腫瘤細胞培養(yǎng)

1、關(guān)于腫瘤細胞培養(yǎng)1第一頁，共80頁幻燈片2內(nèi)容綱要p腫瘤細胞體外培養(yǎng)的重要性和應(yīng)用p體外培養(yǎng)腫瘤細胞的特征p腫瘤細胞系的建立p癌細胞系的建立p轉(zhuǎn)化細胞系的建立p癌細胞系和轉(zhuǎn)化細胞系的鑒定第二頁，共80頁幻燈片3一、腫瘤細胞體外培養(yǎng)的重要性和應(yīng)用p腫瘤細胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，當(dāng)前建立的細胞系中癌細胞系是最多的。p腫瘤細胞培養(yǎng)是研究癌變機理、抗癌藥檢測、腫瘤細胞和癌分子生物學(xué)極其重要的手段。腫瘤細胞培養(yǎng)對闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用。第三頁，共80頁幻燈片41、腫瘤病因和發(fā)病機制的研究p體外試驗證明了物理因素（如射線）、化學(xué)因素（化學(xué)致癌劑）及生物因素（致癌病毒、EB病毒、SV40和

2、多發(fā)瘤病毒等），均能使正常細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，致使正常細胞永生化或惡性化，為癌的誘發(fā)因素和環(huán)境提供了實驗依據(jù)。p環(huán)境因素或藥物的致畸、致突變研究也可為該環(huán)境條件或藥物的致癌性提供實驗依據(jù)，因此細胞培養(yǎng)是癌的發(fā)生和發(fā)展研究的理想實驗研究手段。第四頁，共80頁幻燈片52、抗癌藥物篩選方面的研究p不同的癌細胞對不同的化療藥物具有不同的敏感性。p采用癌細胞體外培養(yǎng)方法，既可研究某種藥物對不同癌細胞的敏感性，為藥物抗癌敏感譜提供依據(jù)；p同時又可采用某種癌細胞開展對不同藥物，不同劑量的敏感性研究，以篩選出對該腫瘤最敏感的化療藥物和使用劑量，供人體治療時參考。第五頁，共80頁幻燈片63、癌基因和抑癌基因方面的研究

3、p實驗證明癌的發(fā)生和發(fā)展與癌基因（原癌基因）和抑癌基因兩種基因的表達調(diào)控密切相關(guān)。p體外細胞培養(yǎng)既利于測定癌基因及癌基因表達產(chǎn)物，又可以測定抑癌基因的表達水平。癌細胞的體外培養(yǎng)是定量研究癌基因和抑癌基因表達調(diào)控的理想工具。第六頁，共80頁幻燈片74、癌細胞的誘導(dǎo)分化和逆轉(zhuǎn)方面的研究p血癌往往是由低分化的幼稚細胞的單克隆惡性增生所引起，若將血癌的體細胞通過體外誘導(dǎo)分化，促使向終未細胞分化成為功能性血液細胞，這就可使血癌患者獲得完全緩解或達到治愈的目的。p這些試驗只有采用細胞培養(yǎng)法才能在短期內(nèi)觀察到細胞的變化，動物試驗很難判定藥物的直接作用，因此細胞培養(yǎng)及癌的細胞誘導(dǎo)分化的細胞工程是進行抗癌研究、

4、癌細胞的惡性逆轉(zhuǎn)研究理想的實驗誘導(dǎo)模型。第七頁，共80頁幻燈片85、癌細胞的殺傷效應(yīng)研究p抗癌的間接效應(yīng)，往往是藥物作用于機體免疫系統(tǒng)促使免疫細胞發(fā)生對腫瘤細胞的特異性和非特異性的免疫應(yīng)答，如釋放免疫調(diào)節(jié)因子（如IFN、IL-2等）或細胞毒因子（LT、TNF/），以及激活殺傷腫瘤的淋巴細胞發(fā)揮殺腫瘤效應(yīng)。p這種效應(yīng)均可通過體外殺腫瘤細胞試驗來證實，取同體淋巴細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，并加入IL-2/IFN-等，能明顯增強NK、TCL、LAK和TIL殺腫瘤活性。經(jīng)擴增達一定數(shù)量后再回輸給病人，其療效明顯。第八頁，共80頁幻燈片9二、體外培養(yǎng)腫瘤細胞的特征 腫瘤細胞與體內(nèi)正常細胞相比，不論在體內(nèi)或在體外，

