活化蛋白1在膳食?；撬岱雷o(hù)視網(wǎng)膜光損傷中的表達(dá)變化

1、活化蛋白-1在膳食?；撬岱雷o(hù)視網(wǎng)膜光損傷中的表達(dá)變化【摘要】 探討膳食牛磺酸防護(hù)視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷的分子機(jī)制。方法 30只Sprague-Dawley大鼠飼以AIN-93標(biāo)準(zhǔn)飼料或補(bǔ)充4?；撬嵘攀掣深A(yù)15 d，給予（3 000±200）lux的持續(xù)光照24 h，形態(tài)測量法觀察視網(wǎng)膜外核層厚度，電生理法檢測視網(wǎng)膜功能，Western blot或免疫組織化學(xué)法檢測活化蛋白-1（actor protein-1，AP-1）亞單位c-fos/c-jun蛋白表達(dá)，熒光定量PCR法檢測其mRNA表達(dá)。結(jié)果 光照能降低視網(wǎng)膜外核層厚度，降低視網(wǎng)膜電圖a波和b波的幅度，升高AP-1蛋白和mRNA的表達(dá)，

2、4%膳食?；撬嵩谵D(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)AP-1的表達(dá)，有效防護(hù)視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷。結(jié)論 轉(zhuǎn)錄因子AP-1在膳食?；撬岱雷o(hù)視網(wǎng)膜光損傷中發(fā)揮著重要作用。 【關(guān)鍵詞】 活化蛋白-1 ?；撬?視網(wǎng)膜 光損傷 Abstract：Objective To investigate the underlying molecular mechanism involving in dietary taurine protecting retina from photochemical damage.Methods Thirty Sprague-Dawley rats fed with or without 4% ta

3、urine under AIN-93 diet for 15 d were persistently exposed to fluorescent light(3000±200 lux) for 0-24h.The thickness of outer nuclear layer(ONL)of retinas was measured with morphometry.The retinal function was detected with electrophysiological technique.The expression of actor protein-1(AP-1)

4、subunits c-fos/c-jun protein was analyzed with Western blot or immunohistochemical method,and their mRNA expression determined with quantitative real-time PCR(qRT-PCR).Results There was a decrease in thickness of ONL, and in amplitude of a- and b- waves of electroretinogram,an increase in protein an

5、d mRNA expression of c-fos/c-jun subunits in retinas of rats exposed to light.4% dietary taurine effectively prevented retinal photochemical damage as changes of morphology and electroretinogram(ERG).Also,the supplementation caused a down-regulation in expression of c-fos/c-jun subunits.Conclusions

6、Transcription factor AP-1 plays a pivotal role in dietary taurine protecting retina from photochemical damage. Key words:actor protein-1;taurine;retina;light damage 視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷是視網(wǎng)膜光損傷最主要的一種形式，其早期病理表現(xiàn)為視網(wǎng)膜功能減退，視網(wǎng)膜內(nèi)外節(jié)段排列紊亂甚至斷裂消失，感光細(xì)胞變性丟失，外核層（Outer nuclear layer，ONL）厚度變薄，后期病理表現(xiàn)為視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡性壞死，視覺功能嚴(yán)重受損甚至失明1。針

7、對視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷的各致傷環(huán)節(jié)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)鈣通道阻滯劑、地塞米松、天然抗氧化劑、自由基清除劑，以及神經(jīng)營養(yǎng)因子等對光化學(xué)損傷有一定的保護(hù)作用，然而這種防護(hù)作用的效果并不理想2。?；撬幔═aurine）是體內(nèi)一種游離的條件必需氨基酸，在視網(wǎng)膜尤其是感光細(xì)胞和Muller細(xì)胞內(nèi)含量極為豐富，在視網(wǎng)膜生長發(fā)育、維持正常視功能等方面發(fā)揮著重要的作用。作者以往研究發(fā)現(xiàn)?；撬嶙鳛閺?qiáng)抗氧化劑，能降低視網(wǎng)膜光損傷中的丙二醛含量，同時(shí)升高超氧化物歧化酶、谷胱苷肽還原酶的活性，阻止視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的凋亡，但這種抗凋亡效應(yīng)的分子機(jī)制還不清楚3,4，有研究顯示視網(wǎng)膜光損傷中轉(zhuǎn)錄因子AP-1的表達(dá)上調(diào)5。本研究以Sprag

