腫瘤藥理學(xué)實驗方法

1、關(guān)于腫瘤藥理學(xué)實驗方法第一頁，共78頁幻燈片 腫瘤（tumor），是機體在各種致病因素的作用下，局部組織的細(xì)胞異常增生而形成的新生物（neoplasm），常表現(xiàn)為局部腫塊。（白血病非局部腫塊）（白血病非局部腫塊）第二頁，共78頁幻燈片細(xì)胞毒類藥物 生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑 分化誘導(dǎo)劑 化學(xué)預(yù)防藥 逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性藥物 抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的藥物 放療及化療增敏劑 抗腫瘤藥物 第三頁，共78頁幻燈片細(xì)胞毒類藥物： 體外實驗方法； 動物腫瘤體內(nèi)篩選法； 抗癌藥作用機理研究方法 生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑：體內(nèi)抗癌試驗的方法；免疫功能的研究方法 分化誘導(dǎo)劑： 細(xì)胞形態(tài)學(xué)及組織化學(xué)研究方法；細(xì)胞功能的研 究方法；與分化有關(guān)的基因

2、及其表達(dá)的研究方法化學(xué)預(yù)防藥：體外誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法；體內(nèi)誘癌試驗； 化學(xué)預(yù)防劑作用機理的研究逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性藥物：腫瘤細(xì)胞耐藥表型和機制； 腫瘤耐藥細(xì)胞株的建立及鑒定； 尋找腫瘤耐藥性逆轉(zhuǎn)劑的方法抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的藥物：腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移與實驗方法概述； 腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的實驗動物模型； 腫瘤侵襲的體外模型及相關(guān)生物學(xué)特性研究 新血管生成的研究方法 放療及化療增敏劑：放療增敏劑的正名、定義及其研究特點； 離體細(xì)胞培養(yǎng)實驗技術(shù)；整體動物實驗技術(shù) 各類抗腫瘤藥物所涉及到的藥理學(xué)實驗方法 第四頁，共78頁幻燈片細(xì)胞毒類藥物： 體外實驗方法； 動物腫瘤體內(nèi)篩選法； 抗癌藥作用機理研究方法 生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑：體

3、內(nèi)抗癌試驗的方法；免疫功能的研究方法免疫功能的研究方法。分化誘導(dǎo)劑： 細(xì)胞形態(tài)學(xué)及組織化學(xué)研究方法；細(xì)胞功能的研 究方法；與分化有關(guān)的基因及其表達(dá)的研究方法化學(xué)預(yù)防藥：體外誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法；體內(nèi)誘癌試驗； 化學(xué)預(yù)防劑作用機理的研究(附：胃癌變動物模型 )逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性藥物：腫瘤細(xì)胞耐藥表型和機制； 腫瘤耐藥細(xì)胞株的建立及鑒定； 尋找腫瘤耐藥性逆轉(zhuǎn)劑的方法抗腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的藥物：腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移與實驗方法概述 腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的實驗動物模型 腫瘤侵襲的體外模型及相關(guān)生物學(xué)特性研究 心血管生成的研究方法 附：LALA795795自發(fā)肺癌實驗轉(zhuǎn)移模型放療及化療增敏劑：放療增敏劑的正名、定義及其研究特點

4、 離體細(xì)胞培養(yǎng)實驗技術(shù)；整體動物實驗技術(shù) 各類抗腫瘤藥物所涉及到的藥理學(xué)實驗方法 第五頁，共78頁幻燈片腫瘤細(xì)胞體外實驗方法腫瘤細(xì)胞體外實驗方法 （動物的，人的動物的，人的）動物腫瘤體內(nèi)實驗方法動物腫瘤體內(nèi)實驗方法 移植性、誘發(fā)性移植性、誘發(fā)性（也可在體外誘發(fā)也可在體外誘發(fā)）、自發(fā)性、自發(fā)性 腫瘤轉(zhuǎn)移的動物實驗?zāi)Ｐ湍[瘤轉(zhuǎn)移的動物實驗?zāi)Ｐ?腫瘤免疫藥理研究方法腫瘤免疫藥理研究方法 （體外、體內(nèi)體外、體內(nèi)）腫瘤藥理學(xué)基本的實驗方法腫瘤藥理學(xué)基本的實驗方法第六頁，共78頁幻燈片一、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件基本條件二、腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)與傳代三、腫瘤細(xì)胞的活性檢測活性檢測 形態(tài)觀察 細(xì)胞排染試驗

5、細(xì)胞生長曲線 抗癌作用測定 克隆形成試驗 半數(shù)抑制濃度的計算腫瘤細(xì)胞體外實驗方法腫瘤細(xì)胞體外實驗方法(In Vitro) 第七頁，共78頁幻燈片 無菌室 超凈工作臺 消毒器 CO2孵箱 倒置顯微鏡 酶標(biāo)儀 培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶 營養(yǎng)液，等等腫瘤細(xì)胞體外實驗所需要的腫瘤細(xì)胞體外實驗所需要的基基 本本 條條 件件 第八頁，共78頁幻燈片原代原代細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 與與傳代傳代細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)貼壁貼壁細(xì)胞傳代與細(xì)胞傳代與懸浮懸浮細(xì)胞傳代細(xì)胞傳代腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代第九頁，共78頁幻燈片腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 原原 代代 細(xì)細(xì) 胞胞 培培 養(yǎng)養(yǎng) 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)（Primary CulturePri

