植物細胞和組織培養(yǎng)

1、 植物細胞和組織培養(yǎng) 植物細胞和組織培養(yǎng)（Plant Cell and Tissue Culture）是一種離體培養(yǎng)植物細胞或組織，并在細胞水平上進行遺傳操作的技術，可以應用于植物快速繁殖和品種改良。細胞組織培養(yǎng)技術不涉及重組DNA和有害外源基因的導入，不存在生物安全問題，所以它是一種安全的或者“綠色的”生物技術，一直受到人們的關注。 1665年 Hooke 發(fā)現(xiàn)細胞1838年Schleiden和Schwann : “一切植物，如果它們不是單細胞的話，都完全是由細胞集合而成的，細胞是植物構造的基本單位?！?900年孟德爾定律的重新發(fā)現(xiàn)使人們認識到, 染色體是遺傳因子的載體。細胞具有同樣數(shù)目的染

2、色體，每個細胞自然就攜帶了彼此相同的全部遺傳因子，因此也應當像受精卵一樣，具備分化和發(fā)育的潛能。1902年Haberlandt發(fā)表了著名論文植物細胞離體培養(yǎng)實驗,指出: 作為高等植物的器官和組織基本單位的細胞有可能在離體培養(yǎng)條件下實現(xiàn)分裂分化，乃至形成胚胎和植株。這種見解后來被稱為細胞全能性學說（cell totipotency） 植物細胞組織培養(yǎng)的早期研究1951年 Skoog 和 Tsui（崔澂）采用加有IAA和腺嘌呤的培養(yǎng)基, 使煙草莖段的髓組織的細胞分裂和生長，并且分化形成不定芽。這是人類第一次從離體培養(yǎng)的植物組織誘導出芽和植株。 1955年Miller 等從DNA的降解產(chǎn)物中分離出6

3、-呋喃氨基嘌呤，發(fā)現(xiàn)它不僅可以代替腺嘌呤誘導煙草莖段分化芽，而且誘導芽分化的效力比腺嘌呤高三萬倍，為誘導離體細胞的器官分化提供了有效的方法。1958年Steward導單個來自胡蘿卜根的懸浮細胞發(fā)育為成熟的胚胎，完全證明了Haberlandt提出的細胞全能性學說。至今已經(jīng)在一千多種植物上，從各種類型的組織和細胞，甚至原生質體，誘導出胚胎和完整植株，因此植物細胞的全能性的存在已是不爭的事實。 植物細胞組織培養(yǎng)研究主要領域植物細胞組織培養(yǎng)研究主要領域植物細胞工程的理論基礎：細胞全能性 胚培養(yǎng)和胚乳培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)脫毒快速繁殖、體細胞胚胎發(fā)生與人工種子體細胞無性系變異與育種原生質體培養(yǎng)和體細胞雜交單倍

4、體植物的誘導和應用植物細胞大量培養(yǎng)和次生代謝產(chǎn)物利用參考書：參考書： 朱至清，植物細胞工程，化學工業(yè)出版社，。 孫敬三、朱至清，植物細胞工程實驗技術，化學工業(yè)出版社，。植物細胞全能性及其表達（一）植物細胞全能性的提出與證明（二）胚性細胞 植物的干細胞（三）從分化細胞到胚性細胞在自然條件下，植物體內(nèi)的許多細胞可以不斷地產(chǎn)生不定胚或芽，表明它們保留著胚性。在自然界表現(xiàn)出胚性的細胞可以分為三大類，即早期胚胎細胞、莖端分生細胞和成熟組織中遺留的胚性細胞。最典型的例子是落地生根，其葉片周緣組織特定部位中遺留的胚性細胞能夠沿著葉片的四周形成不定芽，然后發(fā)育為具有根系的小植株，脫落到地面。 Kalancho

5、e laxiflola （二）胚性細胞 植物的干細胞 一、合子和早期胚胎細胞一、合子和早期胚胎細胞 精卵結合產(chǎn)生的合子合子是真正意義上的胚性細胞。許多植物的早期胚胎細胞可以通過裂生多胚（cleavage polyembryony）方式產(chǎn)生兩個以上的胚，說明它們是一群胚性細胞或者胚胎干細胞。裂生多胚現(xiàn)象普遍存在于裸子植物中，例如松屬（Pinus)。被子植物中裂生多胚現(xiàn)象比較少見。在美洲鹿百合（Erythronium americanum）植物中曾觀察到裂生多胚，它們是從原胚頂部的細胞增生形成的。二、頂端分生組織中的干細胞（胚性細胞）及其基因調控二、頂端分生組織中的干細胞（胚性細胞）及其基因調控

