高效液相色譜儀使用中常見問題及解決方法

1、高效液相色譜儀使用中常見問題及解決方法黃加龍高效液相色譜(High Performance Liquid Chro-matography,HPLC是近30年發(fā)展起來的一種具有高靈敏度、高選擇性的高效快速分離、分析技術(shù)。它既能用于微量組分的分析測(cè)定,又能用于大量的制備分離,靈活多樣,應(yīng)用范圍已超過其它各種分離方法。高效液相色譜儀在使用過程中常會(huì)出現(xiàn)一些影響分析結(jié)果的問題,如果使用人員了解常見問題及其成因和相關(guān)解決方法,就能做到勤維護(hù)早預(yù)防,使分析結(jié)果保持較好的穩(wěn)定性與較高的精確性。1高效液相色譜儀系統(tǒng)液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進(jìn)樣器、柱子、柱溫箱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成(見圖1。對(duì)于整個(gè)系統(tǒng)

2、而言,柱子、泵和檢測(cè)器是核心部件,同時(shí)也是易出問題的主要部位。2常見問題及解決方法高效液相色譜儀作為一種高精密儀器,如果在使用過程中操作不當(dāng)?shù)脑?就容易導(dǎo)致一些問題,其中最常見的就是柱壓?jiǎn)栴}、漂移問題、峰形異常問題。2.1柱壓?jiǎn)栴}柱壓?jiǎn)栴}是使用高效液相色譜過程中需要密切注意的地方,柱壓的穩(wěn)定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時(shí)間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩(wěn)定并不是指壓力值穩(wěn)定于一個(gè)恒定值,而是指壓力波動(dòng)范圍在345kPa以內(nèi)(在使用梯度洗脫時(shí),柱壓平穩(wěn)、緩慢的變化是允許的。壓力過高、過低都屬于柱壓?jiǎn)栴}。這是高效液相色譜儀在使用中最常見的問題,指的是壓力突然升高,一般都是由于流路中有堵塞的情況。

3、此時(shí),我們應(yīng)該分段進(jìn)行檢查。首先斷開真空泵的入口處,此時(shí)PEEK管里充滿液體,使PEEK管低于溶劑瓶,看液體是否自由滴下,如果液體不滴或緩慢滴下,則是溶劑過濾頭堵塞。處理方法:用30%的硝酸浸泡0.5h,在用超純水沖洗干凈。如果液體自由滴下,溶劑過濾頭正常,再檢查。打開Purge閥,使流動(dòng)相不經(jīng)過柱子,如果壓力沒有明顯下降,則是過濾頭堵塞。處理方法:將過濾頭取出,用10%的異丙醇超聲30min。如果壓力降至690kPa以下,過濾頭正常,再檢查。把色譜柱出口端取下,如果壓力不下降,則是柱子堵塞。處理方法:如果是緩沖鹽堵塞,則用95%的水沖至壓力正常;如果是一些強(qiáng)保留的物質(zhì)導(dǎo)致堵塞,則要用比現(xiàn)在流

4、動(dòng)相更強(qiáng)的流動(dòng)相沖至壓力正常。假如按上面的方法長(zhǎng)時(shí)間沖洗壓力都不下降,則可考慮將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上,用流動(dòng)相沖洗柱子。這時(shí),如果柱壓仍不下降,只有換柱子入口篩板,但一旦操作不慎,很容易造成柱效下降,所以盡量少用。壓力過低的現(xiàn)象一般是由于系統(tǒng)泄漏,處理方法:尋找各個(gè)接口處,特別是色譜柱兩端的接口,把泄漏的地方旋緊即可。當(dāng)然還有一個(gè)原因就是泵里進(jìn)了空氣,但此時(shí)表現(xiàn)的往往是壓力不穩(wěn),忽高忽低,更嚴(yán)重一點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致泵無法吸進(jìn)液體。處理方法:打開Purge 閥,用35ml/min的流速?zèng)_洗,如果不行,則要用專用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。2.2漂移問題主要包括基線漂移和保留時(shí)間漂移。一般說來

5、,機(jī)器剛啟動(dòng)時(shí),基線容易漂移,大概要黃加龍,江西中醫(yī)學(xué)院研究生部,330004,江西南昌。收稿日期:2006-05-15飼料工業(yè)2006年第27卷第15期檢測(cè)技 術(shù)30min的平衡時(shí)間,如果用了緩沖溶液或緩沖鹽,還有就是在低波長(zhǎng)下(220nm平衡時(shí)間相對(duì)會(huì)比較長(zhǎng),但如果在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)基線漂移,則要考慮下面的原因(見表1。保留時(shí)間重現(xiàn)是液相性能好壞的一個(gè)重要標(biāo)志,同一種東西,兩次的保留時(shí)間相差不要超過15s,超過了30s可看做保留時(shí)間漂移,就無法進(jìn)行定性,要考慮以下原因(見表2。2.3峰形異常問題表1基線漂移的原因及解決方法原因柱溫波動(dòng)流通池被污染或有氣體紫外燈能量不足流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品