6、mary Culture）也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織、接種細(xì)胞培養(yǎng)到第一次傳代之前(一般可持續(xù)1-41-4周)。 此期細(xì)胞可見到細(xì)胞分裂，但不旺盛。 原代培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞克隆形成率（Cloning Cloning EfficiencyEfficiency）很低。 克隆形成率克隆形成率即細(xì)胞群被稀釋分散成單個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時，形成細(xì)胞小群（克?。┑陌俜?jǐn)?shù)。 初代培養(yǎng)細(xì)胞也可用于檢測藥物的生物活性。第十頁，共78頁幻燈片 傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)（Passage culture ）：將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比例轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。 為什么要進(jìn)行傳代？ 體外

7、培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞密度過大，生存空間不足，可引起營養(yǎng)枯竭從而停止生長。因此，要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞用于研究，并維持細(xì)胞種的延續(xù)。 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 傳傳 代代 細(xì)細(xì) 胞胞 培培 養(yǎng)養(yǎng)第十一頁，共78頁幻燈片 細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種在培養(yǎng)器皿到分離再培養(yǎng)的一段期間。 細(xì)胞倍增時間：指此次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所需的時間。 “一代”與“倍增”的概念不同。在一代中，細(xì)胞可培增2-3次甚至5-6次。 腫瘤腫瘤 細(xì)細(xì) 胞胞 培培 養(yǎng)養(yǎng) 傳代代數(shù)與細(xì)胞倍增時間傳代代數(shù)與細(xì)胞倍增時間第十二頁，共78頁幻燈片 細(xì)胞傳代后，一般經(jīng)過游離期、指數(shù)增生期指數(shù)增生期

8、、坪臺期三個階段 游離期：細(xì)胞接種后從懸浮狀態(tài)到細(xì)胞貼瓶； 指數(shù)增生期指數(shù)增生期：細(xì)胞接種23天分裂增殖比較旺盛，是活力最好時期，稱指數(shù)增生期(對數(shù)生長期)，適宜進(jìn)行各種試驗；坪臺期（停止期）：細(xì)胞密度已飽和，細(xì)胞停止增殖，但代謝活動仍在進(jìn)行 。腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng) 指數(shù)增生期第十三頁，共78頁幻燈片 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)可分為單層貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)。 懸浮懸浮培養(yǎng)是指細(xì)胞懸浮懸浮于培養(yǎng)基中進(jìn)行生長或維持。 單層貼壁培養(yǎng)是指細(xì)胞貼附在培養(yǎng)器皿表面生長的方法。將細(xì)胞消化后分散成單個細(xì)胞后種入器 皿，細(xì)胞置含37、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，一般經(jīng)過3-6 h，細(xì)胞沉于器皿底部，附著于玻璃或塑料層

9、的培養(yǎng)面，分裂，向四周生長，逐漸融合形成細(xì)胞單層。 正常二倍體細(xì)胞在兩個細(xì)胞集落生長到相互接觸時，由于細(xì)胞信息的傳遞，生長即停止，即生長接觸抑制。 惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞由于具有失去接觸抑制的特性，在生長到細(xì)胞相互接觸時，還能繼續(xù)生長，形成重疊層。細(xì)胞生長到旺盛期，即可進(jìn)行傳代。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)第十四頁，共78頁幻燈片腫瘤細(xì)胞傳代 懸浮細(xì)胞的傳代 懸浮細(xì)胞是指細(xì)胞呈單個或細(xì)胞團懸浮在培養(yǎng)液中生長，當(dāng)細(xì)胞生長到一定密度時，進(jìn)入坪臺期，即需傳代。 傳代方法：取少量細(xì)胞懸液移入新培養(yǎng)器皿，加入新鮮培養(yǎng)液即可。 第十五頁，共78頁幻燈片1.打開瓶口，過火后，輕輕倒

10、去培養(yǎng)液。2.用PBS或用Hanks液2ml洗12次，加入0.05%0.25%胰蛋白酶適量，消化13min。3.在顯微鏡下觀察細(xì)胞呈圓球狀時（或肉眼觀察培養(yǎng)瓶細(xì)胞面出現(xiàn)布紋孔狀），表示細(xì)胞已從壁上消化下來，倒去胰蛋白酶，可用Hanks液輕輕洗12次。4.加入新鮮培養(yǎng)液后，用滴管輕輕吹打，使細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶表面脫落，混合成細(xì)胞懸液，以適量接種入新培養(yǎng)器皿中。腫瘤細(xì)胞傳代 貼壁細(xì)胞的傳代貼壁細(xì)胞的傳代 第十六頁，共78頁幻燈片1.培養(yǎng)液中可加入適量青霉素、鏈霉素；2.用于調(diào)pH值的7%NaHCO3用0.1-0.22m 濾膜過濾滅菌，勿高壓滅菌。 3.洗去胰蛋白酶時應(yīng)該用D-Hanks液，而 不