6、原套和原體的中央部分統(tǒng)稱為中央?yún)^(qū)（central zone），由一團有絲分裂活動不旺盛的胚性細胞（干細胞）組成。 WUS基因定位在擬南芥染色體II上?；蚩寺『蜏y序的結果表明，它編碼一個有291個氨基酸組成的同源異型蛋白(homeodomain protein)。WUS基因是干細胞促進途徑(stem cell-promoting pathway)中的重要調控成分(Brand et al., 2000; 許云遠，2002) 最近的研究表明，在化學誘導下WUS的超量表達或者35S啟動子驅動下的組成型表達可以使轉基因擬南芥的根或其他部位的體細胞分化出胚狀體（Zuo et al., 2002）,說明該

7、基因在植物細胞全能性的保持與表達上起重要的作用。 三、植物成熟物器官中遺留的胚性細胞三、植物成熟物器官中遺留的胚性細胞1.被子植物胚囊中的細胞 助細胞 巖白菜助細胞胚 反足細胞 （Bergonia delavayi）2.珠被和珠心細胞 芒果的珠心胚原始細胞 3.營養(yǎng)體中的薄壁細胞 表皮細胞 葉肉細胞 根莖組織中的薄壁細胞 石龍芮表皮產(chǎn)生的胚狀體 (Ranunculus sceleratus) 4. 花粉細胞 小孢子等分裂營養(yǎng)細胞分裂小麥培養(yǎng)花藥中的花粉胚（E）（三）從分化細胞到胚性細胞 在離體培養(yǎng)的條件下，一個分化的細胞轉變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)成胚性細胞團或愈傷組織的現(xiàn)象稱做脫分化（dedifferen

8、tiation）。一個巳分化細胞若要表現(xiàn)其全能性，形成完整植株，首先要經(jīng)歷脫分化過程，然后經(jīng)歷再分化(redifferentiation)過程。在大多數(shù)情況下，再分化過程是在愈傷組織細胞中發(fā)生的，但在有些情況下，再分化可以直接發(fā)生于脫分化的細胞中，無須經(jīng)歷愈傷組織階段。組織培養(yǎng)研究的結果已經(jīng)揭示，分化細胞的脫分化需要兩個條件：創(chuàng)傷或/和外源激素。 一、脫分化第一次分裂及其基因表達 在自然條件下分化細胞通常停止細胞分裂，執(zhí)行特定的代謝功能，直至死亡。在離體培養(yǎng)條件下，靜止的分化細胞脫分化的第一個也是最重要的步驟就是啟動第一次細胞分裂，分化細胞一旦開始分裂，就可以連續(xù)分裂形成分生狀態(tài)的細胞群體。如

9、果能夠揭露啟動脫分化第一次細胞分裂時基因表達的細節(jié)，找出細胞脫分化的相關基因，我們就能了解細胞脫分化過程的本質。 煙草柵欄細胞完成脫分化第一次分裂，形成二細胞結構煙草柵欄細胞分裂過程煙草海綿細胞分裂過程 對于連續(xù)分裂的細胞的細胞周期的分子調控機理，特別是如何從細胞周期的靜止階段G0期轉向分裂的第一階段G1期的調控機理近年來已經(jīng)取得重要進展。20世紀后期，美國科學家L.H.Hartwell與英國科學家R.T.Hunt 和P.M.Nurse發(fā)現(xiàn)，所有真核有機體，包括酵母、植物、動物和人類的細胞中存在著調節(jié)細胞周期的關鍵分子，并通過細胞周期鐘模型解釋了細胞周期的控制機理，從而獲得了2001年度諾貝爾

10、生理學及醫(yī)學獎。這一發(fā)現(xiàn)將對細胞生物學的發(fā)展產(chǎn)生重大影響，不僅有助于解釋正常的靜止細胞何以會轉向無序的分裂而形成癌癥，也為解釋分化的細胞如何啟動分裂和脫分化過程奠定了基礎。 1970-71年Hartwell利用酵母的細胞周期行為異常的突變體，成功地分離了100多個與參與細胞周期調控的基因，即所謂CDC（cell division cycle）基因。這些基因中的一個被稱為CDC28，它能夠控制細胞周期的第一階段G1期進行。70年代中期，在裂褶釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)了CDC2基因。他證明CDC2基因G2期和分裂期的進行起調控作用。1987年Hunt發(fā)現(xiàn)了一類識別蛋白,叫做細胞周期蛋白（cyclin），已經(jīng)

11、發(fā)現(xiàn)的有10余種。Cyclin在每次細胞周期中周期性的形成和降解。與此同時Nurse又在人類細胞中發(fā)現(xiàn)了一個編碼細胞周期蛋白依賴性激酶CDK（cyclin dependent kinase）的基因CDK1。某種特定的cyclin與CDK分子結合，能夠引導CDK使一種特定的與細胞分裂相關的靶蛋白磷酸化，保證細胞分裂正常運轉。已經(jīng)知道細胞中CDK和cyclin含量的提高與癌細胞的分裂有關，推測CDC、CDK基因和cyclin基因的話化與表達也與植物分化細胞脫分化第一次分裂的啟動有關。 最近Boucheron 等（2002）將一種細胞周期基因CDC2a的啟動子與GUS連接，構建質粒轉化煙草，利用GU