5、在形態(tài)、生長增殖、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。第九頁，共80頁幻燈片10p培養(yǎng)中癌細胞無光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數(shù)鏡下觀察比二倍體細胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核漿比例大。 p電鏡觀察癌細胞表面的微絨毛多而細密，微絲走行不如正常細胞規(guī)則。 1、形態(tài)第十頁，共80頁幻燈片112、生長增殖（不受控增殖性）p失去接觸抑制失去接觸抑制，細胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。p失去錨著依賴性失去錨著依賴性，可在瓊脂、甲基纖維素等支撐物上生長。p低血清要求，不依賴生長因子低血清要求，不依賴生長因子，因其可自分泌產(chǎn)生促增殖因子。p癌細胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個細胞培養(yǎng)時，形成集落（克?。┑哪芰Ρ?/p>

6、正常細胞強。第十一頁，共80頁幻燈片123、永生性p永生性永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細胞可無限傳代而不凋亡。體外培養(yǎng)中的腫瘤細胞系（株）都表現(xiàn)有這種性狀。p永生性和惡性（包括浸潤性）是兩種性狀，受不同基因調(diào)控。從一些具有永生性而無惡性的細胞系，如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等細胞可以證明。 第十二頁，共80頁幻燈片134、致瘤性p細胞接種同種動物或裸鼠后的致瘤性致瘤性是客觀反映細胞惡性程度的指標。p具體做法是： 1）收集培養(yǎng)的腫瘤細胞，用無血清培養(yǎng)液洗一遍；2）計數(shù)后將0.2ml含21062107個細胞的細胞懸液注射到動物皮下。約一個月左右（最短在3天后），可見注射局部有腫

7、瘤出現(xiàn)，甚至有轉(zhuǎn)移瘤形成。經(jīng)病理組織學(xué)檢查可以確定腫瘤是否由接種的細胞產(chǎn)生。也可接種到腹腔或通過鼠尾靜脈注射。第十三頁，共80頁幻燈片145、浸潤性p浸潤性是腫瘤細胞的擴張性增殖行為，培養(yǎng)癌細胞仍持有這種性狀。p在與正常組織混合培養(yǎng)時，能浸潤入其它組織細胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。 第十四頁，共80頁幻燈片156、異質(zhì)性p通過腫瘤細胞培養(yǎng)及克隆分析發(fā)現(xiàn)，同一腫瘤是由具有不同生物學(xué)特征的細胞亞群構(gòu)成的。這些細胞亞群的浸潤性、生長率、轉(zhuǎn)移能力、核型、對激素的反應(yīng)、對抗癌藥物的敏感性均不同，這種特性被稱為腫瘤細胞的異質(zhì)性（heterogeneity）。第十五頁，共80頁幻燈片16p同一腫瘤內(nèi)細

8、胞的活力有差別，有的細胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細胞稱腫瘤干細胞。只有腫瘤干細胞才是支持腫瘤生長的成分。第十六頁，共80頁幻燈片177、細胞遺傳 p大多數(shù)腫瘤細胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。第十七頁，共80頁幻燈片18 體外培養(yǎng)腫瘤細胞的三個顯著基本特征：u永生性u不受控增殖性u致瘤性第十八頁，共80頁幻燈片19三、腫瘤細胞系的建立p惡性腫瘤細胞培養(yǎng)建立細胞系，包括從人或動物惡性腫瘤取材建立癌細胞系和正常細胞在體外經(jīng)理化、生物因素誘發(fā)的轉(zhuǎn)化細胞系。p轉(zhuǎn)化細胞系可以是惡性轉(zhuǎn)化細胞和一般轉(zhuǎn)化細胞兩種。第十九頁，共80頁幻燈片20p惡性轉(zhuǎn)化細胞系和

9、癌細胞系一樣具有永生性和惡性表型，對此兩種來源的細胞系鑒定也是相似的，為研究惡性腫瘤提供了有用模型。p一般轉(zhuǎn)化細胞系只具有無限生長能力，不具有惡性細胞的表型，此種細胞系可相似于正常細胞的模型而被應(yīng)用。第二十頁，共80頁幻燈片21p癌細胞培養(yǎng)的最主要的問題是從體內(nèi)到體外環(huán)境的改變。p培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，有些腫瘤在體內(nèi)生長，但在體外卻難以生長。 癌細胞系的建立 第二十一頁，共80頁幻燈片22依賴性： 腫瘤細胞雖有較強克隆生長力，但仍有一定的群體性或與其它細胞相依存關(guān)系。一是腫瘤細胞與腫瘤細胞的相互依存，二是腫瘤細胞與基質(zhì)成纖維細胞的依賴。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細胞后也會同時消除或減弱這些依存關(guān)系，可能影