11、是Hanks液。4.傳代時細(xì)胞分散密度要適當(dāng)，不能太 低，因腫瘤細(xì)胞的自泌促生長因子會 因分散培養(yǎng)而被稀釋，達(dá)不到腫瘤生 長的需求，降低腫瘤細(xì)胞的生長增殖力。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與傳代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與傳代注意事項注意事項第十七頁，共78頁幻燈片分離純化外科腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞的方法1.1.取材取材：材料主要來源于外科手術(shù)或活檢腫瘤組織。取材時避免用壞死組織，要挑選瘤細(xì)胞集中和活力較好的部位，瘤性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是較好的培養(yǎng)培養(yǎng)材料。取材后盡快培養(yǎng)培養(yǎng)，因故不能立即培養(yǎng)培養(yǎng)者，可凍存。 2.2.成纖維細(xì)胞排除成纖維細(xì)胞排除：在腫瘤組織中?；祀s有一些成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)培養(yǎng)時能與瘤細(xì)胞同時生長，并常壓過癌細(xì)胞，

12、導(dǎo)致癌細(xì)胞生長受阻，應(yīng)仔細(xì)排除。排除方法常有：機械刮除法、反復(fù)貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。 第十八頁，共78頁幻燈片成纖維細(xì)胞排除 機械刮除法機械刮除法是用不銹鋼鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用。刮除程序為： （1）標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細(xì)胞的部位； （2）刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標(biāo)記空間； （3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞； （4）注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止 第十九頁，共78頁幻燈片 根

13、據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細(xì)胞相互分離，操作方法與傳代相同。 （1）待細(xì)胞生長達(dá)一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液； （2）取編號為此A、B、C三個培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)520分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入B培養(yǎng)瓶中后；向A瓶中補充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)； （3）培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞520分鐘后，按處理A的方法，把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中；再向B瓶中補加完全培養(yǎng)基。 當(dāng)三個瓶內(nèi)都含有

14、培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見A瓶主要為成纖維細(xì)胞，B瓶兩類細(xì)胞相雜，C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時可反復(fù)處理多次，直至癌細(xì)胞純化為止。 成纖維細(xì)胞排除 反復(fù)貼壁法第二十頁，共78頁幻燈片消化排除法： 根據(jù)成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落的特點。此法曾用于乳癌細(xì)胞的培養(yǎng)，具體程序是： （1）先用0.5%胰蛋白酶和0.02EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下觀察和不時搖動培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來后，便立即停止消化； （2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶內(nèi)也補加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)

15、過幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細(xì)胞除凈。 第二十一頁，共78頁幻燈片膠原酶消化法： 利用成纖維細(xì)胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進(jìn)行選擇。 （1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化； （2）用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞。 如成纖維細(xì)胞未被除凈，可再次重復(fù)。 第二十二頁，共78頁幻燈片其它方法： 有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細(xì)胞生長的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重1.0251.085的密度梯度離心液，加入細(xì)胞懸液后，在23中800g離心 10分種。在比重1.0251.050層為成纖維細(xì)胞

16、，在比重1.0501.085層為上皮細(xì)胞，再經(jīng)過分離進(jìn)行培養(yǎng)。最近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如SOD抑制成纖維細(xì)胞生長的方法。 選用上述任何一種方法，都需進(jìn)行試驗，取得必要經(jīng)驗，找出適合的條件，才能獲得好的效果。 第二十三頁，共78頁幻燈片腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)與傳代腫瘤細(xì)胞的活性檢測活性檢測 形態(tài)觀察 細(xì)胞排染試驗 細(xì)胞生長曲線 MTT試驗 克隆形成試驗 半數(shù)抑制濃度的計算腫瘤細(xì)胞體外實驗?zāi)[瘤細(xì)胞體外實驗第二十四頁，共78頁幻燈片腫瘤細(xì)胞的活性檢測 形態(tài)觀察 細(xì)胞排染試驗 細(xì)胞生長曲線 MTT試驗 克隆形成試驗 半數(shù)抑制濃度的計算第二十五頁，共78頁幻

17、燈片腫瘤細(xì)胞的活性檢測 形態(tài)觀察n 主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。 第二十六頁，共78頁幻燈片實驗原理 細(xì)胞損傷或死亡后細(xì)胞膜完整性破壞。正常的活細(xì)胞拒染，而死亡的細(xì)胞則染成藍(lán)色。實驗方法 取100l細(xì)胞懸液加等量0.4臺盼藍(lán)染色液，攪動細(xì)胞使之與染料混合均勻，滴入血球計數(shù)板，穩(wěn)定2min后進(jìn)行觀察，在l5min內(nèi)用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)200個細(xì)胞。未染色的是活細(xì)胞，死細(xì)胞呈藍(lán)色。分別計數(shù)染色細(xì)胞與不染色細(xì)胞，求得細(xì)胞存活率。腫瘤細(xì)胞的活性檢測 細(xì)胞排染試驗 第二十七頁，共78頁幻燈片 細(xì)胞排染試驗 細(xì)胞數(shù)胞數(shù)未細(xì)胞數(shù)染色染