12、S染色反應研究轉基因煙草髓組織培養(yǎng)物中CDC2a的表達，發(fā)現(xiàn)它只在啟動有絲分裂的細胞中表達，說明CDC基因家族參與調控成熟細胞的脫分化過程。然而對于調控脫分化過程的基因現(xiàn)在還了解得很少，有待開展系統(tǒng)的研究。揭示啟動脫分化過程的相關基因及其表達將有助于了解克隆的機理和癌癥的起因，是生命科學的前沿領域。二、脫分化過程中細胞結構的變化二、脫分化過程中細胞結構的變化 植物體內(nèi)最大量的分化細胞是成熟的薄壁細胞，例如葉肉細胞、表皮細胞、內(nèi)皮層和髓部的薄壁細胞等，它們的細胞核的體積較小，位于細胞邊緣，細胞中央有一個大的液泡，細胞質內(nèi)核糖體密度較低，多聚核糖體數(shù)目很少，質體為分化程度較高的葉綠體、雜色體、白色

13、體或淀粉體。 在離體培養(yǎng)條件下煙草的葉肉細胞從第一次分裂開始即進入脫分化的過程。通過數(shù)次有絲分裂，逐步轉變?yōu)榉稚毎梭w積變大，占據(jù)中央位置，大液泡逐漸消失，液泡中出現(xiàn)一種與細胞質生長相關的蛋白體 ，葉綠體通過縊裂和出芽生殖轉變?yōu)樵|體。 柵欄細胞P1和P2已經(jīng)經(jīng)歷數(shù)次分裂,形成多細胞構造, 示細胞的超微結構變化煙草脫分化細胞中的蛋白體（PB）和新生的細胞質團葉綠體(CH)通過出芽生殖形成原質體芽(PB， Proplastid Bud)，后者脫落后即變成原質體。在原質體芽中可以觀察到質體的DNA區(qū)。 培養(yǎng)72小時后，來源于一個柵欄細胞的分生細胞團培養(yǎng)72小時后，來源于柵欄細胞的分生細胞的超微

14、結構三、分生細胞的再分化三、分生細胞的再分化1、體細胞胚胎發(fā)生 的基因表達（Zhang et al., 2002) 玉米“A188” N6 +脯氨酸 II型愈傷組織 體胚發(fā)生的 不同階段 地高辛標記的kn1 的反義mRNA探針進行原位雜交表明，在愈傷組織階段沒有kn1的轉錄，在球形胚狀體中kn1的轉錄僅限于苗分生組織原(iSTM)部位的5-10個細胞中(圖 a), 在具盾片的胚狀體中kn1的轉錄定位于早期的苗分生組織(eSTM) (圖 b)。在成熟胚狀體中kn1的轉錄發(fā)生在苗分生組織中，但是在子葉中沒有表達（圖 b）。 ZmLEC1的表達出現(xiàn)得更早，在胚性愈傷組織的某些部位就可以觀察到，在球形

15、胚狀體中它的表達十分強烈，然后隨著胚狀體長大而逐漸減弱。這種表達模式和進程與在擬南芥合子胚發(fā)育中觀察到的LEC1的表達情況非常相似?？梢哉J為，kn1和 ZmLEC1基因，特別是ZmLEC1 基因，與離體胚狀體的發(fā)生有密切的關系。2. 器官分化器官分化煙草的薄層表皮培養(yǎng)時，花枝的薄層表皮只能產(chǎn)生花芽，植株基部的薄層細胞只能產(chǎn)生營養(yǎng)芽，中間部分的外植體能產(chǎn)生兩種類型的芽，但其間的比例會有不同，這取決于它們與植株基部距離的遠近?；ㄑ康姆只€受外源激素組成的影響，只有當培養(yǎng)基中所含的激動素和IAA的克分子濃度皆為10-6mol/L時，花枝的表皮才能形成花芽。若不改變IAA濃度，把激動素濃度提高到10-5moI/L，則會完全抑制花芽的形成，而只出現(xiàn)營養(yǎng)芽。器官分化的基因表達尚有待研究。 綜上所述，100年來對于植物細胞全能性的研究經(jīng)歷了理論假設，組織培養(yǎng)實驗證明，細胞生物學觀測和分子生物學機理探討等發(fā)展階段。這方面的實驗研究使得上千種的植物的細胞可以在人工培養(yǎng)條件下發(fā)育為器官、胚胎和植株，從而為細胞工程研究