(zhì)體懸浮液（108-109個(gè)原生質(zhì)體），加入10 - 20 ml DNA重組連接液，同時(shí)加入含有PEG1000

9、和Ca2+的等滲溶液，混勻 。細(xì)菌原生質(zhì)體的再生：原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長(zhǎng)出細(xì)胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素 。l噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染：1、感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)： 將大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)至OD600 = 0.52、吸附： 加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液，30保溫10分鐘3、轉(zhuǎn)染裂解： 加入20倍體積的新鮮培養(yǎng)基，30培養(yǎng)2小時(shí)，直至培養(yǎng)液 中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選。電穿孔轉(zhuǎn)化：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)。在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙

10、，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，而且?guī)缀鯇?duì)所有含細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大；同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)化率的定義：轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。由于在一般的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)規(guī)模下，每個(gè)受體細(xì)胞最多只能接受一個(gè)載體分子，因此轉(zhuǎn)化率的定義也可以表征為：每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞接納DNA的個(gè)數(shù)，即克隆數(shù)（在篩選時(shí)，未接納載體或重組子的受體細(xì)胞不長(zhǎng)）。例如，pUC18對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率為108，即每微克pUC18中只有108個(gè)分子能進(jìn)入受體細(xì)胞。一微克pUC18共有3.4

11、X1011個(gè)分子（6.02X1017 / 2686X660），也就是說，每3400個(gè)pUC18分子才有一個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞 另一方面，在實(shí)際操作過程中，轉(zhuǎn)化一微克pUC18共需2ml感受態(tài)細(xì)胞，大約含有2X1010個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，也就是說，每200個(gè)細(xì)胞只有一個(gè)細(xì)胞能接納pUC18 DNA 轉(zhuǎn)化率的用途：利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì)DNA重組實(shí)驗(yàn)規(guī)模。例如，某一DNA重組實(shí)驗(yàn)的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107/mg載體， 經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低100倍，欲獲得104個(gè)重組克隆，需投入多少載體DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？ 轉(zhuǎn)化率的影響因素：1、載體及DNA重組分子方面： 1）、載體

12、本身的性質(zhì)：不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同 2）、載體的空間構(gòu)象：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級(jí) 。3）、插入片段的大?。簩?duì)質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低 。2、受體細(xì)胞方面：受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如：pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對(duì)大腸桿菌ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高 。3、轉(zhuǎn)化方法方面： 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增：轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時(shí)間培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，擴(kuò)增操作往往與轉(zhuǎn)化操作偶聯(lián)在一起，如： Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的37培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)；原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后

13、的再生過程；l噬菌體轉(zhuǎn)染后的30培養(yǎng)等，均屬擴(kuò)增操作 。擴(kuò)增操作的目的：增殖轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使得有足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選程序 ；擴(kuò)增和表達(dá)載體分子上的標(biāo)記基因，便于篩選； 表達(dá)外源基因，便于篩選和鑒定 。（3）、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（檢）：1、載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)； 2、克隆DNA序列檢測(cè)； 3、外源基因產(chǎn)物檢測(cè)。由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)：1、抗藥性篩選法：抗藥性篩選法的基本原理： 抗藥性篩選法可區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子。將外源DNA片段插在EcoRI位點(diǎn)： 非重組

14、子呈 Apr、Tcr 重組子呈 Apr、Tcr 將外源DNA片段插在BamHI位點(diǎn)： 非重組子呈 Apr、Tcr 重組子呈 Apr、Tcs 抗藥性篩選法的基本操作： 先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Ap的平板，再將Ap平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Ap和Tc的平板上，在Ap平板上生長(zhǎng)、但在Ap和Tc平板上不長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子即為重組子 。 2、 營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法：營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法的基本原理：營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，一般不能區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種營(yíng)養(yǎng)組份的合成基因，而受體細(xì)胞本身不能合成這一營(yíng)養(yǎng)組份，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在不含此營(yíng)養(yǎng)組份的培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出的便是轉(zhuǎn)化子。 常見的營(yíng)養(yǎng)缺陷型