18、色數(shù)未染色細(xì)胞存活率100% 未經(jīng)任何處理的培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞存活率應(yīng)達(dá)95%以上。 第二十八頁，共78頁幻燈片細(xì)胞生長抑制率 觀察藥物的作用，可對實驗組與對照組分別計數(shù)活細(xì)胞數(shù) (即末染色細(xì)胞數(shù))，再根據(jù)下列公式求得細(xì)胞生長抑制率。對照組活細(xì)胞數(shù)組活細(xì)胞數(shù)對照組活細(xì)胞數(shù)實驗100% 第二十九頁，共78頁幻燈片 細(xì)胞懸液與臺盼藍(lán)染色液混勻后，應(yīng)在5min內(nèi)計數(shù)完畢，時間過長，由于細(xì)胞活度下降而通透性增加，從而影響拒染細(xì)胞數(shù)，因而影響實驗的真實結(jié)果。 細(xì)胞排染試驗注意事項第三十頁，共78頁幻燈片 在最適條件下，腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)液中隨著培養(yǎng)時間延長呈指數(shù)生長，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo)作圖

19、，可得一條直線，故稱此時為對數(shù)生長期。隨著細(xì)胞密度不斷增高，由于代謝產(chǎn)物的積聚及營養(yǎng)物的消耗，細(xì)胞生長逐漸減慢以致停止，此時稱高坪期或穩(wěn)定期。藥物對細(xì)胞生長的影響可通過生長曲線反映出來。實驗原理腫瘤細(xì)胞的活性檢測 腫瘤細(xì)胞生長曲線第三十一頁，共78頁幻燈片 選取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配成細(xì)胞濃度為1104/ml的細(xì)胞懸液分裝在培養(yǎng)瓶中，實驗組加入不同濃度的被測樣品，對照組加入等體積的溶劑。細(xì)胞置含37、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)后ld、2d、3d、4d、5d、7d各取樣，置血細(xì)胞計數(shù)板中計數(shù)，以每毫升細(xì)胞數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線

20、（計數(shù)法） 。 注意：懸浮細(xì)胞同一培養(yǎng)物可連續(xù)取樣，而貼壁細(xì)胞每個培養(yǎng)瓶只能作一次計數(shù)，故要計算好需要的細(xì)胞瓶數(shù)。 實驗方法 腫瘤細(xì)胞的活性檢測 腫瘤細(xì)胞生長曲線第三十二頁，共78頁幻燈片藥物對細(xì)胞的殺傷率 100% 000NNN也可用MTT法測定細(xì)胞生長曲線N0:對照組生長曲線線性部分外推至y軸的截距，代表接種后對照組具有增殖力的細(xì)胞數(shù)；N0:實驗組生長曲線線性部分外推至y軸的截距，代表接種后實驗組具有增殖力的細(xì)胞數(shù)。第三十三頁，共78頁幻燈片 MTT比色法： 活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT（噻唑藍(lán),Thiazolyl blue）還原為藍(lán)紫色結(jié)晶，并沉淀在細(xì)胞里，而死細(xì)胞中琥

21、珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原 。DMSO能夠溶解細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜 (formazan)，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定其吸光度值(OD值)，OD值的大小可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物的形成量與活細(xì)胞數(shù)成正比。由吸光度值，根據(jù)相關(guān)公式計算抑制率。 MTT實驗實 驗 原 理第三十四頁，共78頁幻燈片 實 驗 方 法1.將對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞用胰蛋白酶消 化后，用含10小牛血清的培養(yǎng)基配成 濃度約為5000個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。2.接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種200l。3.經(jīng)37、5%CO2的溫箱中培養(yǎng)24h。4.實驗組加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)液， 對照組則

22、用等體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)3 個以上的平行孔，37、5%CO2，培養(yǎng)所 設(shè)定的時間。 MTT實驗第三十五頁，共78頁幻燈片 實驗方法 5.棄去上清液，用培養(yǎng)液洗3次，以去除藥液。 然后，每孔加入200l含0.2mg/ml MTT的無 血清培養(yǎng)基，在37培養(yǎng)4h。 6.小心棄去上清，并加入200l 酸化異丙醇 （或DMSO）溶解MTT甲臜沉淀，用振蕩器混勻 后，在酶標(biāo)儀上用波長為570 nm，參比波為 450 nm測定光密度 (OD)值。 MTT實驗第三十六頁，共78頁幻燈片n按公式計算按公式計算IC50舉例：舉例：n各組藥物濃度：0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.0

23、00001（稀釋倍數(shù)為10，最大濃度為0.1）n抑制率分別為：0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。n將上述數(shù)據(jù)代入下列計算公式：nlgIClgIC5050=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)nXm:最大劑量的對數(shù)=lg0.1= =-1 1 nI:（最大劑量/相鄰劑量)的對數(shù)=lg0.1/0.01=lg10=1 nP:陽性反應(yīng)率之和=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1nPm:最大陽性反應(yīng)率=0.95， nPn:最小陽性反應(yīng)率=0.06nlgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)