10、響癌細胞增殖生長的活性。 腫瘤細胞在體外不易生長的可能原因： 癌細胞系的建立 第二十二頁，共80頁幻燈片23 腫瘤細胞的自分泌也會因分散培養(yǎng)而被稀釋，達不到腫瘤生長的需求，降低腫瘤細胞的生長增殖力。 并非所有腫瘤細胞都有強的生長活力和長的生命周期，只有干細胞才有強的增殖生長能力，但這些細胞數(shù)量很少。 離體培養(yǎng)腫瘤細胞可能需求與體內(nèi)相似的特殊生存條件。 癌細胞系的建立 第二十三頁，共80頁幻燈片24（一）癌細胞原代培養(yǎng)p癌細胞建系的方法和程序相似于正常細胞，包括標本收集和處理、原代培養(yǎng)、傳代、換液、凍存、復(fù)蘇等過程。p培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面

11、。癌細胞系的建立 第二十四頁，共80頁幻燈片251、取材、取材 p人腫瘤細胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時盡量避免，要挑選活力較好的部位。p癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是很好的培養(yǎng)材料。癌細胞系的建立 第二十五頁，共80頁幻燈片26p取材后盡快將癌組織進行培養(yǎng)，一般4小時內(nèi)細胞存活最好。標本在4存放，不宜超過24小時。癌細胞系的建立 第二十六頁，共80頁幻燈片27p人癌細胞建系必須要有完整的記錄，包括組織來源、病人姓名、住院號、年齡、性別、臨床診斷、病理診斷（應(yīng)明確分類分期）、術(shù)前放化療情況，為細胞建系的重要材料。p為了鑒定建立的細胞系來源和生

12、物學(xué)特性，最好留有病人正常組織和血標本。癌細胞系的建立 第二十七頁，共80頁幻燈片282、分離、分離 p單純的機械方法機械方法分離如吹打和過濾對癌細胞損傷小。有些腫瘤如人卵巢癌、某些神經(jīng)膠質(zhì)瘤可采用。p癌組織多為較堅實的實體，腫瘤細胞包埋在大量的纖維基質(zhì)中，難以進行機械分離。因此酶消化法酶消化法是分散癌細胞的好方法。癌細胞系的建立 第二十八頁，共80頁幻燈片29p胰蛋白酶胰蛋白酶是分離細胞最常應(yīng)用的酶，但它對結(jié)締組織的消化能力有限，適合含結(jié)締組織較少的腫瘤，并且對細胞膜有損害作用，影響細胞存活。p膠原蛋白酶膠原蛋白酶僅對細胞間質(zhì)有消化作用而對上皮細胞影響不大，適于分離纖維性組織、上皮及癌組織。

13、癌細胞系的建立 常用酶：第二十九頁，共80頁幻燈片30p膠原酶的消化方法： 0.5mgml膠原酶處理，可在顯微鏡下觀察，纖維細胞逐漸被除去為止。用Hanks液或培養(yǎng)基洗滌，除去附著細胞的酶，再進行接種和培養(yǎng)。癌細胞系的建立 第三十頁，共80頁幻燈片31注意：o當(dāng)腫瘤組織標本很小，不能用酶消化獲取癌細胞時，可以用組織塊法進行原代培養(yǎng)。o癌組織中不可避免有已耗竭和壞死的細胞，在酶消化前，應(yīng)盡可能清除，以免接種后很快溶解破壞，釋放出影響癌細胞生長的有害物。癌細胞系的建立 第三十一頁，共80頁幻燈片323、接種細胞、接種細胞 p消化后制備的癌細胞，培養(yǎng)時應(yīng)有足夠的細胞密度，通常接種細胞濃度為5105m