15、篩選標(biāo)記： 用于大腸桿菌的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因常選用色氨酸生物合成基因trp+；用于高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相應(yīng)的受體細(xì)胞則選擇tk-缺陷型；3、 顯色篩選法：顯色篩選法的基本原理：顯色篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達(dá)產(chǎn)物能使細(xì)胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認(rèn)和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ基因（藍(lán)色反應(yīng)）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應(yīng)）等。顯色篩選法的基本操作： 將外源基因克隆在pUC18的lacZ標(biāo)記基因內(nèi)部，使之滅活，此時(shí)重組子呈Apr、lacZ-，淡黃色

16、菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍(lán)色菌落?？寺NA序列檢測(cè)：1、限制性酶切圖譜法：所謂的限制性酶切圖譜法就是對(duì)載體上插入的外源DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對(duì)比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)，工作量極大，實(shí)驗(yàn)成本也高。2、菌落噬菌斑原位雜交法：菌落或噬菌斑原位雜交法的工作原理是根據(jù)克隆的目的基因或DNA片段的同源序列設(shè)計(jì)并合成探針，以此搜尋篩選含有目的基因的目的重組子。其中，DNA同源序列之間的特異性互補(bǔ)雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù)。 菌落原位雜交法的基本操作：用硝酸纖維素薄膜影印克隆

17、平板，用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜，用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜 ，80烘干固定影印薄膜 ，薄膜置于含有探針的雜交溶液中保溫 用SSC-SDS液洗滌雜交薄膜 ，用X光膠片覆蓋薄膜感光 。雜交探針的制備：1、用于菌落或噬菌斑原位雜交的探針必須滿足下列條件：?jiǎn)捂溄Y(jié)構(gòu)（雙鏈DNA可用堿變性）； 足夠長(zhǎng)度（至少12個(gè)堿基）； 內(nèi)部不含互補(bǔ)區(qū) 。2、探針的制備方法或來源包括：人工合成 ；cDNA合成 ；同源序列 ；mRNA 。雜交探針的標(biāo)記：T4-PNP介導(dǎo)的末端標(biāo)記；逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記；DNA聚合酶介導(dǎo)的缺刻前移標(biāo)記；ABC熒光標(biāo)記；地高辛系統(tǒng)標(biāo)記；3、DNA序列分析法：雙脫氧末端終止測(cè)

18、序法的基本原理： DNA序列測(cè)定是精確鑒定目的基因的重要手段，目前國(guó)際上流行采用Sanger發(fā)明的雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反應(yīng)的進(jìn)程中，通過位點(diǎn)特異性終止測(cè)定DNA序列其關(guān)鍵技術(shù)有：DNA鏈聚合反應(yīng)時(shí)的定點(diǎn)隨機(jī)中斷（ddNTP）；聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨率（600 bp / 601 bp）；電腦自動(dòng)檢測(cè)、記錄、編輯程序；用于DNA測(cè)序的專一性試劑盒（Kit）。 1、外源基因產(chǎn)物檢測(cè)：2、蛋白質(zhì)生物功能測(cè)定法：3、淀粉酶目的基因的鑒定：淀粉酶能將淀粉水解為多糖或單糖。將難溶淀粉酶能將淀粉水解為多糖或單糖。將難溶于水的淀粉加入固體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基呈混濁狀。將待鑒定

19、的重組克隆涂布在此培養(yǎng)基上，含目的基因的目的重組子可表達(dá)的淀粉酶分泌出胞外，并均勻擴(kuò)散，同時(shí)降解淀粉為可溶性多糖或單糖。因此，目的重組子菌落周圍會(huì)形成透明圈。如果透明圈不明顯，還可往培養(yǎng)板上噴碘，使淀粉所在區(qū)域呈藍(lán)色本底，易于辨認(rèn)。蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用類似的方法進(jìn)行鑒定。4、抗菌素抗性基因的鑒定：抗菌素抗性基因表達(dá)的蛋白質(zhì)能使受體細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)該抗生素的抗性。據(jù)此，只需往培養(yǎng)板中加入適量抗生素，理論上長(zhǎng)出的菌落即是含有目的基因的目的重組子。在實(shí)際操作過程中，由于抗生素有時(shí)會(huì)誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生抗性，因此必須從抗性重組克隆中抽出重組質(zhì)粒，二次轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。如果此時(shí)轉(zhuǎn)化平板上出現(xiàn)大量的抗性菌落