8、ue-Dawley大鼠光化學(xué)損傷為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停^察AP-1亞單位c-fos/c-jun在膳食?；撬岱雷o(hù)視網(wǎng)膜光損傷中的表達(dá)變化，以探討?；撬岱雷o(hù)視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷的具體分子機(jī)制。 1 材料和方法 1.1 主要試劑和儀器 牛磺酸購于北京世紀(jì)維他生物技術(shù)有限公司；GENMED蛋白質(zhì)西方雜交印跡試劑盒（Cat.GMS30005.2）購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；兔抗大鼠c-fos、c-jun單克隆抗體、SP 試劑盒羊抗兔IgG(SP9001)、DAB試劑盒購于中杉生物制品有限公司；SYD-I型多功能光照控制箱和SYD-型暗適應(yīng)箱：本研究組與西南師范大學(xué)物理學(xué)院聯(lián)合研制；光學(xué)顯微鏡：Olympus B

9、X51型，日本；視覺電生理刺激儀：AVES8000型，國產(chǎn)；電轉(zhuǎn)移裝置：Bio-rad公司，美國；核酸蛋白檢測儀：Eppendorf公司，美國凝膠成像系統(tǒng)：DC290，美國。 1.2 動(dòng)物及分組 30只清潔級Spregue-Dawley大鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院動(dòng)物中心提供，體重（150±20）g，雌雄不拘。隨機(jī)分為以下三組，每組10只：正常對照組 飼以AIN-93標(biāo)準(zhǔn)飼料；光照組 飼以AIN-93標(biāo)準(zhǔn)飼料，（3 000±200）lux持續(xù)光照24 h；?；撬峤M AIN-93標(biāo)準(zhǔn)飼料中添加4?；撬?5 d后，（3 000±200）lux持續(xù)光照24 h。實(shí)驗(yàn)動(dòng)

10、物經(jīng)處理后，檢測視網(wǎng)膜電圖（ERG），乙醚麻醉斷頭處死，一只眼用于測量外核層厚度，另一只眼用于檢測AP-1亞單位c-fos/c-jun蛋白或mRNA表達(dá)。 1.3 視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)觀察 參照文獻(xiàn)6。去除眼球外周結(jié)締組織，在眼球三點(diǎn)鐘位置留下少量結(jié)締組織并保留視神經(jīng)以標(biāo)記眼球方位。10的中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，經(jīng)視神經(jīng)矢狀縱切眼球，作5 m厚切片，選取視神經(jīng)乳頭（Optic nerve head，ONH）旁顳側(cè)組織行蘇木精伊紅染色后，光鏡下觀察視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)變化，并采用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)測定各組視網(wǎng)膜外核層厚度。 1.4 視網(wǎng)膜電圖檢測 大鼠經(jīng)暗適應(yīng)24 h后， AVES-8000型視覺

11、電生理刺激儀記錄暗適應(yīng)視網(wǎng)膜電圖（ERG）。甲基纖維素角膜表面麻醉，速眠新注射液腹腔內(nèi)注射（1.0 ml/Kg體重）麻醉，托吡胩胺散瞳20 min.記錄電極為環(huán)形金電極，置于大鼠眼角膜緣；參考電極和接地電極為不銹鋼針，分別置于記錄眼同側(cè)內(nèi)眥部以及額正中皮下。采用單次閃光刺激，刺激光強(qiáng)為2.00 cd·s·m-2，疊加5次，每次間隔2 min，通頻帶為1300 Hz，記錄ERG的a波、b波振幅以及潛伏時(shí)間。 1.5 免疫組織化學(xué)法檢測c-fos蛋白表達(dá) 按照免疫組化染色試劑盒說明書進(jìn)行。石蠟切片梯度酒精脫蠟水化，3H2O2孵育510 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，