24、/4)=-3.6025nICIC5050=0.00025=0.00025 第三十七頁，共78頁幻燈片 腫瘤細(xì)胞體外實驗是進(jìn)行抗癌藥物篩選檢測、研究癌變機理以及惡性腫瘤分子生物學(xué)研究的重要手段。主要優(yōu)點 如下： 1.1.不需要用動物，能很方便、很經(jīng)濟的進(jìn)行很多種藥物的篩選； 2.2.可比較準(zhǔn)確的控制藥物作用的時間、劑量和條件，并可準(zhǔn)確的選擇藥物作用的靶位； 3.3.將藥物直接加入到腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)體系中，使藥物直接與細(xì)胞接觸，可提示藥物的直接作用或體內(nèi)的間接作用。腫瘤細(xì)胞體外實驗方法腫瘤細(xì)胞體外實驗方法主要優(yōu)點主要優(yōu)點 第三十八頁，共78頁幻燈片 1.1.與體外實驗相比，體內(nèi)的生長環(huán)境極為復(fù)雜，因此

25、體外的藥效作用在體內(nèi)并不一定都能相對應(yīng)； 2.2.對復(fù)方藥和中藥研究較為困難，尤其是藥物的顏色，可因為影響比色結(jié)果而影響對藥物的評價； 3.3.水溶性的藥物較易研究，而非水溶性的藥物則較難。（可進(jìn)行血清藥理學(xué)研究） 因此，要將體外的實驗結(jié)果與體內(nèi)的結(jié)合起來 才能較為全面而科學(xué)地評價藥效。腫瘤細(xì)胞體外實驗方法腫瘤細(xì)胞體外實驗方法主要缺點主要缺點第三十九頁，共78頁幻燈片 初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系（Cell LineCell Line）。 從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株（Cell strainCell

26、 strain）。 與的概念第四十頁，共78頁幻燈片腫瘤細(xì)胞體外實驗方法腫瘤細(xì)胞體外實驗方法 （動物的，人的動物的，人的）動物腫瘤體內(nèi)實驗方法動物腫瘤體內(nèi)實驗方法 （移植性、誘發(fā)性、自發(fā)性移植性、誘發(fā)性、自發(fā)性） 腫瘤轉(zhuǎn)移的動物實驗?zāi)Ｐ湍[瘤轉(zhuǎn)移的動物實驗?zāi)Ｐ?腫瘤免疫藥理研究方法腫瘤免疫藥理研究方法腫瘤藥理學(xué)基本的實驗方法腫瘤藥理學(xué)基本的實驗方法第四十一頁，共78頁幻燈片體內(nèi)實驗體內(nèi)實驗 In vivo 腫瘤藥理學(xué)實驗方法腫瘤藥理學(xué)實驗方法(In Vitro) 第四十二頁，共78頁幻燈片腫瘤藥理學(xué)體內(nèi)實驗方法腫瘤藥理學(xué)體內(nèi)實驗方法 整體動物實驗法是評價一個藥物是否有效的最主要的方法，即使在體外

27、有一個很好的療 效，最終也一定要在體內(nèi)進(jìn)行觀察。因此，用整體動物實驗方法來觀察藥物的作用顯得很重要。 研究藥物的體內(nèi)抗腫瘤作用，就必須建立各種腫瘤的動物模型，模型越接近于人體其意義越大。第四十三頁，共78頁幻燈片 動物腫瘤體內(nèi)實驗方法動物腫瘤體內(nèi)實驗方法實實 驗驗 動動 物物 的的 選選 擇擇移植性移植性動物腫瘤模型動物腫瘤模型誘發(fā)性誘發(fā)性動物腫瘤模型動物腫瘤模型自發(fā)性自發(fā)性動物腫瘤模型動物腫瘤模型第四十四頁，共78頁幻燈片 不同種類的動物對致癌物質(zhì)的敏感性不同，其癌自發(fā)率也不同。常用于自發(fā)、誘發(fā)或移植的動物有： 小鼠、裸 鼠、金黃地鼠、大鼠 豚鼠、兩棲類動物如蛙、鳥類。 其它許多家畜如豬馬牛

28、羊犬貓家兔等都可發(fā)生各種腫瘤。動物腫瘤體內(nèi)實驗方法動物腫瘤體內(nèi)實驗方法動動 物物 的的 選選 擇擇第四十五頁，共78頁幻燈片小 鼠 小鼠腫瘤自發(fā)率高，其自發(fā)性腫瘤無論是從組織發(fā)生、臨床過程以及組織形態(tài)學(xué)上都與人類的腫瘤接近。所以小鼠目前廣泛用于癌、肉瘤、白血病以及其它惡性腫瘤的研究。進(jìn)行抗腫瘤藥物篩選，小鼠自發(fā)性腫瘤自發(fā)性腫瘤模型模型優(yōu)于移植性腫瘤模型模型。動物腫瘤體內(nèi)實驗方法動物腫瘤體內(nèi)實驗方法動物的選擇動物的選擇第四十六頁，共78頁幻燈片裸 鼠 裸鼠是一種獨特的純系動物，全身無毛，先天性無胸腺，T淋巴細(xì)胞缺乏，細(xì)胞免疫功能缺乏，對異體移植幾乎無免疫排斥反應(yīng)，可接受異系、異種腫瘤腫瘤移植等，