20、，即可認(rèn)為這種抗性確由目的基因的編碼產(chǎn)物產(chǎn)生。5、DNA結(jié)合蛋白編碼基因的鑒定：用氯仿蒸汽或烈性噬菌體噴灑克隆平板 ，用聚乙烯薄膜影印裂解平板 ，輕輕漂洗影印薄膜，干燥固定 ，80烘干固定影印薄膜 ，與探針溶液中雜交，洗滌、干燥、感光探針選用能與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的DNA 片段。 6、DNA結(jié)合蛋白編碼基因的鑒定：用氯仿蒸汽或烈性噬菌體噴灑克隆平板 ，用聚乙烯薄膜影印裂解平板 ，輕輕漂洗影印薄膜，干燥固定 ，80烘干固定影印薄膜 ，與探針溶液中雜交，洗滌、干燥、感光 。7、雜交釋放轉(zhuǎn)譯鑒定： 無細(xì)胞體外翻譯系統(tǒng)：麥胚提取物、網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物8、蛋白質(zhì)生物結(jié)構(gòu)鑒定法：9、放射免疫原位雜交鑒定：用

21、氯仿蒸汽或烈性噬菌體噴灑克隆平板 ，用固定了特異性抗體的聚乙烯薄膜影印裂解平板 ，輕輕漂洗影印薄膜，干燥固定 ，與I125標(biāo)記的IgG保溫洗滌、干燥、感光 。10、聚丙烯酰胺凝膠電泳法：如果待篩選鑒定的目標(biāo)蛋白既不能測(cè)定生物活性，又無現(xiàn)成的抗體使用，則可采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行粗略的篩選。五、 目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建1、鳥槍法 2、cDNA法 3、PCR法 4、化學(xué)合成法 5、 基因文庫的構(gòu)建基因工程或DNA重組技術(shù)三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后，或確定其表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能，或建立高效表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因工程菌（細(xì)胞），或?qū)⒛?/p>

22、的基因在體外進(jìn)行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，然后輸回細(xì)胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構(gòu)建感興趣的生物個(gè)體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克隆；另一類是利用PCR擴(kuò)增技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達(dá)。1、鳥槍法 鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略：隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進(jìn)而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離。 鳥槍法操作的改進(jìn)：1、使用特征性限制性內(nèi)切酶切

23、開染色體DNA ：使用這一改進(jìn)方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率 2、在連接前將DNA片段進(jìn)行分級(jí)分離 ：3、凝膠DNA片段回收技術(shù) ：凍融法、濾紙法、吸附法、低融點(diǎn)凝膠法、溶解法鳥槍法克隆目的基因的局限性：工作量較大，需要了解目的基因的背景知識(shí)；不能獲得的最小長(zhǎng)度的目的基因；不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。2、cDNA法：cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略：1）、cDNA第一鏈的合成 ：2）、cDNA第二鏈的合成 ：1、自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈c

24、DNA 5端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失2、置換合成法：獲得的雙鏈cDNA 5端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失3、引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的5端序列3）、雙鏈cDNA的克隆 cDNA法分離目的基因的基本程序：1、完備分離程序 ：提取細(xì)胞總mRNA，合成總cDNA，將之全部克隆，然后借助于合適的篩選手段找到目的重組子；篩選時(shí)，若使用的是多拷貝載體，則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達(dá)型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選；完備分離程序適用于mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子VIII基因等 。2、特異分離程序：提取細(xì)胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)mRNA，由