14、l，37培養(yǎng)。癌細胞系的建立 第三十二頁，共80頁幻燈片334、成纖維細胞過度生長的去除、成纖維細胞過度生長的去除 p常采用機械刮除法、反復(fù)貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法和密度梯度離心法等。p用選擇培養(yǎng)基、飼養(yǎng)層等方法可以克服其過度生長。癌細胞系的建立 第三十三頁，共80頁幻燈片34 將玻璃吸管前端在火焰上燒彎曲，用作除去成纖維細胞的工具?？稍陲@微鏡下直接刮除生長的成纖維細胞，也可事先在顯微鏡下對有成纖維細胞生長的單層培養(yǎng)瓶上做出標記，然后按標記刮除。刮除后，用培養(yǎng)液洗12次后，加入新培養(yǎng)液培養(yǎng)。如需要可多次刮除。（1）機械刮除法癌細胞系的建立 第三十四頁，共80頁幻燈片35 根據(jù)腫瘤細胞比

15、成纖維細胞貼壁速度慢的特點，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細胞的細胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細胞相互分離。（2）反復(fù)貼壁法癌細胞系的建立 第三十五頁，共80頁幻燈片36l待細胞生長達一定數(shù)量后用胰酶消化，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液；l取編號為A、B、C三個培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A瓶中，置溫箱中靜止培養(yǎng)520分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B瓶中；向A瓶中補充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；l培養(yǎng)B瓶中細胞520分鐘后，接處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C瓶中；再向B瓶中補加完全培養(yǎng)基。l當(dāng)三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼

16、續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細胞，B瓶兩類細胞相雜，C瓶可能主要為癌細胞。必要時可反復(fù)處理多次。 癌細胞系的建立 第三十六頁，共80頁幻燈片37（3）消化排除法l先是用0.5%胰蛋白酶和0.02EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下觀察和不時搖動培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細胞脫落下來后，便立即停止消化；l把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶內(nèi)也補加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。l用此法處理后，成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經(jīng)過幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細胞除凈。 癌細胞系的建立 第三十七頁，共80頁幻燈片38

17、（4）膠原酶消化法 本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進行選擇。o可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細胞被除掉后，即終止消化； o用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈，可再次重復(fù)。 癌細胞系的建立 第三十八頁，共80頁幻燈片39（5）其它方法l聚丙烯酰胺抑制成纖維細胞生長l密度梯度離心等癌細胞系的建立 第三十九頁，共80頁幻燈片405、選擇性培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基 p選擇性培養(yǎng)基是針對特殊細胞生長的營養(yǎng)要求設(shè)計的。p在癌細胞建系中，選擇性培養(yǎng)基的應(yīng)用是提高癌細胞體外存活、抑制成纖維

18、細胞生長的關(guān)鍵技術(shù)改進。癌細胞系的建立 第四十頁，共80頁幻燈片41pHITES選擇培養(yǎng)基是一種改良RPMI-1640培養(yǎng)基，含有氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、雌激素、硒等成分。HITES培養(yǎng)基適合用于人小細胞肺癌建系。癌細胞系的建立 第四十一頁，共80頁幻燈片42p為了抑制成纖維細胞生長，在培養(yǎng)基中加入成纖維細胞的抗體或成纖維細胞代謝抑制成分，也可提高癌細胞系建系率。p血清對上皮細胞有抑制作用有利于成纖維細胞生長。因此用低或無血清培養(yǎng)基為好。癌細胞系的建立 第四十二頁，共80頁幻燈片436、飼養(yǎng)層、飼養(yǎng)層 p在培養(yǎng)器皿底部接種能形成接觸性抑制的成纖維細胞飼養(yǎng)層，可以有利于癌細胞生長和抑制癌組

19、織中正常成纖維細胞過度生長。p如人胎小腸細胞（FHs74 Int）、小鼠3T3細胞或STO鼠胚成纖維細胞。癌細胞系的建立 第四十三頁，共80頁幻燈片44（二）癌細胞原代培養(yǎng)的換液和傳代癌細胞系的建立 1、換液、換液o通常細胞產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物，培養(yǎng)上清呈黃色時，需要及時換液，癌細胞在對數(shù)期增殖迅速，每天均需換液，倍增時間較長的細胞可以隔日換一次。第四十四頁，共80頁幻燈片452、傳代、傳代p原代培養(yǎng)的癌細胞應(yīng)掌握合適的第二代傳代時間。腫瘤細胞與正常細胞生長特點不同，表現(xiàn)為重疊生長。當(dāng)在顯微鏡下觀察到上皮樣細胞匯合達50%左右，可見細胞層上堆積有圓形的細胞，指示細胞增殖活躍時就可以傳代。 癌細胞系