29、有“活試管 ”之稱。 自 從 1969 年Rygaard 、Povlesev 二氏將人類腫瘤異種移植于裸鼠首次獲得成功后，它在腫瘤研究中已被廣泛利用。 目前移植于裸鼠較為成功的人類腫瘤有：結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、白血病等。動物腫瘤體內(nèi)實驗方法動物腫瘤體內(nèi)實驗方法動物的選擇動物的選擇第四十七頁，共78頁幻燈片 裸小鼠的費用昂貴，飼養(yǎng)時對實驗室的條件要求高，小鼠不易大量繁殖。因而一般不用于藥物的初篩選研究。由于先天性免疫缺乏，因而在一般情況下也不用于免疫藥物的研究。 裸鼠的缺點裸鼠的缺點動物的選擇動物的選擇第四十八頁，共78頁幻燈片C57BL/6小鼠 小鼠類的一種，黑毛，體型小，性情

30、較溫順，易于飼養(yǎng)管理，對藥物敏感性好，為研究Lewis肺癌所選小鼠。費用適中，飼養(yǎng)條件不太高，易大量繁殖，因而一般可用于藥物的體內(nèi)初篩選研究。（LewisLewis肺癌為C57BL/6小鼠來源的腫瘤） 動物的選擇動物的選擇第四十九頁，共78頁幻燈片大鼠 大鼠也廣泛用于腫瘤研究。與小鼠相比，大鼠的體型較大，供給的組織較多，便于進(jìn)行手術(shù)等實驗操作。大鼠的肝臟對致癌物質(zhì)很敏感，可用二乙基亞硝胺，二甲基偶氮苯（DAB）復(fù)制大鼠肝癌動物模型，還可用甲基芐基亞硝胺誘發(fā)大鼠食管癌動物模型。 大鼠的自發(fā)性癌變的發(fā)生率較低。動物的選擇動物的選擇第五十頁，共78頁幻燈片金黃地鼠：金黃地鼠：金黃地鼠是腫瘤學(xué)實驗研究

31、中最常用的動物，她廣泛用于研究腫瘤的增殖、致癌、抗癌、腫瘤轉(zhuǎn)移、康癌藥物的篩選等。豚鼠：豚鼠：曾被認(rèn)為是很少發(fā)生腫瘤的動物，近年發(fā)現(xiàn)豚鼠也可發(fā)生自發(fā)性腫瘤，例如支氣管乳頭腺瘤、白血病等。兩棲類動物：兩棲類動物：蛙類無毛，光滑的皮膚與人類接近，可為皮膚癌的研究提供實驗?zāi)Ｐ?。鳥類：鳥類：雞和其它鳥類對腫瘤病毒的研究具有極高的實用價值尤其是對于造血系統(tǒng)和間葉組織腫瘤病毒株具有易感性。魚類：魚類：魚類也可發(fā)生不少自發(fā)腫瘤，它們對化學(xué)致癌物十分敏感，例如用黃曲霉素、二乙基亞硝胺等可誘發(fā)魚類肝臟腫瘤和腎母細(xì)胞瘤。其它：其它：許多家畜如馬牛羊豬犬貓家兔馬牛羊豬犬貓家兔等都可發(fā)生各種腫瘤。動物腫瘤體內(nèi)實驗方法

32、動物腫瘤體內(nèi)實驗方法動物的選擇動物的選擇第五十一頁，共78頁幻燈片 動物腫瘤體內(nèi)實驗方法動物腫瘤體內(nèi)實驗方法實實 驗驗 動動 物物 的的 選選 擇擇移植性動物腫瘤模型移植性動物腫瘤模型自發(fā)性動物腫瘤模型自發(fā)性動物腫瘤模型誘發(fā)性動物腫瘤模型誘發(fā)性動物腫瘤模型第五十二頁，共78頁幻燈片動物腫瘤體內(nèi)實驗方法動物腫瘤體內(nèi)實驗方法移植性動物腫瘤模型移植性動物腫瘤模型人體腫瘤動物體內(nèi)移植模型的建立人體腫瘤動物體內(nèi)移植模型的建立實體瘤動物體內(nèi)移植模型的建立實體瘤動物體內(nèi)移植模型的建立 非實體瘤動物體內(nèi)移植模型的建立非實體瘤動物體內(nèi)移植模型的建立 第五十三頁，共78頁幻燈片移移 植植 性性 動動 物物 腫腫

33、瘤瘤 模模 型型人體腫瘤動物體內(nèi)移植模型的建立人體腫瘤動物體內(nèi)移植模型的建立 用人的腫瘤細(xì)胞通過移植的方法移植到適合的動物宿主體內(nèi)，建立一個移植宿主的體內(nèi)模型，通過該模型對實驗藥物進(jìn)行藥理藥效學(xué)觀察。 人體腫瘤動物體內(nèi)移植可觀察癌細(xì)胞對藥物的敏感性試驗，藥物對癌細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用，藥物對癌細(xì)胞的增殖抑制作用和誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡等作用。第五十四頁，共78頁幻燈片移移 植植 性性 動動 物物 腫腫 瘤瘤 模模 型型人體腫瘤動物體內(nèi)移植模型的建立人體腫瘤動物體內(nèi)移植模型的建立 動物要求腫瘤細(xì)胞來源腫瘤細(xì)胞凍存與復(fù)蘇腫瘤腫瘤細(xì)胞體內(nèi)接種第五十五頁，共78頁幻燈片人體腫瘤動物體內(nèi)移植模型的建立人體腫瘤動物體內(nèi)