25、此合成雙鏈cDNA，然后進(jìn)行克隆；特異分離程序較適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等 3、差異分離程序 ：利用兩組細(xì)胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對(duì)應(yīng)的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因 例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細(xì)胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達(dá)的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是要分離克隆這些新基因，進(jìn)而研究其生物學(xué)功能 cDNA法克隆目的基因的局限性：并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu) ；細(xì)菌或原核生物的mRNA半衰期很短；mRNA在細(xì)胞中含量少，對(duì)酶和堿極為敏感，分離純化困難；僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因 。 3、 PCR法：PCR法

26、定向擴(kuò)增目的基因的基本原理PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又稱為聚合酶鏈反應(yīng)或PCR擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效快速的體外DNA聚合程序。使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴(kuò)增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物 。 PCR克隆目的基因的基本程序：由Taq DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物中，其3末端總是會(huì)帶有一個(gè)非模板依賴型的突出堿基，而且這個(gè)堿基幾乎總是A，因?yàn)門aq DNA聚合酶對(duì)dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時(shí)即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的T載體克隆。4、化學(xué)合成法：化

27、學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略：1、全基因合成：化學(xué)合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：2、小片段粘接法：根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長(zhǎng)的單鏈DNA小片段3、補(bǔ)釘延長(zhǎng)法：根據(jù)目的基因兩條互補(bǔ)鏈全序列，分別合成12-15堿基長(zhǎng)的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長(zhǎng)的單鏈DNA中片段。4、大片段酶促法：根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長(zhǎng)的單鏈DNA片段上述三種方法各有利弊：化學(xué)合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學(xué)合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時(shí)，雖然化學(xué)合成的份額相對(duì)較小，成本較低，但大片段化學(xué)合成的收率極低，例如，每聚合一個(gè)單體

28、的產(chǎn)物收率為95%則合成50個(gè)堿基長(zhǎng)的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%。5、探針等寡聚核苷酸合成：在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此時(shí)需要從已知的氨基酸序列推測(cè)為其編碼的DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或cDNA法得到的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子。 由于大多數(shù)氨基酸擁有簡(jiǎn)并密碼子，故在探針序列的設(shè)計(jì)時(shí)必須考慮下列問題：生物體對(duì)簡(jiǎn)并密碼子的偏愛性，合成系列探針；探針應(yīng)具有足夠的長(zhǎng)度，通常在17-20個(gè)核苷酸之間；探針內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)可能的互補(bǔ)區(qū)域?；瘜W(xué)合成的單元操作：化學(xué)合成DNA的實(shí)質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個(gè)個(gè)接上去，每接

29、一個(gè)單體就是一個(gè)循環(huán)反應(yīng)，包括：基團(tuán)保護(hù)、分離、縮合、分離、去保護(hù)五大操作單元。 從反應(yīng)機(jī)理上來講，DNA化學(xué)合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸液三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡(jiǎn)便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設(shè)計(jì)的DNA化學(xué)合成的用途：1、合成天然基因：如生長(zhǎng)激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素基因等2、修飾改造基因：如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等 3、設(shè)計(jì)新型基因：制備探針、引物、接頭 。5、基因文庫的構(gòu)建：基因庫（gene pool）：特定生物體全基因組的集合（天然存在）

30、基因文庫（gene library or gene bank）：從特定生物個(gè)體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構(gòu)建）。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：1、基因組文庫（含有全部基因）；2、cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）?；蛭膸鞓?gòu)建的基本戰(zhàn)略：用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體DNA；用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫，材料來自mRNA。在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時(shí)段的mRNA種類不同（即基因的表達(dá)譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然， cDNA文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫

31、?；蛭膸斓耐陚湫裕夯蛭膸斓耐陚湫允侵福涸跇?gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中： P = 任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕蔲 = 克隆片段的平均大小 / 生物基因組的大小 基因文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：除了盡可能高的完備性外，一個(gè)理想的基因文庫應(yīng)具備下列條件：1、重組克隆的總數(shù)不宜過大 以減輕篩選工作的壓力；2、載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度 避免基因被分隔克??；3、克隆與克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域 以利克隆排序；4、克隆片段易于從載體分子上完整卸下；5、重組克隆能穩(wěn)定保存、