20、的建立 第四十五頁，共80頁幻燈片46p常規(guī)傳代：原代培養(yǎng)物第一次傳代后，需要常規(guī)傳代維持細胞在體外正常生長。p每種細胞系傳代時間有所不同。通常在細胞接種后5天左右傳代一次。一瓶癌細胞傳到15瓶。如果計數(shù)細胞濃度，每瓶可接種24105細胞。為建成永久性細胞系需長期傳代達50次以上。癌細胞系的建立 第四十六頁，共80頁幻燈片473、凍存和復(fù)蘇、凍存和復(fù)蘇 p建系過程需要不斷凍存細胞以防止細胞系中斷。從第一代傳代后，就應(yīng)盡早地凍存培養(yǎng)物。且凍存不同傳代次數(shù)的細胞。p凍存細胞和復(fù)蘇方法與正常細胞相同，可參照正常細胞。癌細胞系的建立 第四十七頁，共80頁幻燈片48（三）癌細胞系建立注意事項p取材應(yīng)選擇

21、活力較好的部位，盡快培養(yǎng)且要防止污染。p及時去除生長的成纖維細胞。p掌握好傳代時間，細胞沒有長到足夠量時不要急于傳代。p早期應(yīng)先以高濃度接種，再逐漸降低。p對于增殖能力低的細胞，應(yīng)放入飼養(yǎng)層中培養(yǎng)，并加入一些促生長物質(zhì)。p精心傳代、換液、避免污染，需經(jīng)半年以上的細胞培養(yǎng)，方能夠達到建立細胞系的目的。癌細胞系的建立 第四十八頁，共80頁幻燈片49 轉(zhuǎn)化細胞系的建立p培養(yǎng)細胞的轉(zhuǎn)化是指細胞發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的遺傳改變而引起恒定的表型改變。p可由細胞本身基因不穩(wěn)定（嚙齒類）在傳代中自發(fā)發(fā)生，也可用放射、致突變劑、病毒以及外源基因等因素處理，引起細胞產(chǎn)生遺傳改變。 第四十九頁，共80頁幻燈片50轉(zhuǎn)化的表型

22、變化主要有3類： p有限分裂的細胞變?yōu)闊o限增殖的細胞，獲得不獲得不死性死性，成為永久性細胞系。p細胞不正常自主性生長不正常自主性生長，喪失接觸抑制、過飽和密度、無停泊依賴等生長特點。p致瘤性致瘤性，細胞可在免疫缺陷小鼠體內(nèi)浸潤生長，形成腫瘤。 轉(zhuǎn)化細胞系的建立第五十頁，共80頁幻燈片51p致瘤性是判斷惡性轉(zhuǎn)化或一般轉(zhuǎn)化細胞系最主要的指標。轉(zhuǎn)化細胞系的建立第五十一頁，共80頁幻燈片52（一）誘變轉(zhuǎn)化細胞的方法1、轉(zhuǎn)化細胞的選擇、轉(zhuǎn)化細胞的選擇o可從原代培養(yǎng)的正常細胞、傳代的正常細胞選擇。成纖維細胞易于轉(zhuǎn)化，上皮細胞較難。轉(zhuǎn)化細胞系的建立第五十二頁，共80頁幻燈片53p化學(xué)致突變劑：常用的甲基硝基

23、亞硝基胍（N-methy-N-nitro-Nnitrosoguanidine，MNNG）；p物理方法：射線照射；p病毒轉(zhuǎn)化：用EB病毒感染淋巴細胞引起轉(zhuǎn)化，SV40病毒轉(zhuǎn)化正常細胞成為惡性細胞；p用外源基因轉(zhuǎn)染細胞，誘發(fā)細胞轉(zhuǎn)化，包括癌基因如ras、mye，病毒基因如SV40LT抗原基因和端粒酶基因等。2、轉(zhuǎn)化因素、轉(zhuǎn)化因素轉(zhuǎn)化細胞系的建立第五十三頁，共80頁幻燈片54（二）外源基因轉(zhuǎn)化細胞程序：程序： p選擇合適的外源基因，如SV40 LT抗原基因轉(zhuǎn)染人成纖維細胞有效。構(gòu)建外源基因表達載體（質(zhì)粒），含有合適的標記基因作為陽性傳染細胞的選擇（質(zhì)粒上有新霉素耐受基因，可用G418選擇）。轉(zhuǎn)化細胞