12、0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液微波修復(fù)抗原20 min，正常血清封閉液10 min，兔抗大鼠c-fos單克隆抗體以1100稀釋（陰性對照用PBS代替），37 2 h，PBS漂洗3 min×3，生物素標(biāo)記二抗工作液，37 10 min，PBS漂洗3 min×3，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 10min，PBS漂洗3 min×3，最后3，3二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色510 min，封片并照相。 1.6 Western blot檢測c-jun蛋白表達(dá) 按照蛋白質(zhì)西方雜交印跡試劑盒說明書進(jìn)行。常規(guī)方法提取視網(wǎng)膜總蛋白，經(jīng)Lowry法定量后，取40 g總蛋白進(jìn)行

13、凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至聚偏(二)氟乙烯膜上，1%牛血清白蛋白封閉，1400 c-jun單抗4過夜，140生物素化二抗工作液室溫振搖1 h，140稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素三抗工作液室溫振搖1 h，DAB顯色，Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)掃描各條帶的灰度值。 1.7 熒光定量PCR法檢測c-fos/c-jun mRNA表達(dá) 采用TRIZol試劑盒提取各組視網(wǎng)膜總RNA，取4l RNA模板做逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Primer Express software 2.0 (PE Biosystems)軟件設(shè)計(jì)c-fos/c-jun寡核苷酸引物和TaqMan探針。內(nèi)參-actin：正義鏈 5'-GC

14、G CGG CTA CAG CTT CA-3'，反義鏈5'-TCT CCT TAA TGT CAC GCA CGA T-3'，探針序列5'- FAM-CAC CAC GGC CGA GCG GGA-TAMRA -3'；c-fos：正義鏈5'- GGA GGT CTG CCT GAG GCT TC -3'，反義鏈5'- CAC GTT GCT GAT GCT CTT GAC -3'，探針序列5'-FAM- CAA CGA CCC TGA GCC CAA GCC AT -TAMRA-3'c-jun：正義鏈5&#

15、39;- GAC GGA CCG TTC TAT GAC TGC -3'，反義鏈5'- GGA GGA ACG AGG CGT TGA -3'，探針序列5'-FAM- TGG AAA CGA CCT TCT ACG ACG ATG CC -TAMRA-3'。所有引物由上海生工公司合成。利用ABI Prism 7000 TaqMan 實(shí)時(shí)熒光熱循環(huán)儀(PerkinElmer Life Sciences)檢測c-fos/c-jun的mRNA表達(dá)量。熱循環(huán)參數(shù)：93 2min, 93 1min,55 1min，70 30s，40個(gè)循環(huán)。c-fos/c-jun

16、mRNA的相對表達(dá)量為與-actin的拷貝數(shù)之比。 1.8 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)用Stat-Light軟件（Yukmus Co.,Tokyo, Japan）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果用±s表示。三組間視網(wǎng)膜電圖和ONL厚度先用單因素方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)其差異性，然后采用Ryan's 法進(jìn)行多組間比較。光照組和牛磺酸處理組間c-fos/c-jun mRNA和蛋白的表達(dá)量用Student's t檢驗(yàn)。所有顯著性水平設(shè)定為P0.05. 2 結(jié)果 2.1 外核層厚度（圖1） 對照組、光照組和?；撬峤M視網(wǎng)膜外核層的平均厚度分別為（33.5±8.3）,（18.8±

17、;6.7）和（29.6±7.4）m.光照導(dǎo)致視網(wǎng)膜厚度在對照組減少了47.1%，在?；撬峤M減少了16.7%，且視網(wǎng)膜厚度在牛磺酸組與光照組間有顯著性差異（P0.05），而?；撬峤M與對照組相比無顯著差異（P0.05）。 2.2 視網(wǎng)膜功能（表1） 視網(wǎng)膜經(jīng)光照后，a波和b波的波型不典型，波幅降低，甚至熄滅，潛伏期延長。而?；撬岣深A(yù)組具有典型的a波和b波，與光照組相比，a波、b波幅值增加（P=0.016），潛伏期減少（P=0.015）；與對照組相比，除a波幅值降低外（P=0.03），其它指標(biāo)無顯著性差異（P=0.41）。表1 膳食?；撬岣纳乒庹找暰W(wǎng)膜功能 2.3 c-fos表達(dá)（圖2）