32、擴(kuò)增、篩選。載體和受體的選擇：出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒；對(duì)于大型基因組（如動(dòng)植物和人類）需使用YAC或BAC載體；由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文庫構(gòu)建的載體通常選質(zhì)粒。用于基因文庫構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌?；蛭膸鞓?gòu)建的技術(shù)性問題：在基因組文庫的構(gòu)建過程中，最應(yīng)引起重視的問題是：嚴(yán)禁外源DNA片段之間的連接！為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列措施的組合： 1、將待連接的DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級(jí)分離；2、用堿性磷酸單酯酶除去DNA片段的末端磷酸基團(tuán)；3、用TdT酶在DNA片段的末

33、端上增補(bǔ)同聚尾末端?；蚪M文庫重組克隆的排序：酶切片段末端標(biāo)記法：將單一的YAC克隆插入DNA片段用限制性內(nèi)切酶分布均勻地水解成若干片段，末端標(biāo)記同位素；然后再用Sau3AI或MboI將末端標(biāo)記的DNA片段降解成碎片，聚丙烯酰胺凝膠電泳，每10個(gè)YAC克隆走在同一塊板上，形成10個(gè)克隆的特征性DNA指紋圖譜；電腦分析指紋圖譜，如發(fā)現(xiàn)任何兩個(gè)克隆DNA的指紋圖譜有部分相同的，則其兩個(gè)YAC片段就有互相重疊的可能性，于是這兩個(gè)YAC克隆的DNA片段克隆在染色體上是排列一起的。隨機(jī)探針聯(lián)合雜交法：將若干YAC克隆固定在薄膜上，并復(fù)制二十份薄膜；合成20種不同序列的短探針，其序列是隨機(jī)的；用20種探針

34、隨機(jī)定位雜交（一對(duì)一）20份YAC克隆薄膜；如果某兩個(gè)克隆同時(shí)對(duì)同一種探針呈現(xiàn)雜交陽性反應(yīng)，則這兩個(gè)克隆有可能是相互重疊的。若將雜交陽性結(jié)果記為“1”，而陰性結(jié)果記為“0”，可清晰地列成一張表，最終排出上述YAC克隆的排列順序。 染色體走讀法（chromosome walking）從基因文庫中任取一個(gè)克隆作為染色體走讀的起點(diǎn)，將之兩端序列分別亞克隆，亞克隆片段在0.5 - 2.0 kb范圍內(nèi)；分別以上述亞克隆DNA片段為探針，雜交同一基因文庫，雜交陽性克隆中的插入DNA片段必定與起點(diǎn)克隆所含的DNA片段連鎖在一起；然后再以陽性克隆片段的兩端序列為探針，進(jìn)行第二步走讀，直至線型染色體DNA的端點(diǎn)

35、。六、大腸桿菌基因工程1、大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)：1、全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開放型閱讀框架；2、基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善；3、繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定；4、被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物。大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)：缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能；缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)；內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白；細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素。外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理：?jiǎn)?dòng)子、終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、密碼子、質(zhì)?？截悢?shù)。終止子強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性：外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即

36、RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長(zhǎng)短不一的mRNA混合物 過長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會(huì)影響外源基因的表達(dá)，其原因如下： 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長(zhǎng)，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需的時(shí)間就相應(yīng)增加，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； 過長(zhǎng)的mRNA往往會(huì)產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗； 更為嚴(yán)重的是，過長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率。強(qiáng)終止

37、子的選擇與使用：目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf。對(duì)于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用。終止子也可以象啟動(dòng)子那樣，通過特殊的探針質(zhì)粒從細(xì)菌或噬菌體基因組DNA中克隆篩選。核糖體結(jié)合位點(diǎn)：外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時(shí)可高達(dá)數(shù)百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5 端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）。