34、移植模型的建立 由于人和動物不同種，存在移植排斥反應(yīng)，故要用免疫缺陷動物免疫缺陷動物，如裸鼠。 裸小鼠裸小鼠是一種獨特的純系動物，全身無毛，先天性T細(xì)胞缺乏，對異種腫瘤移植幾乎無免疫排斥反應(yīng)，可接受人類腫瘤移植。 裸大鼠裸大鼠無胸腺，缺少T細(xì)胞，故能成功地移植異種皮膚和異種腫瘤，包括小鼠腫瘤及人腫瘤。 動物要求第五十六頁，共78頁幻燈片小白鼠小白鼠裸鼠裸鼠第五十七頁，共78頁幻燈片人體腫瘤動物體內(nèi)移植模型的建立人體腫瘤動物體內(nèi)移植模型的建立 人體腫瘤細(xì)胞的來源大致可分為兩類，一類是人的癌細(xì)胞株，可從細(xì)胞庫或其他實驗室得到；另一類是源于人體腫瘤組織塊的癌細(xì)胞，主要從臨床腫瘤患者體內(nèi)獲得。為了使腫

35、瘤細(xì)胞能得到長期使用和保持不同代的腫瘤組織的本來特性，防止退化或變異，對腫瘤細(xì)胞的冷凍保存是很必要的。一般情況下，液氮凍存1-2年后，細(xì)胞存活率可達(dá)80%-90。 涉及細(xì)胞凍存與復(fù)蘇技術(shù) 。腫瘤細(xì)胞的來源第五十八頁，共78頁幻燈片1.消化洗滌 將對數(shù)增殖期的細(xì)胞或腹水瘤細(xì)胞經(jīng)消化脫壁后，用培養(yǎng)液洗滌l次。2.凍存細(xì)胞 配制含有保護劑 (10%15的DMSO，甘油等)的培養(yǎng)液作為細(xì)胞凍存液。以腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞凍存液中的密度為ll07/ml左右懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞懸液加入到2ml塑料凍存管內(nèi)。密封后注明標(biāo)記。將凍存管放入4或30低溫冰箱內(nèi)2h后，移入液氮罐內(nèi)長期保存。3.凍存細(xì)胞的復(fù)蘇 將凍存腫瘤細(xì)胞的

36、凍存管從液氮罐內(nèi)取出，立即置于37-40 溫水中，使凍存細(xì)胞在l min內(nèi)全部融化，1000r/min離心l0min，棄去上清液，用新鮮培養(yǎng)液稀釋到所需細(xì)胞數(shù)，再進(jìn)行培養(yǎng)。慢凍快融原則 人體腫瘤動物體內(nèi)移植模型的建立人體腫瘤動物體內(nèi)移植模型的建立凍存與復(fù)蘇方法第五十九頁，共78頁幻燈片1.1.體外培養(yǎng)擴增體外培養(yǎng)擴增 無菌條件下，將復(fù)蘇的腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)、擴增。2.2.制備細(xì)胞懸液制備細(xì)胞懸液 在對數(shù)生長期，用 0.05胰蛋白酶和0.02乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）消化12 min，傾出消化液，加入無血清1640液洗滌，離心，計

37、數(shù)，用無血清1640液或無菌生理鹽水配成濃度為1107/ ml的細(xì)胞懸液。3.3.接種腫瘤細(xì)胞接種腫瘤細(xì)胞 在無菌環(huán)境中，消毒皮膚，用lml注射器抽吸取0.2ml細(xì)胞懸液（約含2106個腫瘤細(xì)胞），接種接種在裸鼠裸鼠右前肢根部（腋窩）皮下。約1周左右局部就長出花生米粒大小瘤塊 。4.4.飼養(yǎng)、觀察飼養(yǎng)、觀察 在無菌環(huán)境中飼養(yǎng)、觀察，觀察瘤塊生長情況，定期測量瘤體的直徑，最后剝瘤稱重，計算抑制率。 接種步驟人體腫瘤動物體內(nèi)移植模型的建立第六十頁，共78頁幻燈片動物腫瘤體內(nèi)實驗方法動物腫瘤體內(nèi)實驗方法移植性動物腫瘤模型移植性動物腫瘤模型人體腫瘤動物體內(nèi)移植模型的建立人體腫瘤動物體內(nèi)移植模型的建立實

38、體瘤動物體內(nèi)移植模型的建立實體瘤動物體內(nèi)移植模型的建立 非實體瘤動物體內(nèi)移植模型的建立非實體瘤動物體內(nèi)移植模型的建立 第六十一頁，共78頁幻燈片移植性動物腫瘤模型實體瘤動物體內(nèi)移植模型的建立小塊瘤體接種法腫瘤細(xì)胞懸液接種法培養(yǎng)細(xì)胞動物體內(nèi)移植法瘤體測量方法 接種方法主要特點 第六十二頁，共78頁幻燈片實體瘤動物體內(nèi)移植模型的主要特點1.一群動物同時接種等量同種癌細(xì)胞，腫瘤生 長速度比較一致，個體差異較??；2.接種的成活率高，接近100%；3.對宿主的影響較相似，易于客觀判斷療效；4.可在同種或同品系動物中連續(xù)移植，長期保 留，供試驗用；5.試驗周期一般較短，試驗條件易于控制。 實體瘤動物模型主