24、系的建立第五十四頁，共80頁幻燈片55p選擇合適的轉(zhuǎn)基因方法：化學(xué)方法最常用磷酸鈣、脂質(zhì)體、基因槍、電轉(zhuǎn)移等。p選擇合適的轉(zhuǎn)染細胞，易培養(yǎng)和傳代，無自發(fā)轉(zhuǎn)化能力。p用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)染細胞獲陽性集落。p證明外源基因有無表達。p證明轉(zhuǎn)染細胞的表型是否改變和有無致瘤性。轉(zhuǎn)化細胞系的建立第五十五頁，共80頁幻燈片561、SV40LT抗原基因轉(zhuǎn)化人的成纖維細胞抗原基因轉(zhuǎn)化人的成纖維細胞 p雖然鼠來源的成纖維細胞可以經(jīng)培養(yǎng)后成為長期培養(yǎng)的細胞系，但人的成纖維細胞在體外培養(yǎng)很難成為永久細胞系。用SV40LT抗原基因轉(zhuǎn)化人的成纖維細胞是最成功的方法。轉(zhuǎn)化細胞系的建立第五十六頁，共80頁幻燈片572、轉(zhuǎn)染端粒酶基

25、因、轉(zhuǎn)染端粒酶基因p端粒酶在細胞內(nèi)表達，抵消細胞分裂所致端?？s短，是細胞獲得不死性的重要分子機制。轉(zhuǎn)染外源端粒酶基因于有限期傳代的正常細胞系，包括人上皮細胞和成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞等，均可誘導(dǎo)產(chǎn)生永久性細胞系，并證明了轉(zhuǎn)染細胞中端粒酶表達和端?？s短受到了控制。轉(zhuǎn)化細胞系的建立第五十七頁，共80頁幻燈片58pSV40誘導(dǎo)的不死性細胞，伴有細胞不正常分化和核型不穩(wěn)定，表現(xiàn)出對動物一定程度的致瘤性。而端粒酶轉(zhuǎn)染的細胞很少有核型的改變和上皮細胞分化的特點，保持更多正常細胞的表型。說明SV40LT多引起細胞惡性轉(zhuǎn)化，而端粒酶基因主要誘導(dǎo)細胞獲得不死性。轉(zhuǎn)化細胞系的建立第五十八頁，共80頁幻燈片593、

26、轉(zhuǎn)基因小鼠、轉(zhuǎn)基因小鼠 p利用轉(zhuǎn)基因小鼠可以建立轉(zhuǎn)化細胞系，基本方法是設(shè)計有某種基因突變、缺失、嵌入的病毒基因DNA，植入小鼠的卵母細胞。發(fā)育的轉(zhuǎn)基因小鼠將攜帶有表達某種基因的組織，從小鼠組織取材，可以獲得轉(zhuǎn)化細胞系。因此，利用轉(zhuǎn)基因小鼠是建立細胞系快速有效的方法。轉(zhuǎn)化細胞系的建立第五十九頁，共80頁幻燈片60（三）EB病毒感染B細胞oEB病毒感染人外周血B淋巴細胞后，B細胞便能夠被轉(zhuǎn)化，并在體外傳代生長，建立細胞系，長期儲存在液氮，解決研究中大量細胞的來源。轉(zhuǎn)化細胞系的建立第六十頁，共80頁幻燈片61（四）轉(zhuǎn)化細胞系建立注意事項o建立轉(zhuǎn)化細胞系，通常用已建成的正常細胞系進行轉(zhuǎn)化，所以不存在上