6、質(zhì)溶劑配成樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)(高K'值以饅頭峰樣被洗脫出,從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線檢測(cè)器沒有設(shè)定在最大吸收波長(zhǎng)處流動(dòng)相的pH值沒有調(diào)節(jié)好解決方法控制好柱子和流動(dòng)相的溫度,檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對(duì)著柱溫箱用甲醇或其它強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池(最好斷開柱子,如有需要,可以用1mol/l的硝酸(不要用鹽酸沖洗更換新的紫外燈檢查流動(dòng)相的組成,使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級(jí)的溶劑使用保護(hù)柱,如有必要,在進(jìn)樣之前;在分析過程中,定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子將波長(zhǎng)調(diào)整至最大吸收波長(zhǎng)加適量的酸或堿調(diào)至最佳pH值表3峰形異常情況的分析及部分解決方法出現(xiàn)情況色譜圖中未出峰一個(gè)峰或幾個(gè)峰是負(fù)峰所有峰均為負(fù)峰

7、所有峰均為寬峰所出峰比預(yù)想的小出現(xiàn)雙峰或肩峰前伸峰拖尾峰出現(xiàn)平頭峰出現(xiàn)鬼峰問題分析及部分解決方法系統(tǒng)未進(jìn)樣或樣品分解;泵未輸液或流動(dòng)相使用不正確;檢測(cè)器設(shè)置不正確。針對(duì)以上情況成因作相應(yīng)調(diào)整即可流動(dòng)相吸收本底值高;進(jìn)樣過程中進(jìn)入空氣;樣品組分的吸收低于流動(dòng)相信號(hào)電纜接反或檢測(cè)器輸出極性設(shè)置顛倒;光學(xué)裝置尚未達(dá)到平衡系統(tǒng)未達(dá)到平衡;溶解樣品的溶劑極性比流動(dòng)相差很多;色譜柱尺寸及類型選擇不正確;色譜柱或保護(hù)柱被污染或柱效降低;溫度變化造成的影響樣品黏度過大;進(jìn)樣故障或進(jìn)樣體積誤差;檢測(cè)器設(shè)置不正確;定量環(huán)體積不正確;檢測(cè)池污染;檢測(cè)器燈出現(xiàn)問題進(jìn)樣量過大;樣品濃度過高;保護(hù)柱或色譜柱柱頭堵塞;保護(hù)

8、柱或色譜柱污染或失效;柱塌陷或形成短通道進(jìn)樣量大或樣品濃度高;溶解樣品的溶劑較流動(dòng)相極性強(qiáng);保護(hù)柱或色譜柱污染或失效柱超載,降低樣品量;增加柱直徑采用較高容量的固定相;峰干擾,對(duì)樣品進(jìn)行清潔過濾;調(diào)整流動(dòng)相;硅羥基作用,加入三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相pH 值;柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效,更換燒結(jié)不銹鋼;加在線過濾器,對(duì)樣品進(jìn)行過濾;使體積或柱外體積過大,將連接點(diǎn)降至最低;盡可能使用內(nèi)徑較細(xì)的連接管;柱效下降,更換柱子;采用保護(hù)柱,對(duì)柱子進(jìn)行再生檢測(cè)器設(shè)置不正確;進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高進(jìn)樣閥有殘余,在每次進(jìn)完樣后用充足的時(shí)間來平衡和清洗系統(tǒng);樣品中存在未知物,改進(jìn)樣品的預(yù)處理

9、;流動(dòng)相污染,更換新流動(dòng)相,盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用,隔夜的流動(dòng)相再次使用時(shí)要過濾;盡可能使用HPLC級(jí)試劑;流路中有小的氣泡,打開Purge閥,加大流速排除峰形問題是液相的主要問題,在做液相過程中,我們就是要變換不同的條件來改善不好的峰形,對(duì)于各種各樣的異常峰,要區(qū)別對(duì)待,從主要問題出發(fā),逐一加以解決(見表3。3結(jié)語以上只是對(duì)液相色譜常見的問題進(jìn)行了分析,當(dāng)然在實(shí)際應(yīng)用中還會(huì)遇到更多的問題,在排除故障時(shí)要遵守以下原則:一次只改變一個(gè)因素,確定假定因素與問題之間的聯(lián)系;如果通過更換組件來排查故障時(shí)要注意將拆下的完好組件裝回原位,避免浪費(fèi);養(yǎng)成良好的記錄習(xí)慣,這是成功進(jìn)行故障排除的關(guān)鍵。總之,在使用高效液相色譜儀時(shí)一定要注意樣品的前處理與儀器的正確操作和保養(yǎng)。黃加龍