39、要用來篩選抗腫瘤藥物。第六十三頁，共78頁幻燈片移植性動物腫瘤模型實體瘤動物體內(nèi)移植模型的建立小塊瘤體接種法腫瘤細(xì)胞懸液接種法培養(yǎng)細(xì)胞動物體內(nèi)移植法瘤體測量方法 接種方法主要特點 第六十四頁，共78頁幻燈片小塊瘤體接種法 從動物剝離取出腫瘤后，剔除非腫瘤組織和壞死組織，選取生長良好而無變性壞死、呈淡紅色 (黑色素瘤則呈黑色或黑紫色)、魚肉狀的瘤組織，切成2mm2mm2mm的小塊，在所選宿主動物的腋下剪開一個小口，用無鉤眼科鑷子夾取小塊，送入切口內(nèi)皮。 如何保證切成的小塊是2mm2mm2mm？ 為什么接種在腋下，因為腋下部皮膚松弛，能使腫瘤生長得較大，可延長宿主動物的壽命。實體瘤動物體內(nèi)移植模型

40、的接種方法第六十五頁，共78頁幻燈片腫瘤細(xì)胞懸液接種法 將選取的腫瘤組織放入玻璃勻漿器中，用無菌生理鹽水研磨后，經(jīng)濾網(wǎng)過濾成單個的細(xì)胞懸液，用臺盼藍(lán)染色法計數(shù)活細(xì)胞數(shù)，每個接種點皮下注射0.2ml(含1l06-1l07個細(xì)胞)，每只動物可選用一個或多個接種點，通常接種于腋下部皮下。 在無菌條件下操作。實體瘤動物體內(nèi)移植模型的接種方法第六十六頁，共78頁幻燈片1.1.研磨方向及轉(zhuǎn)速 制備腫瘤細(xì)胞懸液時，在人工研磨時必須使研磨桿向同一方向轉(zhuǎn)動，不可反向交替研磨，防止磨破腫瘤細(xì)胞；如果采用電動研磨，一定要控制好轉(zhuǎn)速，以免破壞完整的腫瘤細(xì)胞。2.2.細(xì)胞數(shù) 細(xì)胞數(shù)多少適中，如果瘤細(xì)胞數(shù)過多，接種后瘤體

41、生長過快，不便于藥物作用的觀察；瘤細(xì)胞數(shù)過少，會導(dǎo)致接種失敗，接種部位不能形成腫瘤。接種失敗后再在原動物體內(nèi)重新接種也難成功，必須重新更換動物。（為什么？）腫瘤細(xì)胞懸液接種注意事項 第六十七頁，共78頁幻燈片 將培養(yǎng)至快要融合的單層細(xì)胞(對數(shù)生長期)用0.25%的胰蛋白酶消化脫壁以后，經(jīng)用PBS或生理鹽水以1000r/min經(jīng)l0min離心洗滌2次后，洗掉細(xì)胞中胰蛋白酶和培養(yǎng)液中血清等成分，用臺盼籃染色法計數(shù)活細(xì)胞數(shù)，用生理鹽水將腫瘤細(xì)胞稀釋成1l06-1l07/ml，每個接種點皮下注射0.2ml細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞動物體內(nèi)移植法實體瘤動物體內(nèi)移植模型的接種方法第六十八頁，共78頁幻燈片移植性動物腫

42、瘤模型實體瘤動物體內(nèi)移植模型的建立小塊瘤體接種法腫瘤細(xì)胞懸液接種法培養(yǎng)細(xì)胞動物體內(nèi)移植法瘤體測量方法 接種方法主要特點 第六十九頁，共78頁幻燈片實體瘤動物體內(nèi)移植模型實體瘤瘤體測量方法 測量實體瘤生長的方法有多種，主要包括測定腫瘤的質(zhì)量、體積或直徑等。第七十頁，共78頁幻燈片瘤體測量方法 通常于停藥之后次日處死動物，立即剝離取出瘤塊，剔除其他組織后稱重。若對照組小鼠腫瘤平均小于1g或20%小鼠的瘤重小于400mg，表示腫瘤生長不良。在治療期間給藥組小鼠死亡率大于20%或平均體重下降 (自身對照)超過15%者，表示藥物毒性反應(yīng)，應(yīng)適當(dāng)減量重復(fù)試驗。 比較試驗組與對照組瘤重的差異，按下列公式計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率 對照組瘤重重對照組瘤重給藥組瘤100%100% 稱量腫瘤的質(zhì)量 當(dāng)中藥組的瘤重抑制率大于30%，需重復(fù)試驗，連續(xù)數(shù)次療效穩(wěn)定，并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理有顯著性差異時，則評定此藥有一定療效。第七十一頁，共78頁幻燈片 瘤體的直徑與腫瘤的大小及質(zhì)量成正比。測量瘤體的直徑不需要處死動物，可用來動態(tài)觀察瘤體的變化。 方法：用游標(biāo)千分卡尺測量腫瘤的相互垂直的直徑，取它們的平均值即為平均直徑。MD3CBA100% MD為腫瘤平均直徑；A、B、C為實體腫瘤3個相互垂直的直徑，一般用毫