38、 核糖體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)：大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素：位于翻譯起始密碼子上游的6-8個(gè)核苷酸序列5UAAGGAGG 3，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識(shí)別大腸桿菌核糖體小亞基中的16S rRNA 3端區(qū)域3 AUUCCUCC 5并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動(dòng)翻譯；翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點(diǎn)，但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子；SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成；基因編碼區(qū)5 端若干密碼子的堿基序列。 核糖體結(jié)合位點(diǎn)對(duì)外源基因表達(dá)的影響：SD序列的影響：一般來說，mRNA與

39、核糖體的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于SD序列與16S rRNA的堿基互補(bǔ)性，其中以GGAG四個(gè)堿基序列尤為重要。對(duì)多數(shù)基因而言，上述四個(gè)堿基中任何一個(gè)換成C或T，均會(huì)導(dǎo)致翻譯效率大幅度降低。 SD序列與起始密碼子之間的序列的影響：SD序列下游的堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的50%和25%。緊鄰AUG的前三個(gè)堿基成份對(duì)翻譯起始也有影響，對(duì)于大腸桿菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個(gè)位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，則酶的表達(dá)水平低20倍。SD序列與起始密碼子之間的精

40、確距離保證了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的P位，這是翻譯啟動(dòng)的前提條件。在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個(gè)堿基處，在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基，均會(huì)導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低。起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響：大腸桿菌中的起始tRNA分子可以同時(shí)識(shí)別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子，但其識(shí)別頻率并不相同，通常GUG為AUG的50%而UUG只及AUG的25%。除此之外，從AUG開始的前幾個(gè)密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至少這一序列不能與mRNA的5 端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會(huì)嚴(yán)重干擾mRNA在核糖體上的準(zhǔn)確定位。目前廣泛用于外

41、源基因表達(dá)的大腸桿菌表達(dá)型質(zhì)粒上，均含有與啟動(dòng)子來源相同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列，序列和間隔是最佳的 密碼子生物體對(duì)密碼子的偏愛性：不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)簡(jiǎn)并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是：生物基因組中的堿基含量 在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體fX174）基因組中，密碼子第三位上的U和A出現(xiàn)的頻率較高；而在GC豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有G或C的簡(jiǎn)并密碼子占90%以上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。密碼子與反密碼子相互作用的自由能 性中等強(qiáng)度規(guī)律如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；如GUG、CAC、UCG、A

42、GC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；細(xì)胞內(nèi)tRNA的含量密碼子偏愛性對(duì)外源基因表達(dá)的影響：由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個(gè)重要因素是密碼子的正確選擇。一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá)： 雙鏈cDNA的克隆 、同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因、外源基因全合成：按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)律，設(shè)計(jì)更換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡(jiǎn)并密碼子，重組人胰島素、干擾素以及生長(zhǎng)激素在大腸桿菌中的高效表達(dá)均采用了這種方法 。同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因：對(duì)于那些含有不和諧密碼

43、子種類單一、出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大的外源基因而言，則選擇相關(guān)tRNA編碼基因同步克隆表達(dá)的策略較為有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412個(gè)密碼子中，共含有22個(gè)精氨酸密碼子，其中7個(gè)AGG、2個(gè)AGA，而大腸桿菌受體細(xì)胞中tRNAAGG和tRNAAGA的豐度較低。為了提高人尿激酶原cDNA在大腸桿菌中的高效表達(dá)，將大腸桿菌的這兩個(gè)tRNA編碼基因克隆在另一個(gè)高表達(dá)的質(zhì)粒上。由此構(gòu)建的大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細(xì)胞對(duì)外源基因高效表達(dá)的制約作用。質(zhì)?？截悢?shù)：質(zhì)粒拷貝數(shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的影響：目前實(shí)驗(yàn)室里廣泛使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝，質(zhì)粒的擴(kuò)增過程

44、通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，而此時(shí)正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降 解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制：pCP3擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)制子在28時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)為60在42時(shí)，拷貝數(shù)迅速增至300 - 600在此溫度下，受體細(xì)胞染色體上的CI基因表達(dá)的溫度敏感型阻遏蛋白失活，因此，用一種手段同時(shí)控制質(zhì)?？截悢?shù)和基因的表達(dá)。大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略：1、包涵體型異源蛋白的表達(dá) 2、分泌型異源蛋白的表達(dá) 3、