18、免疫組化結(jié)果顯示，對照組視網(wǎng)膜c-fos抗體染色在內(nèi)核層（INL）有散在陽性細(xì)胞分布，ONL偶見陽性細(xì)胞；光照組INL中陽性細(xì)胞染色加深，而ONL中陽性細(xì)胞在光照早期隨光照時(shí)間增多，后期未觀察到陽性細(xì)胞；?；撬峤M光照后INL陽性細(xì)胞也增多，而ONL陽性細(xì)胞較少（圖2A）。qRT-PCR結(jié)果顯示，c-fos mRNA的表達(dá)在對照組較低，在光照1h呈應(yīng)激性增高（P=0.017），?；撬峤M在光照1h c-fos mRNA表達(dá)也顯著低于光照組（P0.01）（圖2B），該結(jié)果與免疫組化結(jié)果相符，提示?；撬崮茉谵D(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)c-fos表達(dá)。 2.4 c-jun表達(dá)（圖3） Western blot結(jié)果

19、顯示，光照組視網(wǎng)膜c-Jun蛋白表達(dá)，與對照組相比，6 h開始增高，9 h達(dá)到高峰，其后表達(dá)量仍然維持較高水平，?；撬峤Mc-Jun蛋白表達(dá)在9、12、24 h蛋白表達(dá)相對量低于對照組（0.05）；且在整個(gè)光照期間都低于光照組(P0.05)（圖3A）。視網(wǎng)膜c-jun mRNA表達(dá)在光照3 h開始增高，6 h達(dá)到高峰，12 h仍然有較高表達(dá)，而在?；撬峤M光照6 h后顯著低于光照組的相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)（0.05）（圖3B）。 3 討論 作者前階段研究證實(shí)，膳食補(bǔ)充?；撬崮芡ㄟ^其抗氧化作用而有效防護(hù)視網(wǎng)膜的光化學(xué)損傷3,4。本研究發(fā)現(xiàn)，牛磺酸能阻止光照過程中視網(wǎng)膜外核層厚度的降低（圖1），改善視網(wǎng)膜電圖（表

20、1），提示通過膳食干預(yù)的途徑，添加?；撬崮鼙Ｗo(hù)光感受細(xì)胞的丟失或潰變，從而維護(hù)視網(wǎng)膜功能的完整性。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)?；撬嵩谝暰W(wǎng)膜發(fā)育、以及維持視網(wǎng)膜功能和結(jié)構(gòu)的完整性方面發(fā)揮著重要作用7。 視網(wǎng)膜光照后，感光細(xì)胞丟失原因存在一定的爭議。作者以前研究以及其他諸多研究者均證實(shí)，凋亡是光化學(xué)損傷以及其他視網(wǎng)膜變性疾病光感受圖3 ?；撬峤档凸庹照T導(dǎo)c-jun表達(dá)器細(xì)胞丟失的主要機(jī)制4,8。近年研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子AP-1亞單位c-fos/c-jun是參與光化學(xué)應(yīng)激誘導(dǎo)感光細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子。AP-1 通過調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄參與機(jī)體內(nèi)病生過程，脂多糖、氧化應(yīng)激、紫外線等均能誘導(dǎo)其活性增加9。c-fos基

21、因敲出大鼠（c-fos-/-）經(jīng)光照后，視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞幾乎未丟失，而野生型大鼠、小鼠和661W光感受器細(xì)胞在光照后其c-fos表達(dá)也呈現(xiàn)應(yīng)急性增高，這些研究結(jié)果顯示c-fos 在光誘導(dǎo)光感受器細(xì)胞凋亡中有促凋亡作用10。但AP-1的表達(dá)在牛磺酸防護(hù)視網(wǎng)膜光損傷中是否發(fā)生改變，尚未得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)光照可引起視網(wǎng)膜c-fos/c-jun mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)，膳食?；撬峥稍谵D(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)c-fos/c-jun表達(dá)（圖2，圖3）?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們進(jìn)一步推論出?；撬峥蓽p少AP-1復(fù)合物的形成，阻斷了光照誘導(dǎo)的光感受細(xì)胞的凋亡信號途徑，但其中涉及的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明?！緟⒖嘉墨I(xiàn)

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