27、述癌細胞建系原代培養(yǎng)所存在的問題。o能否建成轉(zhuǎn)化細胞，除要選擇合適的細胞系外（遺傳形狀過于穩(wěn)定的細胞不易轉(zhuǎn)化）對轉(zhuǎn)化方法的選擇也很關(guān)鍵。從轉(zhuǎn)基因小鼠組織取材建立細胞系在國外已有一些報告，該方法的應(yīng)用，不僅提高了建系率，而且使那些常規(guī)細胞培養(yǎng)方法不能建立的細胞系，通過轉(zhuǎn)基因動物可以建立攜帶某種靶基因的細胞系，為細胞培養(yǎng)和建立細胞系開拓了新的局面。轉(zhuǎn)化細胞系的建立第六十一頁，共80頁幻燈片62四、癌細胞系和轉(zhuǎn)化細胞系的鑒定p癌細胞系的鑒定主要包括細胞組織來源和惡性特征。p轉(zhuǎn)化細胞如果是正常細胞系轉(zhuǎn)化而來，不需再進行組織來源鑒定，僅明確是否已獲得了不死性，經(jīng)確定是惡性轉(zhuǎn)化或一般轉(zhuǎn)化。第六十二頁，共8

28、0頁幻燈片631、光鏡直接檢查2、細胞染色檢查3、細胞超微結(jié)構(gòu)的檢查（一）細胞形態(tài)學(xué)第六十三頁，共80頁幻燈片641、光鏡直接檢查、光鏡直接檢查p呈多邊形上皮樣細胞；p癌細胞失去接觸性抑制，呈現(xiàn)重疊生長。p可見細胞重疊層上有折光度強的圓形細胞。這些特點可與正常上皮細胞區(qū)分，轉(zhuǎn)化細胞可出現(xiàn)與癌細胞重疊生長相似的特點。第六十四頁，共80頁幻燈片652、細胞染色檢查、細胞染色檢查p見正常細胞鑒定，除Giemsa染色外，可用瑞氏結(jié)晶紫等染色p癌細胞呈多邊形，排列不規(guī)則，細胞重疊。細胞核大，核漿比例增大，深染突出、不規(guī)則，可見異常分裂象。有的上皮樣轉(zhuǎn)化細胞有相同特點。第六十五頁，共80頁幻燈片663、細

29、胞超微結(jié)構(gòu)的檢查、細胞超微結(jié)構(gòu)的檢查p細胞核大，不規(guī)則。胞漿內(nèi)如觀察到橋粒、張力原纖維等為上皮細胞的特點，觀察到分泌顆粒是腺細胞特點，如有神經(jīng)分泌顆粒是神經(jīng)內(nèi)分泌細胞特點。細胞超微結(jié)構(gòu)檢查對于鑒定細胞系的組織來源和細胞惡性特點有重要意義。第六十六頁，共80頁幻燈片67（二）染色體異常p癌細胞是異倍體，存在染色體缺失、重排和移位等異常。p染色體顯帶技術(shù)可用于檢查和鑒別正常細胞和惡性細胞染色體差異。此技術(shù)是用特殊技術(shù)將染色單體上著色出深淺帶（band），顯示染色體的結(jié)構(gòu)。第六十七頁，共80頁幻燈片68（三）體外生長異常p癌細胞（或轉(zhuǎn)化細胞）體內(nèi)外無控制增殖是惡性細胞的特征。癌細胞喪失正常細胞接觸性

30、抑制、停泊依賴等生長特點，表現(xiàn)為增殖加速，生長呈過飽和密度，在軟瓊脂上形成集落等不正常生長特點。通過以下實驗，對于鑒定惡性生長有重要意義。第六十八頁，共80頁幻燈片691、生長曲線和倍增時間、生長曲線和倍增時間p培養(yǎng)細胞經(jīng)歷一代（從上一代傳代到下一次傳代的時間），包括潛伏期、對數(shù)期、平坦期三個階段。通過計數(shù)7天細胞，可以記錄出生長階段，繪制出生長曲線，計算出細胞倍增時間?？设b定癌細胞和正常細胞群體生長增殖速度的差異。第六十九頁，共80頁幻燈片70p癌細胞潛伏期短，對數(shù)期生長明顯，轉(zhuǎn)化細胞與轉(zhuǎn)化前細胞相比較，可見轉(zhuǎn)化細胞對數(shù)期生長速度明顯增加。依據(jù)生長曲線，可計算出細胞倍增時間。倍增時間短，反映了細胞惡性生長。第七十頁，共80頁幻燈片712、克隆效應(yīng)（、克隆效應(yīng)（cloning efficiency）p克隆效應(yīng)也可稱為集落形成率（rate ov colohy formation），是檢測群體細胞中增殖細胞的比率，可反應(yīng)細胞系的增殖能力，因此是鑒別腫瘤細胞（或轉(zhuǎn)化細胞）與正