45、融合型異源蛋白的表達(dá) 4、寡聚型異源蛋白的表達(dá) 5、整合型異源蛋白的表達(dá) 6、蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體及其性質(zhì)：在某些生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長(zhǎng)在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細(xì)胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會(huì)喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)

46、。除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：1、能簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作 包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來2、能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用基本上對(duì)異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)：以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象（因而具有生物活性）的目標(biāo)蛋白，因此包涵體變復(fù)性操作的效率對(duì)

47、目標(biāo)產(chǎn)物的收率至關(guān)重要。然而，這也是一個(gè)技術(shù)難題，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過30%。以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的操作如果未進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)（如分泌型表達(dá)或融合型表達(dá)），外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白量占細(xì)胞總蛋白量20%以上時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物一般傾向于形成包涵體。因此，以包涵體形式表達(dá)目的基因操作的關(guān)鍵就是選擇高表達(dá)的載體。事實(shí)上，這種高表達(dá)率也是包涵體法的長(zhǎng)處所在。分泌型異源蛋白的表達(dá)在大腸桿菌中表達(dá)的異源蛋白按其在細(xì)胞中的定位可分為兩種形式：即以可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中；或者通過運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)，甚至穿過外膜進(jìn)入培

48、養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物N端信號(hào)肽序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前提條件以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)：分泌表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：目的蛋白穩(wěn)定性高 重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周中，其穩(wěn)穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中的10倍；目的蛋白易于分離；目的蛋白末端完整 相當(dāng)多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基。當(dāng)這些真核基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，蛋白質(zhì)N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸桿菌的信號(hào)肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達(dá)，其N端的甲硫氨酸殘基便可在信號(hào)肽的剪切過程中被有效除去。分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)：相對(duì)其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)

49、，少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制：原核細(xì)菌周質(zhì)中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白的隨機(jī)折疊，分泌在細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián)，因此與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構(gòu)象，生物活性的回收率增加，且對(duì)蛋白酶不敏感。 融合型異源蛋白的表達(dá)除了直接表達(dá)異源蛋白外，還可將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個(gè)開放型閱讀框架進(jìn)行表達(dá)。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常受體細(xì)菌的蛋白部分位于N端，異源蛋白

50、位于C端。通過在DNA水平上人工設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白。以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)：1、目的蛋白穩(wěn)定性高 尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳；2、目的蛋白易于分離 利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn)行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白；3、目的蛋白表達(dá)率高 與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件；4、目的蛋白溶解性好 由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性；5、目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段。目的蛋白的回

51、收：融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性，如果將之注入人體還會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)，因此在制備和生產(chǎn)藥用目的蛋白時(shí)，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點(diǎn)專一性斷裂方法有兩種：化學(xué)斷裂法、酶促裂解法 化學(xué)斷裂法：用于蛋白位點(diǎn)專一性化學(xué)斷裂的最佳試劑為溴化氰（CNBr）它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個(gè)多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是回收率高（可達(dá)到85%以上），專一性強(qiáng)，而且所產(chǎn)生的目的蛋白的

52、N端不含甲硫氨酸，與真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近。然而，如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法。酶促裂解法：?jiǎn)螝埢稽c(diǎn)蛋白酶酶促裂解法的特點(diǎn)是斷裂效率更高，同時(shí)每種蛋白酶均具有相應(yīng)的斷裂位點(diǎn)決定簇，因此可供選擇的專一性斷裂位點(diǎn)范圍較廣。幾種斷裂位點(diǎn)專一性最強(qiáng)的商品化蛋白酶分別在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基處切開酰胺鍵，形成不含上述殘基的下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相似。用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提條件是外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基，如果外源基因表達(dá)產(chǎn)物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但大分子量的異源蛋白來說，上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)

53、頻率是相當(dāng)高的。酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)為了克服僅切單一氨基酸殘基的蛋白酶所帶來的應(yīng)用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接頭片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的識(shí)別和作用序列，其斷裂位點(diǎn)在Arg的C末端。純化后的融合蛋白用Xa處理，即可獲得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的識(shí)別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物。寡聚型異源蛋白的表達(dá)：從理論上講，外源基因的表達(dá)水平與受體細(xì)胞中可轉(zhuǎn)錄基因的拷貝數(shù)（即基因

54、劑量）呈正相關(guān)。然而重組質(zhì)粒除了含有外源基因外，還攜帶其它的可轉(zhuǎn)錄基因，如作為篩選標(biāo)記的抗生素抗性基因等。隨著重組質(zhì)粒拷貝數(shù)的不斷增加，受體細(xì)胞內(nèi)的大部分能量和原料被用于合成所有的重組質(zhì)粒編碼蛋白，而細(xì)胞的正常生長(zhǎng)代謝卻因能量不濟(jì)受到影響，因此通過增加質(zhì)粒拷貝數(shù)提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量往往不能獲得滿意的效果。 另一種通過增加外源基因劑量而提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)量的有效方法是構(gòu)建寡聚串聯(lián)型異源蛋白表達(dá)載體，即將多拷貝的外源基因克隆在一個(gè)低拷貝質(zhì)粒上，以取代單拷貝外源基因在高拷貝載體上表達(dá)的策略。以寡聚形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)：1、目的蛋白高效表達(dá) 在不提高質(zhì)粒拷貝數(shù)的前提下，增加目的基因的拷貝數(shù)，可以

55、在一定程度上改善表達(dá)量；2、穩(wěn)定表達(dá)小分子短肽 短肽由于缺乏有效的空間結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌細(xì)胞中的半衰期較短。串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)相似的長(zhǎng)度及空間結(jié)構(gòu)，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高；3、目的產(chǎn)物回收困難 寡聚短肽需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲最終分子，但裂解后的短肽分子容易出現(xiàn)序列不均一性。整合型異源蛋白的表達(dá)：以整合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)：1、目的基因穩(wěn)定表達(dá) 整合型的目的基因隨受體細(xì)胞染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制，在大多數(shù)情況下相當(dāng)穩(wěn)定，工程菌在沒有選擇壓力存在下可以連續(xù)培養(yǎng)而不丟失目的基因表達(dá)盒，這對(duì)以改良物種遺傳性狀為目的的基因工程案例特別有意義2、目的基因表達(dá)率低單拷貝整合的目的基因表達(dá)率受

56、到限制，此時(shí)可通過強(qiáng)化表達(dá)元件而加以補(bǔ)償DNA體內(nèi)重組的基本原理：在生物體細(xì)胞尤其是原核細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，廣泛存在著DNA的遺傳重組機(jī)制，其可能的生物學(xué)功效是促進(jìn)生物種群的進(jìn)化。細(xì)胞內(nèi)的遺傳重組可分為兩大類：轉(zhuǎn)位因子依賴型、同源序列依賴型轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子家族 轉(zhuǎn)位因子是指生物細(xì)胞內(nèi)天然存在的一類無復(fù)制能力的DNA可移動(dòng)因子，不同生物種群擁有結(jié)構(gòu)不同的轉(zhuǎn)位因子；同源序列依賴型的體內(nèi)重組：基本形式在很多原核細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA鏈上的兩個(gè)同源區(qū)之間可發(fā)生所謂的同源重組，其頻率與細(xì)菌種類、兩個(gè)同源區(qū)之間的距離同源區(qū)的長(zhǎng)度、同源程度密切相關(guān)。一般地說，距離越遠(yuǎn)、長(zhǎng)度越長(zhǎng)、同源性越高，重組的頻率也就越高，反之亦然。 同源重組有整合和交換兩種形式，前者只需要一個(gè)斷裂位點(diǎn)，而后者涉及兩個(gè)斷裂位點(diǎn)。基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式：基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性 重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失；分配不穩(wěn)定性 整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸（curing）工程菌遺傳不穩(wěn)定性的產(chǎn)生機(jī)制：受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對(duì)外源重組DNA分子的降解；外源基因的高效